抗瘧疾藥物研究進(jìn)展

王婧婷，關(guān)洪鑫，張丹丹，歐陽松應(yīng)

(1.福建師范大學(xué)南方生物醫(yī)學(xué)研究中心，福建 福州 350117； 2.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350117)

瘧疾是一種病媒傳播的熱帶寄生蟲疾病，它以雌性按蚊為主要傳播媒介，在已發(fā)現(xiàn)的400多種按蚊中，有30種可以傳播瘧疾[1]．瘧疾的傳播強(qiáng)度主要取決于瘧原蟲、病媒媒介、人類宿主和環(huán)境等相關(guān)因素，瘧疾的傳播還依賴于按蚊的數(shù)量以及季節(jié)因素[2]．

目前，有5種不同的瘧原蟲可以引起人類感染瘧疾：間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、惡性瘧原蟲、卵形瘧原蟲和諾氏瘧原蟲，其中惡性瘧原蟲的致死率最高，間日瘧原蟲是環(huán)境中分布最為廣泛的瘧原蟲，且間日瘧原蟲和卵形瘧原蟲都會產(chǎn)生休眠體，導(dǎo)致患者在被治愈后的數(shù)月至數(shù)年中復(fù)發(fā)瘧疾[2]．現(xiàn)階段，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)推薦的惡性瘧原蟲治療方案為小分子青蒿素聯(lián)合療法(artemisinin-combination therapies，ACTs)[3]，但隨著惡性瘧原蟲對青蒿素衍生物出現(xiàn)耐藥性問題，青蒿素聯(lián)合療法的效果會被逐漸削弱．由于瘧原蟲的生命周期復(fù)雜，傳統(tǒng)藥物大部分只針對瘧原蟲的無性期血液階段，這使得其他階段的瘧原蟲仍然具有一定危險(xiǎn)性．因此，迫切需要找到具有特異性靶點(diǎn)的新型小分子候選藥物補(bǔ)充目前的抗瘧疾藥物庫．最近一些文獻(xiàn)報(bào)道了多種新型小分子候選藥物，這些小分子可以靶向的消滅不同生命時期的瘧原蟲．本文將回顧過去傳統(tǒng)臨床治療中使用的抗瘧疾藥物，并著重總結(jié)近幾年來在新型抗瘧疾藥物開發(fā)方面取得的進(jìn)展．

1 瘧原蟲的生命周期

瘧原蟲的生命周期按宿主的不同主要分為兩個大的階段：蚊蟲宿主階段及人類宿主階段．在蚊蟲宿主階段時，瘧原蟲的雄配子細(xì)胞存在于按蚊的中腸內(nèi)腔中[4]，雄、雌配子結(jié)合形成受精卵(也稱合子)，而后轉(zhuǎn)變?yōu)槁涯讣?xì)胞(也稱動合子)并穿過腸壁形成一個卵囊．卵囊釋放出子孢子，向著雌性按蚊的唾液腺移動．當(dāng)雌性按蚊叮咬人類時，其唾液腺內(nèi)的子孢子隨之進(jìn)入人類體內(nèi)，瘧原蟲的發(fā)展進(jìn)入人類宿主階段[5]．

當(dāng)子孢子隨著按蚊叮咬進(jìn)入人類體內(nèi)，首先感染肝臟．子孢子到達(dá)肝臟后，進(jìn)入肝臟的入口細(xì)胞—庫普費(fèi)爾氏細(xì)胞并不斷感染或殺死其它細(xì)胞[6]．被感染的細(xì)胞進(jìn)行無性繁殖產(chǎn)生大量的裂殖子被釋放到血液后，瘧原蟲開始入侵紅細(xì)胞，進(jìn)入紅細(xì)胞內(nèi)的發(fā)育時期(簡稱紅內(nèi)期)．瘧原蟲在紅內(nèi)期經(jīng)多次無性繁殖，依次經(jīng)過環(huán)期、滋養(yǎng)體期和裂殖體期[7]．在每個周期，都有大約10%的瘧原蟲開始發(fā)育成寄生蟲的有性形態(tài)[8]．瘧原蟲的性發(fā)育發(fā)生在裂殖體內(nèi)，瘧原蟲形成性環(huán)，而后形成配子體．經(jīng)過10-12天的發(fā)育[6]，成熟的雄、雌配子細(xì)胞在人類宿主被蚊蟲叮咬后傳入蚊蟲體內(nèi)，并在蚊蟲體內(nèi)經(jīng)歷其蚊蟲階段的生命周期(如圖1所示)．了解瘧原蟲的生命周期，對針對其不同階段設(shè)計(jì)靶向藥物至關(guān)重要．

圖1 瘧原蟲的生命周期及藥物作用時期Fig.1 Life cycle of plasmodium and period of drug action

2 臨床使用中的傳統(tǒng)抗瘧疾藥物

2.1 喹啉類藥物

喹啉類藥物主要包括奎寧、氯喹和伯氨喹．奎寧(如表1所示)屬于4-甲氧基喹啉類衍生物，它對紅細(xì)胞內(nèi)期的瘧原蟲具有清除作用，對間日瘧原蟲的配子細(xì)胞也有殺傷效果．奎寧通過與α-1酸性糖蛋白結(jié)合發(fā)揮功能，α-1酸性糖蛋白在瘧原蟲血紅素聚集解毒的過程中發(fā)揮重要作用，奎寧與之結(jié)合后瘧原蟲不再能聚集血紅素，導(dǎo)致蟲體毒素累積過多而死亡[9]．1910年首次報(bào)道了瘧原蟲對奎寧的耐藥性[10]，雖然瘧原蟲對奎寧的耐藥性較低，藥物會保留一些活性，但在人體內(nèi)容易出現(xiàn)藥效延遲以及藥效減弱的現(xiàn)象，這對奎寧的繼續(xù)使用提出了挑戰(zhàn)．

氯喹(如表1所示)是在奎寧基礎(chǔ)上改造合成的一種抗瘧疾藥物[11]．氯喹可以快速高效的殺死瘧原蟲紅細(xì)胞內(nèi)期的裂殖體[12]，其對于間日瘧原蟲的消滅效果最優(yōu)．然而，惡性瘧原蟲對于氯喹的耐藥性已經(jīng)廣泛的出現(xiàn)在世界各地[13]．氯喹耐藥性產(chǎn)生的原因是由于氯喹抗性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Plasmodiumfalciparumchloroquine resistance transporter，PfCRT)的第76位賴氨酸突變?yōu)樘K氨酸所導(dǎo)致．在被感染的細(xì)胞內(nèi)，瘧原蟲的消化液泡中會產(chǎn)生大量有毒的鐵原卟啉Ⅸ片段，這些有毒片段通過與其受體結(jié)合形成惰性瘧原蟲色素來消除有毒片段對蟲體的影響[14]，但當(dāng)有氯喹存在時，氯喹通過PfCRT輸送進(jìn)入瘧原蟲消化液泡與鐵原卟啉Ⅸ片段結(jié)合，使解毒過程被抑制．當(dāng)PfCRT突變后，氯喹不能大量進(jìn)入瘧原蟲的消化液泡，消除了氯喹對蟲體的威脅，氯喹耐藥性由此而來．

伯氨喹(如表1所示)是一種8-氨基喹啉類化合物，是目前臨床使用中唯一可以有效殺死間日瘧原蟲和卵形瘧原蟲休眠體的抗瘧疾藥物[15]．伯氨喹對惡性瘧原蟲的成熟配子體和肝臟期所有階段的瘧原蟲均有殺傷效果，但其對無性時期的瘧原蟲作用有限[16]．然而，在臨床使用中伯氨喹的副作用在正常受試者中會導(dǎo)致少量紅細(xì)胞丟失，并引起葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD)缺乏的患者發(fā)生嚴(yán)重的溶血現(xiàn)象[17]，這使伯氨喹的使用受到限制．

喹啉類藥物的耐藥性問題日益嚴(yán)峻，除了上述的原因外，多藥耐藥1基因(Plasmodiumfalciparummultidrugresistance1，pfmdr1)的表達(dá)水平也與喹啉類藥物的耐藥性有關(guān)[18]，pfmdr1編碼的P-糖蛋白同源物1(P-glycoprotein homologue 1，Pgh1)是一種ABC外排泵，與腫瘤細(xì)胞中存在的多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)蛋白同源[19]．據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Pgh1會使喹啉類藥物被隔離在瘧原蟲的空泡室中，從而減弱藥物對瘧原蟲的影響，在此基礎(chǔ)上，Pgh1與突變的PfCRT結(jié)合，可能導(dǎo)致更加復(fù)雜的耐藥模式出現(xiàn)[20]．

2.2 乙胺嘧啶類藥物

乙胺嘧啶(如表1所示)，屬于嘧啶類衍生物，它可以減少瘧原蟲子孢子的增殖，也可以抑制按蚊體內(nèi)配子體的發(fā)育，減少瘧原蟲從按蚊到人類的傳播[21]．乙胺嘧啶可以靶向抑制二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)的活性．DHFR是葉酸生物合成途徑中的關(guān)鍵酶[22]．近年來，乙胺嘧啶多與磺胺多辛(一種阻礙二氫葉酸合成酶(dihydropteroate synthase，DHPS)功能的葉酸合成抑制劑[23])聯(lián)合用藥．然而，在引入聯(lián)合治療后不久，這兩種酶都發(fā)生了關(guān)鍵位點(diǎn)的突變導(dǎo)致蟲體耐藥性問題的出現(xiàn)．研究表明，DHFR中S108N突變引起瘧原蟲對乙胺嘧啶的耐藥，而DHPS中A437G和K540E的突變則導(dǎo)致蟲體對磺胺多辛的耐藥[24]．目前，在瘧疾流行的國家，攜帶DHFR和DHPS突變的間日瘧原蟲廣泛存在，這也使得乙胺嘧啶類藥物的使用效果大受影響．

2.3 萘醌類藥物

阿托伐醌(如表1所示)，是一種親脂性萘醌[25]，它是目前臨床使用中唯一針對瘧原蟲線粒體細(xì)胞色素b(cytochrome b，Cytb)的藥物[26]．Cytb作為細(xì)胞色素bc1復(fù)合體的一部分，對維持電子傳遞鏈的功能至關(guān)重要．在瘧原蟲中，細(xì)胞色素bc1復(fù)合體通過修飾Q循環(huán)中泛素酮的氧化還原將氫離子轉(zhuǎn)運(yùn)到膜間空間，在這個過程中二氫乳酸脫氫酶(dihydroorotate dehydrogenase，DHODH)起到催化嘧啶生物合成的作用[27]．當(dāng)阿托伐醌抑制Cytb后，導(dǎo)致電子傳遞鏈不能繼續(xù)進(jìn)行，DHODH無法發(fā)揮功能，瘧原蟲無法從宿主體內(nèi)吸收嘧啶而在生長過程中自身的嘧啶被消耗殆盡，最終導(dǎo)致蟲體死亡[28]．目前關(guān)于阿托伐醌耐藥性的研究表明，Cytb中Y268S或Y268C的突變是導(dǎo)致耐藥性出現(xiàn)的主要原因[29]．

2.4 青蒿素類藥物

青蒿素(如表1所示)，是一類倍半萜內(nèi)酯過氧化物，其分子內(nèi)部存在特殊的過氧橋基團(tuán)[30]．青蒿素類藥物通過在體內(nèi)代謝后產(chǎn)生的活性物質(zhì)二氫青蒿素(dihydroartemisinin
Tablets，DHA)來發(fā)揮功能(如表1所示)[31]．青蒿素的激活首先需要血紅素?cái)嗔哑浞肿觾?nèi)部的過氧化物橋，裂解產(chǎn)生大量的氧自由基，這些氧自由基重新排列形成伯碳或仲碳中心的自由基，然后將瘧原蟲糖酵解過程、血紅蛋白降解過程、抗氧化防御和蛋白質(zhì)合成途徑中的重要蛋白質(zhì)烷基化[31]，最終導(dǎo)致瘧原蟲死亡．這是一種非?？焖俸陀行У姆磻?yīng)，在單個紅細(xì)胞增殖周期中，青蒿素衍生物殺滅的瘧原蟲數(shù)量是普通抗瘧疾藥物的10 000倍[32]．常見的青蒿素衍生物有二氫青蒿素和青蒿琥酯(artesunate，ASA)(如表1所示)，盡管二氫青蒿素能高效殺滅瘧原蟲，但是它的藥物單體在人體中半衰期很短[33]，在單藥治療中不能清除大部分的瘧原蟲，從而導(dǎo)致瘧疾復(fù)發(fā)．青蒿琥酯在對惡性瘧原蟲的治療中也出現(xiàn)了藥物血液循環(huán)時間短的缺陷[34]．以青蒿素為基礎(chǔ)的聯(lián)合療法(ACTs)是目前抗瘧疾治療中的金標(biāo)準(zhǔn)．在ACT療法中青蒿素衍生物通常與甲氟喹、苯甲醚和阿莫地喹聯(lián)用．即使目前ACT療法解決了大部分單一用藥帶來的缺陷，但關(guān)于青蒿素類藥物的耐藥性報(bào)道還是屢屢出現(xiàn)，在通過體外篩選抗青蒿素類藥物的瘧原蟲時，研究小組發(fā)現(xiàn)瘧原蟲Kelch13蛋白(PlasmodiumfalciparumKelch 13，PfK13) 可能與青蒿素耐藥性有關(guān)[35]．PfK13在瘧原蟲的生活周期中必不可少[36]，攜帶PfK13突變的環(huán)期瘧原蟲能抵抗二氫青蒿素帶來的藥物風(fēng)暴[37]．近期，PfK13突變體在青蒿素耐藥性問題中的作用被證明：攜帶PfK13突變的瘧原蟲會減少血紅素的攝入，從而導(dǎo)致青蒿素及其衍生物不能被血紅素激活，進(jìn)而導(dǎo)致青蒿素耐藥性問題的出現(xiàn)[38]．

表1 臨床使用中的傳統(tǒng)抗瘧疾藥物Tab.1 Traditional antimalarial drugs in clinical use

因此目前迫切的需要新的抗瘧疾藥物來提供新的治療思路，以支持目前的ACT療法．

3 抗瘧疾新藥的研發(fā)

目前對于新藥的開發(fā)，最理想的狀態(tài)是針對新的作用靶點(diǎn)開發(fā)出可以殺滅現(xiàn)今出現(xiàn)的耐藥性瘧原蟲的新藥．但在以往主要傾向于兩種策略：一種是通過化學(xué)修飾的手段，修飾已經(jīng)在臨床中使用的藥物，以克服耐藥性問題或改善其藥理學(xué)活性；另一種是針對傳統(tǒng)的藥物靶點(diǎn)，來篩選新的可以與藥物靶點(diǎn)的其他作用位點(diǎn)結(jié)合的新藥，但目前這兩種策略篩選出的藥物在臨床使用中容易出現(xiàn)耐藥性問題[39]，這就需要新的策略來篩選出新的藥物解決瘧原蟲的耐藥性問題．現(xiàn)階段除了以上的兩種傳統(tǒng)策略，全細(xì)胞篩選法是篩選具有新作用模式新藥的首選方案．下面將從抗瘧疾新藥物研發(fā)的不同策略出發(fā)，總結(jié)近些年來被研發(fā)出的新型抗瘧疾藥物．

3.1 基于全細(xì)胞篩選方法獲得的藥物

藥物的全細(xì)胞篩選，是在活細(xì)胞中對化合物的作用進(jìn)行檢測和評估，進(jìn)而篩選出藥物．與其他方法相比，全細(xì)胞篩選的明顯優(yōu)勢在于：在活體生理環(huán)境中，藥物的篩選效率更高、準(zhǔn)確性更強(qiáng)．在過去的幾年中，通過全細(xì)胞高通量篩選出來的小分子超過300萬個，其中包括數(shù)千種有效的惡性瘧原蟲生長抑制劑[40]．下面將著重總結(jié)一些具有代表性的全細(xì)胞篩選的抗瘧疾候選藥物．

3.1.1 TCAMS

葛蘭素史克公司針對3D7株惡性瘧原蟲進(jìn)行了全細(xì)胞篩選，并對篩選得到的候選藥物進(jìn)行了大批量的分析和優(yōu)先級排序[41]，稱為TCAMS(Tres Cantos Antimalarial Set)．TCAMS由13 533個單獨(dú)的化合物組成，它們在體外具有抑制惡性瘧原蟲生長的功能[42]，這組化合物大多具有不同的化學(xué)骨架，且大多數(shù)化合物的活性原理還處于未知的狀態(tài)．

TCAMS中第一個被深入研究的化合物是環(huán)丙基甲酰胺[43]，它可以抑制多重耐藥的惡性瘧原蟲生長，并在瘧疾模型小鼠中也具有活性，但在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)甲酰胺會導(dǎo)致惡性瘧原蟲發(fā)生高頻率耐藥現(xiàn)象[44]，這使甲酰胺的研究被迫停止．吲哚類化合物是TCAMS中被著重研究的第二個對象，它的前體化合物TCMDC-139046會與5-羥色胺2型受體((5-hydroxytryptamine 2，5-HT2)是一種經(jīng)典的抗抑郁癥藥物靶點(diǎn))結(jié)合，導(dǎo)致該藥物作用復(fù)雜化，隨后通過化學(xué)修飾的手段將其改造為具有快速殺傷活性且與氯喹耐藥菌株沒有交叉耐藥活性的新藥物[45]．研究人員也在動物體內(nèi)進(jìn)一步證實(shí)了這類化合物的活性，但還需要繼續(xù)優(yōu)化其藥物分子來達(dá)到更好的治療瘧疾的效果．

3.1.2 吲哚酮

NITD609，是一種螺旋體吲哚酮(如表2所示)，由諾華公司進(jìn)行全細(xì)胞篩選時發(fā)現(xiàn)的一種化合物．NITD609對瘧原蟲菌株NF54和抗氯喹瘧原蟲菌株K1表現(xiàn)出明顯的殺滅效力[46]．是目前臨床試驗(yàn)階段中最具有潛力的抗瘧疾藥物之一．研究表明NITD609潛在的藥物靶點(diǎn)是瘧原蟲ATP酶4(PlasmodiumfalciparumATPase 4，PfATP4)[47]，PfATP4是一種定位于惡性瘧原蟲質(zhì)膜上的液泡質(zhì)子泵，用于調(diào)節(jié)瘧原蟲體內(nèi)的鈉離子穩(wěn)態(tài)，當(dāng)PfATP4被抑制時，瘧原蟲體內(nèi)的低鈉環(huán)境被打破，最終會導(dǎo)致蟲體的死亡．PfATP4在瘧原蟲無性時期的全部紅細(xì)胞周期中均有表達(dá)，這使得針對PfATP4的藥物對瘧原蟲作用的有效期將大大增加．

3.1.3 咪唑哌嗪

咪唑哌嗪，也是一類由諾華公司通過全細(xì)胞篩選發(fā)現(xiàn)的抗瘧疾化合物．咪唑哌嗪對惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲的血液期蟲體具有殺傷活性，并能有效的抑制瘧原蟲的肝臟期休眠體[48]．但咪唑哌嗪先導(dǎo)化合物具有強(qiáng)烈的心血管毒副作用[49]，在后期的藥物優(yōu)化中，合成出一種具有低心血管毒副作用且抗瘧活性優(yōu)異的咪唑哌嗪類化合物—GNFI56(如表2所示)，它在體內(nèi)代謝穩(wěn)定，在瘧疾模型小鼠中的藥物活性優(yōu)于氯喹和青蒿琥酯[5]．現(xiàn)階段，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)GNFI56的藥物作用靶點(diǎn)，它作用于一種在瘧原蟲體內(nèi)普遍存在的脂質(zhì)激酶—磷脂酰肌醇-4-激酶(Phosphatidylinositol (4) kinase，PI(4)K)，這種激酶可以通過磷酸化脂質(zhì)來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號的傳導(dǎo)和運(yùn)輸．咪唑哌嗪通過抑制PI(4)K的ATP結(jié)合口袋，來改變PI(4)K在細(xì)胞內(nèi)的分布[50]，從而擾亂瘧原蟲體內(nèi)的信號傳導(dǎo)和運(yùn)輸．目前GNFI56已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段．

3.1.4 氨基吲哚

氨基吲哚，該系列藥物是哈佛醫(yī)學(xué)院研究團(tuán)隊(duì)在布羅德研究所的小分子文庫和ICCB-L化合物庫中發(fā)現(xiàn)的一類可以抑制瘧原蟲生長的化合物[51]．在對氨基吲哚進(jìn)行化學(xué)優(yōu)化后得到了Genz669178這一化合物(如表2所示)．Genz669178對惡性瘧原蟲、柏氏瘧原蟲和間日瘧原蟲有抑制蟲體生長的作用，且對血液期惡性瘧原蟲的抑制作用最強(qiáng)，在為期4天的抑制實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Genz669178對柏氏瘧原蟲的抑制有效性高達(dá)99%[52]．在超過270天的體外耐藥實(shí)驗(yàn)中，Genz669178并沒有引起瘧原蟲對氨基吲哚類藥物的耐藥性[53]，這為氨基吲哚類藥物與其他抗瘧疾藥物配合使用成為可能．但Genz669178的副作用也相當(dāng)明顯，當(dāng)人類服用高劑量的Genz669178時，會引起肥胖并導(dǎo)致網(wǎng)織紅細(xì)胞減少[54]，這就需要盡快的明確氨基吲哚類藥物的作用機(jī)制，進(jìn)一步優(yōu)化其結(jié)構(gòu)．

3.1.5 內(nèi)過氧化物

內(nèi)過氧化物類藥物是目前已知的所有抗瘧疾藥物中，治療效果最快的藥物[55]．盡管內(nèi)過氧化物類藥物的代表—青蒿素類衍生物的抗瘧疾效果優(yōu)異，但目前還是出現(xiàn)了的對青蒿素類衍生物的耐藥性報(bào)道[55]，尋找新的內(nèi)過氧化物類藥物的議題也被提上日程．OZ277是第一代被合成的內(nèi)過氧化物類藥物(如表2所示)[56]．它是一類三惡烷，在體內(nèi)可與惡性瘧原蟲ATP酶6(PlasmodiumfalciparumATPase 6，PfATP6)結(jié)合發(fā)揮功能，在體外對瘧原蟲的生長有抑制作用，但后續(xù)實(shí)驗(yàn)證明OZ277的穩(wěn)定性較差，不能在體內(nèi)發(fā)揮穩(wěn)定的藥效．所以在OZ277的基礎(chǔ)上合成了OZ439(如表2所示)，它為1,2,4-三惡烷，與第一代三惡烷相比，OZ439消除瘧疾的功能更為強(qiáng)大，并且顯示出良好的穩(wěn)定性及安全性，它在印度已經(jīng)被批準(zhǔn)在臨床治療瘧疾中使用[57]．

表2 基于全細(xì)胞篩選方法篩選出的候選藥物Tab.2 Candidates screened by whole cell screening method

3.2 基于藥物作用靶點(diǎn)篩選出的候選藥物

在過去的幾十年中，對經(jīng)典抗瘧疾藥物的研究不斷加深，這些經(jīng)典藥物的作用靶點(diǎn)也被陸續(xù)闡明，促使新藥的研發(fā)可以圍繞這些新發(fā)現(xiàn)的藥物作用靶點(diǎn)來展開，這就是基于已知藥物作用靶點(diǎn)篩選新藥的方法．目前在臨床實(shí)驗(yàn)中的大多數(shù)候選抗瘧疾藥物都是依靠這種方法篩選的[58]，如新篩選出的DHODH、DHFR和Cytb抑制劑，在下一節(jié)中將著重介紹這些利用已知藥物作用靶點(diǎn)篩選出的新型候選藥物．

3.2.1 針對二氫乳酸脫氫酶的抑制劑

二氫乳酸脫氫酶(DHODH)是參與線粒體電子傳遞鏈的酶，它在瘧疾治療中是有效的藥物靶點(diǎn)，因?yàn)樗c同源的哺乳動物二氫乳酸脫氫酶不同[25]，這使得針對瘧原蟲DHODH篩選出的新藥更具靶向性．當(dāng)PfDHODH被抑制時，瘧原蟲線粒體內(nèi)電子流動受阻導(dǎo)致嘧啶合成中斷，最終使蟲體死亡．PfDHODH是少數(shù)幾個經(jīng)過遺傳驗(yàn)證的抗瘧疾藥物靶點(diǎn)[59]，是目前開發(fā)抗瘧疾新藥的重要靶標(biāo)．現(xiàn)階段利用藥物的高通量篩選已經(jīng)鑒定出多種PfDHODH抑制劑，包括三座嘧啶、脲類、雙聯(lián)疊氮以及萘酰亞胺等化合物[60]．其中針對三座嘧啶類衍生物進(jìn)行優(yōu)化，最終獲得了DSM265(如表3所示)[61]．DSM265在人體內(nèi)的療效與氯喹類似，藥代動力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明DSM265具有良好的生物利用度和較長的半衰期，它是首個進(jìn)入人類抗瘧疾臨床試驗(yàn)的PfDHODH抑制劑．后續(xù)在DSM265基礎(chǔ)上利用化學(xué)修飾的手段開發(fā)出了DSM421(如表3所示)，DSM421中的CF3-吡啶基團(tuán)取代了原本DSM265上的CF5-苯胺基團(tuán)，這樣的改變使DSM421與PfDHODH結(jié)合口袋的結(jié)合能力增強(qiáng)[62]，并在體外表現(xiàn)出優(yōu)于DSM265的藥理學(xué)與藥代動力學(xué)活性．目前關(guān)于DSM421的開發(fā)正處于臨床試驗(yàn)階段．

3.2.2 針對細(xì)胞色素Bc1復(fù)合體的抑制劑

瘧原蟲線粒體代謝的一些功能對于蟲體生長以及生存至關(guān)重要，這就使得一些線粒體相關(guān)的蛋白成為了重要的抗瘧疾藥物靶點(diǎn)[63]．細(xì)胞色素Bc1復(fù)合體(cytochrome bc1 complex，cyt bc1)就是其中最有前景的抗瘧疾藥物靶點(diǎn)之一．研究證實(shí)Cyt bc1中的喹啉氧化酶活性位點(diǎn)(Qo)和醌類還原酶活性位點(diǎn)(Qi)均可以被藥物有效抑制[64]．其中，Qo位點(diǎn)是阿托伐醌的藥物作用靶點(diǎn)，近期篩選出了新的與Qi位點(diǎn)結(jié)合的抑制劑—葛蘭素史克公司開發(fā)的兩個4(1H)-吡啶酮衍生物GSK932121和GW844520(如表3所示)[65]，這些研究為Qi位點(diǎn)作為藥物作用靶點(diǎn)提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，也為新藥的研究提供可能．MJM170(如表3所示)是最近發(fā)現(xiàn)的一種新的Cyt bc1抑制劑[66]，對剛地弓形蟲和惡性瘧原蟲的生長都有抑制作用，后續(xù)可以利用化學(xué)修飾的手段使MJM170成為抗瘧疾候選藥物．

3.2.3 針對磷脂酰肌醇激酶的抑制劑

磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol kinases，PIKs)是一類催化磷脂類物質(zhì)磷酸化的酶類，在真核細(xì)胞中主要催化磷脂酰肌醇磷酸化．磷酸化后的磷脂酰肌醇被稱為磷酸肌醇，它參與細(xì)胞膜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及膜動力學(xué)的調(diào)控[67]．在PIKs中，Ⅲ型β亞型磷脂酰肌醇-4-激酶(phosphatidylinositol 4-kinase Ⅲβ，PI4KⅢβ)是非常重要的抗瘧疾藥物靶點(diǎn)，在瘧原蟲內(nèi)部，PI4KⅢβ被抑制會導(dǎo)致磷脂酰肌醇-4-磷酸分布不均，并干擾細(xì)胞分化[50]．利用表型篩選法篩出的藥物咪唑哌嗪后來被證實(shí)其作用靶點(diǎn)就是PI4KⅢβ[50]，后續(xù)利用PI4KⅢβ作為藥物靶點(diǎn)篩選抑制劑的研究也在持續(xù)的進(jìn)行中．

MMV 390048是一種氨基吡啶類化合物(如表3所示)，它是針對瘧原蟲磷脂酰肌醇-4-激酶(Phosphatidylinositol 4-kinase，PI4K)的抑制劑[68]，目前正處于臨床試驗(yàn)階段，這是一種具有化學(xué)預(yù)防潛力的多階段抗瘧疾藥物．CHMFL-PI4K-127(如表3所示)也是一種新發(fā)現(xiàn)的PI4K抑制劑，它具有一個吡啶-磺胺骨架．CHMFL-PI4K-127對于3D7惡性瘧原蟲菌株具有強(qiáng)的抑制活性，而且對于惡性瘧原蟲來源的PI4K具有高度的選擇性，在瘧疾模型動物中也表現(xiàn)出良好的藥代動力學(xué)活性[69]，這為其成為新的抗瘧疾候選藥物提供了良好的基礎(chǔ)．

3.2.4 針對組蛋白去乙?；傅囊种苿?/p>

組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDACs)的功能是去除組蛋白上的賴氨酸ε-N-乙?；?，HDACs是治療人類多種疾病的藥物靶點(diǎn)，包括精神疾病、神經(jīng)退行性疾病以及癌癥[70]．在惡性瘧原蟲中，發(fā)現(xiàn)了兩個與人類HDAC I類和II類蛋白具有同源性的蛋白，分別是惡性瘧原蟲組蛋白去乙?；?(Plasmodiumfalciparumhistone deacetylase 1，PfHDAC1)和惡性瘧原蟲去乙酰化酶2(Plasmodiumfalciparumsilent information regulator 2，PfSir2)(將這兩種蛋白統(tǒng)稱為PfHDACs)[71]．當(dāng)PfHDACs被抑制時，會使瘧原蟲的整體組蛋白發(fā)生乙?；揎椷M(jìn)而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄調(diào)控發(fā)生改變，此外PfHDACs的抑制劑還會使瘧原蟲的染色體發(fā)生變異，基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)論確定了PfHDACs為新的抗瘧疾藥物靶點(diǎn)[72]．在人類HDACs抑制劑的基礎(chǔ)上，開發(fā)出了更有選擇性且藥效更強(qiáng)的化合物2-氨基辛二酸衍生物(如表3所示)，它可以引起惡性瘧原蟲組蛋白的高乙?；瘑栴}，導(dǎo)致有2%～20%的基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生改變[73]．PfHDACs作為新被證明的抗瘧疾靶點(diǎn)，其抑制劑的篩選必然會成為抗瘧疾新藥研發(fā)的新方向，其抑制劑也將在抗瘧疾藥物中占有一席之地．

3.2.5 針對二氫葉酸還原酶的抑制劑

在眾多治療瘧疾的手段中，有一種方法是同時抑制瘧原蟲的葉酸合成和四氫葉酸循環(huán)，這種方法可以非常有效的抑制瘧原蟲生長．二氫葉酸還原酶(DHFR)是葉酸合成途徑中的關(guān)鍵酶．當(dāng)DHFR在體內(nèi)正常存在時，其催化產(chǎn)物5,10-亞甲基四氫葉酸是DNA合成中必須的甲基基團(tuán)供體，將脫氧尿苷單磷酸轉(zhuǎn)化為脫氧尿苷三磷酸，然后被DNA聚合酶用于將胸腺核苷酸添加進(jìn)正在合成的DNA鏈中[74]．針對惡性瘧原蟲DHFR的傳統(tǒng)抑制劑乙胺嘧啶已經(jīng)出現(xiàn)了耐藥性問題，但可喜的是惡性瘧原蟲和人的DHFR與抑制劑的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解析，基于結(jié)構(gòu)信息設(shè)計(jì)了新型小分子P218，并對其進(jìn)行了藥代動力學(xué)研究(如表3所示)[75]，現(xiàn)階段的研究發(fā)現(xiàn)P218可以避免交叉耐藥和DHFR突變所引起的耐藥問題．它有著不同于乙胺嘧啶的抑制機(jī)制，P218在DHFR中有一個新的結(jié)合位點(diǎn)[76]，這個位點(diǎn)會覆蓋住二氫葉酸底物所繪制的包膜，為乙胺嘧啶類藥物產(chǎn)生的耐藥性問題提供了解決機(jī)制．

表3 基于藥物作用靶點(diǎn)篩選出的候選藥物Tab.3 Candidate drugs screened based on drug targets

3.3 新發(fā)現(xiàn)的抗瘧疾藥物作用靶點(diǎn)

在抗瘧疾藥物的篩選過程中，一大部分的候選藥物是針對已知的抗瘧疾藥物作用靶點(diǎn)所設(shè)計(jì)或篩選出的抑制劑，但目前對于抗瘧疾藥物的研究已經(jīng)不滿于此，經(jīng)過試驗(yàn)確定了一些可能具有抗瘧疾作用的新靶點(diǎn)蛋白，希望利用新的靶點(diǎn)篩選出新的候選藥物．下面的章節(jié)將介紹現(xiàn)階段最有希望成為新的抗瘧疾靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)，未來可以作為藥物作用靶點(diǎn)來篩選新的抗瘧疾候選藥物．

3.3.1 惡性瘧原蟲蛋白激酶PfCLK3

激酶是一種關(guān)鍵的調(diào)節(jié)蛋白，它對調(diào)控許多細(xì)胞反應(yīng)至關(guān)重要．惡性瘧原蟲的激酶組大約由90種不同的蛋白質(zhì)組成，其中就包括許多與高等真核生物激酶家族無同源性的成員，這些成員有望成為新的藥物靶點(diǎn)[77]．總共鑒定出大約30%與瘧原蟲生存有關(guān)的激酶[78]．在這些激酶中，惡性瘧原蟲周期依賴性蛋白激酶3(P.falciparumCLK3(cyclin-dependent-like kinase)，PfCLK3)是瘧原蟲周期依賴性蛋白激酶家族(P.falciparumCLK(cyclin-dependent-like kinase)，PfCLKs)中的一員，瘧原蟲CLK家族和人類CLK家族以及富含絲氨酸精氨酸的蛋白激酶家族(serine/arginine-rich protein kinase，SRPK)關(guān)系密切[79]，它們都是剪接因子上參與多重磷酸化過程的重要蛋白．PfCLK3可以磷酸化瘧原蟲富含色氨酸精氨酸的SR蛋白[80]，并在寄生蟲的RNA加工過程中發(fā)揮功能，這就提示PfCLK3蛋白的抑制劑可能在瘧原蟲的全部生命周期中發(fā)揮功能．研究人員對25 000個化合物進(jìn)行篩選，最終找到了TCMDC-135051[81]，在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)TCMDC-135051能快速殺死滋養(yǎng)體期的瘧原蟲，并且能抑制配子細(xì)胞的發(fā)育以及肝臟期瘧原蟲的發(fā)育．體外實(shí)驗(yàn)表明TCMDC-135051能有效抑制惡性瘧原蟲、柏氏瘧原蟲、間日瘧原蟲以及諾氏瘧原蟲的CLK3激酶活性[82]．因此TCMDC-135051有望成為一個新的藥物前體．此外，以PfCLK3作為藥物作用靶點(diǎn)進(jìn)行更大規(guī)模的化合物篩選也許將帶來更加有效的小分子候選藥物．

3.3.2 惡性瘧原蟲己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PfHT1

葡萄糖是紅內(nèi)期瘧原蟲的主要能量來源，由于瘧原蟲體內(nèi)缺乏能量儲存機(jī)制，瘧原蟲幾乎完全依賴糖酵解過程提供能量[83]，所以受感染的紅細(xì)胞比正常紅細(xì)胞要消耗更多的能量．而瘧原蟲在紅細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，也依賴于丙酮酸在瘧原蟲體內(nèi)轉(zhuǎn)換為乳酸而產(chǎn)生的ATP[84]．在宿主體內(nèi)，葡萄糖通過人類葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1(human glucose transporter1，hGLUT1)從血漿中進(jìn)入紅細(xì)胞．而在瘧原蟲中，只有唯一的一種己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(P.falciparumhexose transporter 1，PfHT1)負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞[85]．實(shí)驗(yàn)證實(shí)，hGLUT1只能轉(zhuǎn)運(yùn)D-葡萄糖，而PfHT1則可以非選擇性的同時轉(zhuǎn)運(yùn)D-果糖和D-葡萄糖[86]．因此，利用PfHT1和hGLUT1與底物相互作用的差異，可以設(shè)計(jì)出有針對性的PfHT1抑制劑，而這也提示PfHT1是抗瘧藥物新型潛在靶點(diǎn)．目前，發(fā)現(xiàn)一種新的選擇性抑制劑C3361，通過對比PfHT1和D-葡萄糖復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與PfHT1和C3361復(fù)合物的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，C3361明顯誘導(dǎo)了PfHT1的重排，產(chǎn)生了一個新的口袋結(jié)構(gòu)，這為設(shè)計(jì)特異的選擇性抑制劑提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[87]．在后續(xù)的研究中，該團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)出了TH-PF系列化合物，與C3361相比TH-PF系列的活性及選擇性更高．結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究表明當(dāng)TH-PF系列同時作用于PfHT1和人源葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3(human glucose transporter 3，hGLUT3)時，hGLUT3的構(gòu)象沒有發(fā)生明顯變化且沒有類似于PfHT1的特異性口袋結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，這說明TH-PF系列具有很好的選擇性．蟲體實(shí)驗(yàn)表明，該系列化合物的抑制能力隨著環(huán)境中葡萄糖濃度的降低而增強(qiáng)，且能有效抑制瘧原蟲的糖酵解活性[88]，達(dá)到“餓死”瘧原蟲的效果．這將是一種新的抗瘧疾藥物開發(fā)思路，將為后續(xù)的藥物開發(fā)奠定基礎(chǔ)．

4 展望

在過去的幾十年中，傳統(tǒng)抗瘧疾藥物不斷出現(xiàn)耐藥性報(bào)告，對于傳統(tǒng)藥物的使用療效產(chǎn)生擔(dān)憂，即使是在臨床使用中最為快速有效的青蒿素及其衍生物也引起了瘧原蟲耐藥，這無疑是消除瘧疾路上的一大攔路石，但這也促使科研人員加快了對抗瘧疾候選藥物的研究．早期，通常通過一些表型篩選的方法來篩選鑒定抗瘧疾化合物藥物，隨著基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，科研人員將目光聚焦在發(fā)現(xiàn)新的抗瘧疾藥物靶點(diǎn)上，利用新發(fā)現(xiàn)的靶點(diǎn)有針對性的設(shè)計(jì)和研發(fā)出新的小分子藥物，由此產(chǎn)生的新治療方案也在臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的治療效果．不僅如此，即使這類藥物在使用過程中發(fā)生藥物靶點(diǎn)突變導(dǎo)致瘧原蟲耐藥，也可以快速且有效的設(shè)計(jì)出新的有針對性的藥物來抵抗靶點(diǎn)突變所帶來的耐藥性問題．除此之外，研究人員還可以對一些在瘧原蟲生存中起到關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)進(jìn)行研究，確定新的能夠在瘧原蟲多個生活周期中都有表達(dá)的蛋白質(zhì)作為藥物靶點(diǎn)，這樣篩選并設(shè)計(jì)一些藥物小分子針對不同生活周期的瘧原蟲，從根本上抑制瘧原蟲的傳播和生存，實(shí)現(xiàn)消除瘧疾的最終目標(biāo)．