蝗蟲(chóng)腸道纖維素降解菌的篩選及復(fù)合菌系的構(gòu)建

金裕華，康 薇，鄭 進(jìn)，胡長(zhǎng)洪，鄒 濤*

(湖北理工學(xué)院 a.化學(xué)與化工學(xué)院，b.礦區(qū)環(huán)境污染控制與修復(fù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃石 435003)

秸稈資源豐富，但大多尚未得到充分有效的利用。其主要成分是纖維素[1]，因而纖維素降解是秸稈利用的關(guān)鍵。目前，一般采用物理、化學(xué)和生物法處理秸稈，其中利用微生物降解纖維素具有成本低、綠色無(wú)污染、高效等優(yōu)點(diǎn)[2]。微生物對(duì)纖維素的降解主要是通過(guò)向胞外分泌纖維素酶來(lái)催化降解纖維素。細(xì)菌分泌的纖維素酶大多是胞內(nèi)酶，真菌分泌的纖維素酶大多是胞外酶。真菌、放線菌的纖維素酶分泌能力普遍高于細(xì)菌，但細(xì)菌繁殖快[3]。目前，微生物降解纖維素的關(guān)鍵在于篩選高效纖維素降解菌。食性昆蟲(chóng)后腸是纖維素降解菌篩選的良好來(lái)源。本文從東亞飛蝗后腸中篩選出高效降解纖維素菌株，采用形態(tài)學(xué)對(duì)篩選的高效菌株進(jìn)行初步鑒定，并將幾株高效菌進(jìn)行復(fù)配，構(gòu)建纖維素降解復(fù)合菌系，通過(guò)纖維素降解率和產(chǎn)酶能力反映各復(fù)配體系纖維素降解效果，旨在為麥秸稈還田提供菌株材料和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣品

供試?yán)ハx(chóng)：東亞飛蝗成蟲(chóng)，2019年4月購(gòu)于淘寶，實(shí)驗(yàn)前斷食1 d，排除腸道食物殘?jiān)?/p>

1.1.2培養(yǎng)基

液體富集培養(yǎng)基[4]：選擇羧甲基纖維素鈉作為唯一碳源，10 g/L CMC—Na，0.001 g/L FeSO4·7H2O，1.0 g/L K2HPO4，0.5 g/L MgSO4·7H2O，0.5 g/L KCl，0.5 g/L NaNO3，0.02 g/L硫酸鏈霉素，pH=7.2。

CMC—Na培養(yǎng)基[5]：5 g/L CMC—Na，0.5 g/L MgSO4，1 g/L K2HPO4，0.5 g/L KCl，12 g/L瓊脂，其自然pH=5.5～6.0。

纖維素剛果紅培養(yǎng)基參考文獻(xiàn)[6]配制，濾紙分解培養(yǎng)基和秸稈分解培養(yǎng)基參考文獻(xiàn)[3]配制，真菌培養(yǎng)基(馬丁式培養(yǎng)基)、LB培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基參考《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》(周德慶、徐德強(qiáng)主編，3版，高等教育出版社)配制。

1.2 方法

1.2.1纖維素降解菌的初篩

參考文獻(xiàn)[7]中的方法解剖蝗蟲(chóng)。將蝗蟲(chóng)浸于70%的酒精中滅菌7～8 min使其死亡，移至超凈工作臺(tái)中已滅菌的培養(yǎng)皿里，剪去足與翅，用剪刀從背部肛門(mén)剪至胸部，用解剖針和鑷子取出消化道，將其置于事先滅菌的研缽中研磨。加入10 mL無(wú)菌水制成菌懸液，再取1 mL菌懸液按10倍濃度梯度依次稀釋至10-7。分別取稀釋100，1 000，10 000，100 000，1 000 000，10 000 000倍的菌懸液各0.2 mL于CMC—Na培養(yǎng)基平板上涂布均勻，靜置30 min，倒置于30 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。將CMC—Na培養(yǎng)基平板上長(zhǎng)勢(shì)良好的單菌落接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃，120 r/min 搖床富集培養(yǎng) 7 d。對(duì)富集后的菌株進(jìn)行劃線、傳代、純化，對(duì)純化后的菌株進(jìn)行編號(hào)和保藏。

1.2.2纖維素降解菌的復(fù)篩

對(duì)CMC—Na分解能力的測(cè)定：挑取純化后的細(xì)菌和放線菌單菌落在纖維素剛果紅培養(yǎng)基上點(diǎn)樣，于30 ℃避光培養(yǎng)15 d，觀察各菌株透明圈的大小。

對(duì)濾紙分解能力的測(cè)定：將純化后的細(xì)菌和放線菌進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，取5 mL菌懸液到濾紙分解培養(yǎng)基中，30 ℃，120 r/min搖床培養(yǎng)7 d，以濾紙的斷裂程度評(píng)價(jià)菌株對(duì)纖維素的降解效果。

1.2.3復(fù)合菌系的構(gòu)建及對(duì)小麥秸稈降解能力的測(cè)定

引入一株真菌(該真菌為研究小組之前竹林表土中篩選所得，還未鑒定)與蝗蟲(chóng)腸道中篩選出的纖維素降解能力較強(qiáng)的放線菌和細(xì)菌構(gòu)建高效纖維素降解菌的復(fù)合菌系。將復(fù)合菌系和濾紙崩解實(shí)驗(yàn)得到纖維素降解能力較強(qiáng)的菌株分別接入到以小麥秸稈為唯一碳源的培養(yǎng)基中，37 ℃，120 r/min搖床培養(yǎng)，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。10 d和20 d后，分別取秸稈，測(cè)量秸稈的降解率，并測(cè)定秸稈紅外光譜吸收?qǐng)D。取出發(fā)酵7 d的未降解秸稈，烘干計(jì)算，測(cè)定菌株的實(shí)際降解能力；另于4，7，10，13，16，19 d后，分別去發(fā)酵液，測(cè)定濾紙纖維素酶活性和漆酶活性。

1.2.4菌株鑒定

利用瑞氏姬薩姆染色鑒定菌株形態(tài)，經(jīng)顯微鏡(1 000×)觀察。采用16SrDNA的PCR產(chǎn)物測(cè)序的方法進(jìn)行分子鑒定。

1.2.5酶活的測(cè)定

纖維素全酶活測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[8]，ABTS法測(cè)定漆酶酶活參考文獻(xiàn)[9]。

1.2.6紅外測(cè)定

為了解小麥秸稈的降解機(jī)理，采用PerkinElmer Spectrum Two紅外光譜分析菌株和復(fù)合菌株處理10 d和20 d的小麥秸稈。用小型粉碎機(jī)將秸稈打碎后過(guò)200目篩，取少量樣品粉末放入研缽中，加入溴化鉀研磨均勻后壓片，在PerkinElmer Spectrum Two紅外光譜儀上進(jìn)行觀察，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次，吸收波長(zhǎng)范圍為450～4 000 cm-1。

1.2.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，單因素方差分析(One-Way ANOVA)，Duncan檢驗(yàn)，P<0.05，利用Origin 8.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選分離

以羧甲基纖維素鈉為唯一碳源進(jìn)行初篩，獲得細(xì)菌6株，放線菌1株，再通過(guò)剛果紅培養(yǎng)基和濾紙分解培養(yǎng)復(fù)篩。菌株剛果紅水解圈效果如圖1所示，培養(yǎng)7 d菌株對(duì)濾紙的降解效果如圖2所示。發(fā)現(xiàn)1號(hào)菌和4號(hào)菌有明顯的水解圈，且其濾紙分解培養(yǎng)基中的大部分濾紙轉(zhuǎn)化為小碎片，說(shuō)明這2株菌對(duì)纖維素和木質(zhì)素都有顯著降解作用，其表達(dá)的各種酶的協(xié)同作用較強(qiáng)。

(a) 1號(hào)菌 (b) 4號(hào)菌

(a) 1號(hào)菌 (b) 4號(hào)菌

2.2 高效降解纖維素菌株的鑒定

2.2.1菌落形態(tài)分析

菌株瑞氏姬薩姆染色效果(1 000×) 如圖3所示，菌落形態(tài)特征如圖4所示。1號(hào)菌菌落中間灰色，外圍白色，表面呈粉狀，初步鑒定為鏈霉菌，是革蘭氏陽(yáng)性菌。4號(hào)菌為桿狀，菌落粘稠不易斷裂，在培養(yǎng)基上呈地衣?tīng)?，初步鑒定為黃桿菌，是革蘭氏陰性菌。

(a) 1號(hào)菌 (b) 4號(hào)菌

(a) 1號(hào)菌 (b) 4號(hào)菌

2.2.216SrDNA基因分析

對(duì)1號(hào)菌、4號(hào)菌的16SrDNA的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，與公共數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI進(jìn)行DNA序列同源性比較，并對(duì)其同源序列用MEGA6軟件構(gòu)建菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。1號(hào)菌和親緣菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖5所示，4號(hào)菌和親緣菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖6所示。

圖5 1號(hào)菌和親緣菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

圖6 4號(hào)菌和親緣菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

BLAST比對(duì)結(jié)果表明菌株1與Streptomycesgriseus有99%同源性，4號(hào)菌與Flavobacteriumjohnsoniae有99%同源性。結(jié)合微觀形態(tài)和菌落形態(tài)初步鑒定1號(hào)菌為鏈霉菌屬灰色鏈霉菌，4號(hào)菌為黃桿菌屬短黃桿菌。

2.3 復(fù)合菌株對(duì)小麥秸稈的降解能力

通過(guò)濾紙崩解實(shí)驗(yàn)及水解圈實(shí)驗(yàn)，綜合考慮，選擇纖維素降解效果好的放線菌1號(hào)菌和細(xì)菌4號(hào)菌，引入真菌7號(hào)菌構(gòu)建高效纖維素降解復(fù)合菌系。分別對(duì)1，4，7號(hào)和復(fù)合菌系進(jìn)行小麥秸稈發(fā)酵，驗(yàn)證復(fù)合菌系纖維素降解能力。不同菌系對(duì)小麥秸稈的降解率如圖7所示。

圖7 不同菌系對(duì)小麥秸稈的降解率

由圖7可知，1號(hào)菌的降解率為22%，4號(hào)菌的降解率為17%，復(fù)合菌的降解率高達(dá)35%。這說(shuō)明復(fù)合菌體系中3株菌對(duì)秸稈分解起協(xié)同增效作用，此復(fù)合菌體系的構(gòu)建具有一定的應(yīng)用研究?jī)r(jià)值。

3 復(fù)合菌系降解小麥秸稈的機(jī)理

3.1 小麥秸稈降解過(guò)程中的FTIR圖譜分析

1號(hào)菌降解小麥秸稈的FTIR圖譜如圖8所示，不同菌系降解小麥秸稈20 d后的FTIR圖譜如圖9所示。

圖8 1號(hào)菌降解小麥秸稈的FTIR圖譜

圖9 不同菌降解小麥秸稈20 d后的FTIR圖譜

綜合來(lái)說(shuō)，小麥秸稈發(fā)酵時(shí)，4號(hào)菌和復(fù)合菌對(duì)纖維素的降解作用較好，對(duì)木質(zhì)素的分解效果甚微；1號(hào)菌和7號(hào)菌對(duì)纖維素、木質(zhì)素分解能力要比4號(hào)菌和復(fù)合菌系的好，且對(duì)木質(zhì)素的降解效果尤為顯著。小麥秸稈降解過(guò)程中，發(fā)生主要結(jié)構(gòu)變化的是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，具體為纖維素被分解后，蠟質(zhì)層表面逐漸脫落，木質(zhì)素的苯環(huán)結(jié)構(gòu)得以裸露，苯環(huán)在纖維素降解菌的作用下裂解，使木質(zhì)素進(jìn)一步降解。

3.2 小麥秸稈降解過(guò)程中酶活性變化

纖維素酶活和漆酶酶活隨時(shí)間的變化曲線分別如圖10、圖11所示。由圖10可知，4種菌發(fā)酵處理的纖維素酶活在第4～19 d內(nèi)的變化趨勢(shì)類(lèi)似，基本呈下降趨勢(shì)，且變化不明顯，說(shuō)明纖維素降解啟動(dòng)較早，在4 d左右降解最活躍。此外，可發(fā)現(xiàn)1號(hào)菌發(fā)酵7 d后纖維素酶活性顯著高于其他處理；7號(hào)菌從13 d開(kāi)始上升趨勢(shì)明顯，19 d時(shí)纖維素酶活性顯著高于其他處理。

圖10 纖維素酶活隨時(shí)間的變化曲線

圖11 漆酶酶活隨時(shí)間的變化曲線

由圖11可知，漆酶活性隨時(shí)間的變化趨勢(shì)各不相同，其中1號(hào)菌、4號(hào)菌和復(fù)合菌在第4 d時(shí)漆酶酶活與7號(hào)相比較高，且很快下降。7 d后，1號(hào)菌、7號(hào)菌和復(fù)合菌的漆酶活性明顯上升，而4號(hào)菌無(wú)明顯的上升趨勢(shì)。7號(hào)菌的漆酶酶活一直呈上升趨勢(shì)，且到第16 d超過(guò)1號(hào)菌的漆酶酶活，復(fù)合菌的漆酶活性在7 d后基本和7號(hào)菌持平，說(shuō)明小麥秸稈木質(zhì)素的降解活動(dòng)主要在16 d左右最活躍。

4 結(jié)論

從蝗蟲(chóng)腸道中篩選出高效纖維素降解菌，并構(gòu)建高效纖維素降解復(fù)合菌系，復(fù)合菌對(duì)小麥秸稈的降解率最高可達(dá)35%。小麥秸稈降解過(guò)程中，各菌株先產(chǎn)生水解酶分解纖維素和半纖維素，此時(shí)纖維素酶活較高，當(dāng)漆酶酶活逐漸升高時(shí)，秸稈蠟質(zhì)層表面逐漸脫落，木質(zhì)素的苯環(huán)結(jié)構(gòu)得以裸露，苯環(huán)在纖維素降解菌的作用下裂解，使木質(zhì)素進(jìn)一步降解。