工程化仿生血小板膜包覆納米顆粒阻斷金黃色葡萄球菌的細(xì)胞毒性并防止致命的全身感染

Jwa-Kyung Kim,Satoshi Uhiyama,Hua Gong,Alexanra Stream,Liangfang Zhang,e,Vitor Nizet,f,

aDivision of Nephrology,Department of Internal Medicine&Kidney Research Institute,Hallym University Sacred Heart Hospital,Anyang 14068,Republic of Korea

bDepartment of Clinical Immunology,Hallym University Sacred Heart Hospital,Anyang 14068,Republic of Korea

cDivision of Host-Microbe Systems and Therapeutics,Department of Pediatrics,University of California San Diego,La Jolla,CA 92093,USA

dDepartment of NanoEngineering,University of California San Diego,La Jolla,CA 92093,USA

eMoores Cancer Center,University of California San Diego Health,La Jolla,CA 92037,USA

fSkaggs School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences,University of California San Diego,La Jolla,CA 92093,USA

金黃色葡萄球菌（S.aureus）是一種常見的人類病原體，它可以引發(fā)嚴(yán)重的侵襲性感染，如菌血癥、敗血癥和心內(nèi)膜炎，具有較高的發(fā)病率和死亡率。然而由于細(xì)菌的抗生素耐藥性增強(qiáng)，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA），加劇了此類細(xì)菌的發(fā)病率和死亡率。金黃色葡萄球菌的發(fā)病機(jī)制是由毒素的分泌推動的，如膜損傷孔α毒素，它有不同的細(xì)胞靶點，包括上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板。本文采用人體血小板膜包覆納米顆粒（PNP）作為一種仿生誘餌策略，來中和金黃色葡萄球菌的毒素，并維持宿主細(xì)胞的防御功能。血小板膜包覆納米顆粒保護(hù)血小板免受由金黃色葡萄球菌毒素帶來的損傷，維持血小板活化和殺菌活性。血小板膜包覆納米顆粒也同樣保護(hù)巨噬細(xì)胞免受由金黃色葡萄球菌毒素帶來的損傷，支持巨噬細(xì)胞進(jìn)行氧化迸發(fā)、產(chǎn)生一氧化氮和維持其殺菌活性，并減少耐甲氧西林金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞胞外殺菌網(wǎng)絡(luò)。在感染系統(tǒng)性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的小鼠模型中，血小板膜包覆納米顆粒制劑減少了血液中的細(xì)菌數(shù)量并防止小鼠發(fā)生死亡。總之，目前的研究結(jié)果證明了血小板膜包覆納米顆粒的治療優(yōu)點，如中和毒素、保護(hù)細(xì)胞和增加宿主對侵襲性金黃色葡萄球菌感染的抵抗力。

納米顆粒

納米海綿

血小板

金黃色葡萄球菌

細(xì)菌毒素

敗血癥

1.引言

血小板大量分布在血液循環(huán)中，它的體積很小，是無細(xì)胞核的細(xì)胞碎片。血小板的主要功能包括凝血和止血，修補(bǔ)破損的血管。然而，新的證據(jù)顯示，血小板在感染性疾病中可以發(fā)揮哨兵作用[1-3]。先天免疫系統(tǒng)對病原體入侵的反應(yīng)明顯受到血小板相互作用的影響，因為血小板可以感知危險信號并對其做出反應(yīng)，并將白細(xì)胞引導(dǎo)至受傷部位、炎癥部位或者病原體入侵部位[4-7]。

血小板在宿主防御機(jī)制中發(fā)揮多重作用[1-2,8-9]。它可以通過釋放包括防御素（defensins）[10]、抗菌肽（cathelicidins）[11]、血栓素（thrombocidins）[12]和趨化因子源性抗菌多肽（kinocidins）[13]在內(nèi)的抗菌多肽（antimicrobial peptides）直接殺滅細(xì)菌。血小板還可以聚集起來捕殺細(xì)菌和阻礙病原體傳播[14]。通過不同的機(jī)制，血小板可以調(diào)節(jié)儲存在細(xì)胞顆粒內(nèi)的各種細(xì)胞內(nèi)介質(zhì)的釋放[3]。這些微?？梢哉T發(fā)炎癥，直接或間接地影響免疫系統(tǒng)效應(yīng)細(xì)胞的募集和活性[15]?？刂蒲“?白細(xì)胞和血小板-細(xì)菌之間相互作用的機(jī)制非常復(fù)雜，這反映了血小板的受體類型也是復(fù)雜多樣的，如補(bǔ)體受體[16]、Fc-γ受體IIa[17]、Toll樣受體[18]、糖蛋白（GP）IIb-IIIa[19]和GPIb[20]?？傊?，血小板不僅僅是凝血劑，它在保持宿主免疫和炎癥反應(yīng)的良好平衡中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

金黃色葡萄球菌（S.aureus），如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA），是一種常見的機(jī)會性感染革蘭氏陽性細(xì)菌病原體。由金黃色葡萄球菌引起的疾病很多，如侵襲性血流感染、敗血癥和心內(nèi)膜炎[21-22]。重度金黃色葡萄球菌感染的癥狀通常表現(xiàn)為明顯的免疫失調(diào)，這在某種程度上是由大量分泌的毒素因子（如α-毒素）引起的。金黃色葡萄球菌毒素可以黏附在宿主細(xì)胞上的同源表面受體上，并通過形成膜孔、破壞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑或激活降解宿主分子的酶來破壞宿主細(xì)胞的完整性和損害宿主細(xì)胞的功能[23-24]。因為金黃色葡萄球菌分泌的毒素是其發(fā)病機(jī)制的重要因素，所以清除或中和毒素已成為一種潛在的、可以提高治療效果的治療方法。在這一方面，靶向抗體或利用納米醫(yī)學(xué)中和毒素的方法引起了公眾關(guān)注[25-27]。其中一種生物醫(yī)學(xué)解毒方法是利用天然細(xì)胞膜包裹的納米顆粒，這種方法引入了仿生設(shè)計理念[28-29]。天然細(xì)胞膜獨特的結(jié)構(gòu)可以讓這些納米顆粒作為誘餌，像海綿一樣非特異性地吸收細(xì)菌膜毒素因子，從而中和這些因子的細(xì)胞溶解活性，而不用考慮它們精確的分子結(jié)構(gòu)[30]。例如，用天然紅細(xì)胞膜包覆聚合物納米顆粒開發(fā)出的紅細(xì)胞（RBC）膜涂層“納米海綿”，可保護(hù)實驗小鼠免受純化α-毒素蛋白的致命侵襲[31]，并且還會減小感染耐甲氧西林金黃色葡萄球菌或A組鏈球菌皮膚疾病的實驗小鼠模型的病灶范圍[32-33]。在大腸桿菌敗血癥的實驗小鼠模型中，巨噬細(xì)胞膜包覆的“納米海綿”結(jié)合細(xì)菌脂多糖（LPS）并與促炎細(xì)胞因子隔離，從而減慢了細(xì)菌傳播的速度并降低了小鼠的死亡率[34]。

經(jīng)過證明，血小板可以幫助宿主抵抗侵襲性金黃色葡萄球菌感染。實驗組小鼠體內(nèi)缺少抗體介導(dǎo)的血小板會損害其清除金黃色葡萄球菌的功能。與正常對照小鼠相比，實驗組小鼠腎臟中的細(xì)菌負(fù)荷更高、細(xì)胞因子反應(yīng)更強(qiáng)烈、存活率低都證明了這一點[35]。另一項研究表明，血小板可以增強(qiáng)腹腔巨噬細(xì)胞對金黃色葡萄球菌的吸收能力和細(xì)胞內(nèi)殺傷機(jī)制，這可能與一種依賴于血小板因子β1-防御素的機(jī)制有關(guān)[8]。血小板是金黃色葡萄球菌α-毒素的重要靶標(biāo)，因為它們在其表面膜上表達(dá)含有解聚素和金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域的蛋白10（ADAM10），即已鑒定的α-毒素受體[36]。在小鼠中，α-毒素介導(dǎo)的血小板受損和聚集會引發(fā)金黃色葡萄球菌敗血癥的肝損傷[37]。

由于血小板在防御金黃色葡萄球菌方面起重要作用，并且是病原體膜毒素的靶點，本文假設(shè)，仿生人體血小板膜或血小板膜包覆納米顆粒（PNP）的生物可降解聚合物納米顆粒核，可以用于強(qiáng)化血小板介導(dǎo)的對病原體的防御。當(dāng)前的研究工作證明了血小板膜包覆納米顆粒在中和細(xì)菌毒素、保護(hù)細(xì)胞，以及增加宿主對侵襲性金黃色葡萄球菌感染的抵抗力方面的治療益處。

2.實驗材料和方法

2.1.血小板膜的衍生

在臨床使用期限到期的24～48 h內(nèi)，從圣地亞哥血庫獲得人類O型陰性（通用血型）富血小板血漿（PRP），該血漿儲存在標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸葡萄糖（ACD）溶液中。在先前研究的基礎(chǔ)上，該富血小板血漿可用于制造全功能血小板膜[38]。將含有50 mmol·L-1乙二胺四乙酸（EDTA；賽默飛世爾科技，美國）和300 μL蛋白酶抑制劑（PI；賽默飛世爾科技，美國）的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）溶液添加到富血小板血漿制劑中以抑制血小板活化。在室溫下以4000 r·min-1的速度離心血小板15 min，然后去除上清液，將沉淀的血小板重新懸浮在PBS+1 mmol·L-1EDTA和蛋白酶抑制劑片劑中。

2.2.血小板“納米海綿”的制備

用等分的（1.2 mL）血小板制劑（約3×109個細(xì)胞）包覆1 mg聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）核。通過三次凍融循環(huán)獲得血小板膜懸浮液：首先將等分試樣在零下80℃下冷凍，接著在室溫下解凍，然后在相對離心力（rcf）為8000的條件下離心7 min以進(jìn)行離心造粒。最后，將它們重新懸浮在水中并通過Pierce BCA蛋白質(zhì)檢測試劑盒（賽默飛世爾科技，美國）進(jìn)行定量。血小板膜包覆納米顆粒由兩個階段獲得：第一步，采用納米沉淀法使用溶解在10 mg·mL-1丙酮中的0.67 dL·g-1羧基封端的50∶50聚乳酸-羥基乙酸共聚物（LACTEL可吸收聚合物）制備直徑約80 nm的聚合物核，然后將溶解的1 mL聚乳酸-羥基乙酸共聚物快速加入3 mL水中，并將混合物攪拌12 h以蒸發(fā)丙酮直至得到濃度為2.5 mg·mL-1的納米顆粒。第二步，將血小板膜制劑與納米顆粒核以1∶1的比例（膜蛋白與聚合物的質(zhì)量）結(jié)合。利用頻率為42 kHz、功率為100 W的超聲波處理5 min，將血小板膜囊泡分散并與聚乳酸-羥基乙酸共聚物粒子融合，以實現(xiàn)膜包覆。

2.3.血小板膜包覆納米顆粒大小分布和包覆分析

當(dāng)膜蛋白與聚合物的質(zhì)量比為1∶1時，得到的顆粒比聚乳酸-羥基乙酸共聚物核略大，聚乳酸-羥基乙酸共聚物表面的zeta電位與血小板膜衍生囊泡的相近，說明膜成功包覆。事實上，包覆層增強(qiáng)了聚乳酸-羥基乙酸共聚物核的膠體穩(wěn)定性，使其在生理鹽水濃度下更容易聚集。本研究采用動態(tài)光散射（Zetasizer Nano ZS ZEN 3600；Malvern Panalytical Ltd.，英國）分析血小板膜包覆納米顆粒，進(jìn)行三次實驗，以確定其大小和一致性。利用透射電子顯微鏡（TEM），將血小板膜包覆納米顆粒放置在400目碳涂層銅網(wǎng)格（Electron Microscopy Sciences，美國）上，用1%醋酸雙氧鈾（EM Sciences，美國）染色，然后用Zeiss Libra 120 PLUS能量過濾式透射電子顯微鏡（EFTEM，德國）觀察。

2.4.菌株和α-毒素

本研究采用了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌菌株USA-300/TCH1516及其同源人類白細(xì)胞抗原（HLA）突變體（Sun BioRxiv，美國）。在37℃下，在Todd-Hewitt液體培養(yǎng)基（THB；賽默飛世爾科技，美國）中繁殖菌株至對數(shù)生長中期[光密度600 nm（OD600）=0.4]，在4000 r·min-1下離心10 min后得到球狀物，接著洗滌一次，然后重新懸浮在磷酸鹽緩沖鹽水中，直至得到所需的稀釋度。將確定的細(xì)菌接種物的稀釋板當(dāng)作菌落形成單位（CFU）。重組α-毒素購自Sigma-Aldrich公司（#H9395；美國）。

2.5.血小板分離

在受試者知情并同意的情況下，通過靜脈采血術(shù)從健康人類供體中收集靜脈血，并用ACD抗凝劑（體積分?jǐn)?shù)為16.67%；Sigma-Aldrich，美國）對血液進(jìn)行抗凝。在離心機(jī)不制動的情況下，以1000 r·min-1的離心速度對血液離心10 min，得到富血小板血漿，然后采用富血小板血漿的前三分之二以避免白細(xì)胞污染。在1500 r·min-1的離心速度下離心10 min，從富血小板血漿中分離出血小板，然后將其重懸于室溫下的無血清Roswell Park Memorial Institute 1640培養(yǎng)基（賽默飛世爾科技，美國）中。

2.6.血小板細(xì)胞毒性測定

選取經(jīng)血小板膜包覆納米顆粒（1 mg·mL-1）或者空白對照預(yù)處理的人體血小板（每孔1×107個），在室溫下放置30 min，然后暴露在耐甲氧西林金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物的3 μL上層清液中1 h。將樣品以500g（g=9.8 m·s-2）加速度離心5 min，使用Promega測定法測定從血小板釋放到培養(yǎng)基中的乳酸脫氫酶（LDH）。

2.7.血小板殺菌能力測定

為了評估分離血小板對細(xì)菌的殺滅作用，首先在室溫下用1.0 mg·mL-1的血小板膜包覆納米顆粒或空白對照對血小板進(jìn)行預(yù)處理30 min，然后經(jīng)10 μL耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染，感染復(fù)數(shù)MOI=0.1（平均每個血小板感染0.1個細(xì)菌），時長為1 h。為了計數(shù)菌落形成單位并計算耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的死亡率，同時與原始接種物進(jìn)行對比，實驗采用Sonic Dismembrator 550（賽默飛世爾科技，美國）對稀釋板進(jìn)行3 s的超聲處理。

2.8.血小板活化測定

在Todd-Hewitt液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)細(xì)菌（溫度為37℃），然后以4000 r·min-1的速度離心分離15 min，得到耐甲氧西林金黃色葡萄球菌上清液。接下來，采用血小板膜包覆納米顆粒或者空白對照對1.25～2.5 μL耐甲氧西林金黃色葡萄球菌上清液進(jìn)行預(yù)混和，然后用其處理1×107個血小板。在37℃下行培養(yǎng)一段時間后，用藻紅蛋白（PE）抗人體CD62p（P-選擇素）抗體（Biolegend，美國）在室溫下對樣本染色20 min，然后用1 mL磷酸鹽緩沖鹽水稀釋。分別采用FACSCalibur流式細(xì)胞術(shù)（BD Biosciences，美國）和FlowJo v10.2軟件（Becton，Dickinson and Company，美國）對P-選擇素的表達(dá)進(jìn)行測量和分析。根據(jù)尺寸大小將人體血小板和血小板膜包覆納米顆粒分離出來，然后用人體血小板進(jìn)行藻紅蛋白的平均熒光分析。

2.9.巨噬細(xì)胞的制備及細(xì)胞存活率測定

在RPMI+10%胎牛血清（FBS）中培養(yǎng)人髓系白血病單核細(xì)胞（THP-1）（American Type Culture Collection，美國）。采用25 nmol·L-1佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA； Sigma-Aldrich，美國）將人髓系白血病單核細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞，然后在RPMI+10%胎牛血清中冷卻24 h。為了測定細(xì)胞毒性，每孔接種5×105個人髓系白血病單核細(xì)胞，并在室溫下用1 mg·mL-1血小板膜包覆納米顆?；蚩瞻讓φ者M(jìn)行30 min的預(yù)處理，然后暴露在耐甲氧西林金黃色葡萄球菌上清液（1.25～10.00 μL）中，時長為1 h，溫度為37℃。采用3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）細(xì)胞增殖檢測試劑盒（ab211091；Abcam plc.，美國）對人髓系白血病單核細(xì)胞及其分化的巨噬細(xì)胞的存活率進(jìn)行測定，通過在590 nm處的吸光度來量化MTT向甲瓚的三磷酸腺苷（ATP）轉(zhuǎn)化。

2.10.巨噬細(xì)胞殺菌能力測定

在人髓系白血病單核細(xì)胞分化的巨噬細(xì)胞殺菌能力測定中，將分化的巨噬細(xì)胞用1 mg·mL-1血小板膜包覆納米顆粒或空白對照處理30 min，然后感染耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，感染復(fù)數(shù)MOI=1.0。采用Triton X-100（0.025%；Sigma-Aldrich，美國）溶解細(xì)胞，并連續(xù)稀釋以便計數(shù)菌落形成單位和計算耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的死亡率，同時與原始接種物進(jìn)行對比。

2.11.巨噬細(xì)胞的氧化迸發(fā)以及一氧化氮生成測定

在氧化迸發(fā)測定中，人髓系白血病單核細(xì)胞分化的巨噬細(xì)胞負(fù)載了25 μmol·L-12,7-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA；賽默飛世爾科技，美國），在不含Ca2+和Mg2+的Hanks平衡鹽溶液中（HBSS；Mediatech，美國），在室溫下旋轉(zhuǎn)30 min。然后用有或沒有血小板膜包覆納米顆粒的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MOI=1.0）感染巨噬細(xì)胞，并在37℃下培育。每隔15～30 min，用Spectra-Max M3（Molecular Devices，美國）對比485 nm激發(fā)/520 nm發(fā)射的熒光強(qiáng)度。為了量化在相同的暴露條件下人髓系白血病單核細(xì)胞分化巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的亞硝酸鹽，實驗采用了符合制造商方案的Greiss試劑（Promega，美國）。

2.12.人類中性粒細(xì)胞胞外殺菌網(wǎng)絡(luò)的染色和量化

從由健康成人供體采集的血液中分離中性粒細(xì)胞，根據(jù)制造商的說明，采用的分離液是PolymorphPrep分離液（Progen Biotechnik GmbH，德國）。接下來，將5×105個中性粒細(xì)胞置于24孔板的孔中，采用空白對照、25 nmol·L-1的佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌或與血小板膜包覆納米顆粒預(yù)混合的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌刺激20 min（MOI=10，平均每個中性粒細(xì)胞感染10個細(xì)菌），并在37℃下培育3 h。為了便于觀察，采用磷酸鹽緩沖鹽水+2%牛血清白蛋白（BSA；Sigma-Aldrich，美國）中的抗髓過氧化物酶抗體（MPO）（1∶300；Calbiochem，美國）對固定在4%多聚甲醛中的細(xì)胞進(jìn)行染色，時長為1 h，然后放入Alexa Fluor 488山羊抗兔試劑盒（1∶500；Life Technologies，美國）中染色45 min，最后，在2%磷酸鹽緩沖鹽水-牛血清蛋白稀釋的1 μmol·L-1Hoechst-3342-三鹽酸鹽中復(fù)染10 min，接著在熒光顯微鏡下觀察成像。同時，采用Quant-iTTM Pico-Green dsDNA檢測試劑盒（Invitrogen，USA）對中性粒細(xì)胞胞外殺菌網(wǎng)絡(luò)（NET）進(jìn)行定量，此試劑盒加入了微球菌核酸酶溶液以便將中性粒細(xì)胞胞外殺菌網(wǎng)絡(luò)的DNA釋放到上清液中。向溶液中加入500 mmol·L-1乙二胺四乙酸終止微球菌核酸酶反應(yīng)。根據(jù)制造商的說明制備了PicoGreen溶液并培育5 min，然后用480 nm激發(fā)/520 nm發(fā)射的過濾器測量熒光信號。

2.13.細(xì)胞因子量化測定

根據(jù)制造商的方案，實驗采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（R&D systems，美國），選取已感染的人髓系白血病單核細(xì)胞，在其分化的巨噬細(xì)胞上清液中定量細(xì)胞因子白細(xì)胞介素（IL）-8和IL-1β。實驗重復(fù)進(jìn)行三次或四次。

2.14.活體小鼠體內(nèi)感染金黃色葡萄球菌實驗

在存活率研究中，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物在Todd-Hewitt液體培養(yǎng)基中生長至對數(shù)中期，并在磷酸鹽緩沖鹽水中洗滌一次。接下來，將3×108菌落形成單位通過腹腔（i.p.）注射到遠(yuǎn)系繁殖的10～12周齡的CD1小鼠（Charles River，美國）的腹膜內(nèi)。在血小板膜包覆納米顆粒組中，在小鼠感染耐甲氧西林金黃色葡萄球菌后，立即通過靜脈注射一次100 μL的5 mg·mL-1血小板膜包覆納米顆粒，3 h后再注射一次。監(jiān)測每日存活率，共持續(xù)監(jiān)測6 d。在單獨實驗中，采用相同的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌劑量和血小板膜包覆納米顆粒處理方案，在小鼠死亡6 h后，測定細(xì)菌菌落形成單位，并定量測定血清、脾臟中的腫瘤壞死因子（TNF）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）。

2.15.統(tǒng)計分析

所有實驗都重復(fù)進(jìn)行兩次或三次，最少獨立重復(fù)兩次。所有數(shù)據(jù)均以平均值的標(biāo)準(zhǔn)平均誤差（SEM）或標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）表示。采用單向方差分析（ANOVA）或t檢驗（Graph Pad Prism 5.03）進(jìn)行統(tǒng)計評估（*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001）。

2.16.符合倫理原則

動物實驗研究遵守了加利福尼亞大學(xué)圣迭戈分校動物保護(hù)和管理委員會協(xié)議（IACUC，協(xié)議S00227M）。在實驗過程中盡一切努力減少實驗動物使用量并盡力減少實驗給動物帶來的痛苦。血小板分離所需要的血液是通過靜脈穿刺從健康志愿者身上獲得的，并經(jīng)過了加利福尼亞大學(xué)圣迭戈分校人類研究保護(hù)項目（Human Research Protection Program）的批準(zhǔn)。

3.結(jié)論

3.1.血小板膜包覆納米顆粒的制備和分析

本研究的目標(biāo)是構(gòu)建一種血小板膜包覆納米顆粒。這種血小板膜包覆納米顆粒由天然血小板雙層膜包裹的聚乳酸-羥基乙酸共聚物核組成。采用血小板膜殼模擬母體血小板的表面，吸收不同分子結(jié)構(gòu)的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的毒素因子，從而降低毒性并保持血小板對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抵御能力[圖1（a）]。細(xì)胞膜來自血庫中剛過期（<24～48 h）的血小板濃縮物，這種血小板濃縮物通過低滲裂解、機(jī)械破碎和差速離心得到，其細(xì)胞膜保留了膜成分和相應(yīng)的功能[38]。選擇乙二胺四乙酸作為抗凝劑，以螯合二價陽離子（如鈣離子），并在穩(wěn)定處理血小板的同時避免激活凝血過程[38]。此外，添加了蛋白酶抑制劑以防止血小板聚集[38]。超聲處理產(chǎn)生了膜囊泡，膜囊泡融合聚乳酸-羥基乙酸共聚物核得到最終的血小板膜包覆納米顆粒。聚合物內(nèi)芯可穩(wěn)定外膜，防止其破碎或與其他膜融合，從而優(yōu)化體外和體內(nèi)的穩(wěn)定性。進(jìn)行膜包覆后，經(jīng)動態(tài)光散射測量，血小板膜包覆納米顆粒的直徑從（88.4±5.6）nm增加到（120.0±4.8）nm，這反映了聚合物核被細(xì)胞膜雙層包裹[圖1（b）、（c）]。透射電子顯微鏡清楚地顯示聚乳酸-羥基乙酸共聚物核被單層膜均勻包覆，表明血小板膜包覆納米顆粒形成[圖1（d）]。

圖1.血小板膜包覆納米顆粒的配方和分析。（a）模型展示了應(yīng)用血小板膜包覆納米顆粒調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞、結(jié)合病原體和控制體內(nèi)治療效果的基本原理；（b）、（c）采用動態(tài)光散射來測量血小板膜包覆前后的聚乳酸-羥基乙酸共聚物核的流體動力學(xué)尺寸（直徑單位為nm）；（d）展示了用醋酸雙氧鈾復(fù)染劑獲得的血小板膜包覆納米顆粒的透射電子顯微鏡圖像。

3.2.血小板膜包覆納米顆粒防止耐甲氧西林金黃色葡萄球菌上清液引起的人體血小板損傷和功能障礙

細(xì)菌毒素，如金黃色葡萄球菌α-毒素可以損害和抑制宿主細(xì)胞的功能[35,39]。本文首先研究了血小板膜包覆納米顆粒是否可以保護(hù)人體血小板，讓其免受耐甲氧西林金黃色葡萄球菌上清液的細(xì)胞毒性的損害。將人體血小板與耐甲氧西林金黃色葡萄球菌上清液一起培育1 h后，實驗觀察到有大量的乳酸脫氫酶釋放，血小板受到損傷；然而，血小板膜包覆納米顆?？梢宰屵@種情況顯著好轉(zhuǎn)：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌上清液中乳酸脫氫酶的釋放量為0.52±0.13（光密度值），而經(jīng)過血小板膜包覆納米顆粒處理的釋放量為0.27±0.08（光密度值）（P=0.002）[圖2（a）]。與釋放富含抗菌肽的α顆粒[2]相關(guān)的血小板活化可以采用P-選擇素的表面表達(dá)進(jìn)行量化。將人體血小板暴露于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌上清液后，實驗發(fā)現(xiàn)與血小板膜包覆納米顆粒一起培育可以顯著減少P-選擇素的表達(dá)時間，并大大增加其表達(dá)強(qiáng)度[圖2（b）、（c）]。這表明血小板膜包覆納米顆粒有助于維持血小板關(guān)鍵的反應(yīng)功能。為了研究血小板的細(xì)胞保護(hù)作用和功能激活作用是否可以改善機(jī)體的先天免疫活性，在血小板膜包覆納米顆粒存在和缺失的兩種情況下評估了血小板對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的殺滅能力。經(jīng)過血小板膜包覆納米顆粒處理后，血小板殺滅耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的能力顯著增強(qiáng)[圖2（d）、（e）]，表明血小板膜包覆納米顆?？梢员Ｗo(hù)血小板，減輕耐甲氧西林金黃色葡萄球菌對血小板的損傷，這種保護(hù)作用可能會改善宿主的防御功能。

圖2.血小板膜包覆納米顆?？深A(yù)防由耐甲氧西林金黃色葡萄球菌上清液引起的人體血小板損傷和功能障礙。（a）采用光密度值測定的乳酸脫氫酶釋放量顯示血小板膜包覆納米顆粒可降低耐甲氧西林金黃色葡萄球菌上清液誘導(dǎo)的血小板細(xì)胞毒性，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌上清液中乳酸脫氫酶的釋放量為0.52±0.13（光密度值），而經(jīng)過血小板膜包覆納米顆粒處理的釋放量為0.27±0.08（光密度值）（P=0.002）。（b）、（c）在血小板膜包覆納米顆粒存在和不存在的兩種情況下，暴露于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌上清液的血小板的P-選擇素表達(dá)。經(jīng)過血小板膜包覆納米顆粒處理后，P-選擇素的表達(dá)從早期時間點（10 min）開始顯著增加。（d）、（e）經(jīng)過血小板膜包覆納米顆粒處理后，血小板活力增強(qiáng)，同時也提高了其殺滅耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的能力。**：P<0.01；***：P<0.001。

3.3.血小板膜包覆納米顆粒防止耐甲氧西林金黃色葡萄球菌上清液引起的人體巨噬細(xì)胞損傷和功能障礙

在預(yù)先或者不預(yù)先對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌上清液與血小板膜包覆納米顆粒進(jìn)行培養(yǎng)30 min的兩種情況下，檢查了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌上清液對人髓系白血病單核細(xì)胞活性產(chǎn)生的影響。如圖3（a）所示，在血小板膜包覆納米顆粒存在的情況下，乳酸脫氫酶的釋放量減少了近75%。采用MTT法進(jìn)一步測定細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，當(dāng)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌上清液與血小板膜包覆納米顆粒進(jìn)行預(yù)混合處理后，1 h后的人髓系白血病單核細(xì)胞的活力顯著增強(qiáng)（與對照組相比）[圖3（b）]。實驗也測量了人髓系白血病單核細(xì)胞分化的巨噬細(xì)胞中乳酸脫氫酶的釋放量，顯示了血小板膜包覆納米顆粒顯著的保護(hù)作用[圖3（c）]。最后，在存在或不存在血小板膜包覆納米顆粒的兩種情況下，用活體耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染人髓系白血病單核細(xì)胞分化的巨噬細(xì)胞，結(jié)果表明“納米海綿”處理顯著增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞對病原體的殺滅能力[圖3（d）]。

圖3.血小板膜包覆納米顆粒可預(yù)防耐甲氧西林金黃色葡萄球菌上清液引起的人體巨噬細(xì)胞損傷和功能障礙。（a）乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性測試；（b）MTT試驗表明，血小板膜包覆納米顆粒處理使人髓系白血病單核細(xì)胞的毒性降低了約75%；（c）血小板膜包覆納米顆粒還提高了經(jīng)過耐甲氧西林金黃色葡萄球菌上清液處理后的人髓系白血病單核細(xì)胞分化巨噬細(xì)胞的活力；（d）不管細(xì)菌載量和培育時間如何，用血小板膜包覆納米顆粒預(yù)處理過的人髓系白血病單核細(xì)胞分化的巨噬細(xì)胞都具有更高的殺菌效率。*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001。

3.4.血小板膜包覆納米顆粒對抗細(xì)胞毒性可維持巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的效應(yīng)反應(yīng)

本研究進(jìn)一步檢查了血小板膜包覆納米顆粒對參與抗菌反應(yīng)的巨噬細(xì)胞的某些關(guān)鍵功能產(chǎn)生的影響?；钚匝酰≧OS）的產(chǎn)生，即氧化迸發(fā)，是巨噬細(xì)胞抗菌防御的關(guān)鍵因素，這一觀點得到了證實，實驗證明患有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶缺乏癥（慢性肉芽腫?。?，氧化迸發(fā)功能受損的患者感染金黃色葡萄球菌的概率較高[40]。為了應(yīng)對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，血小板膜包覆納米顆粒增加了人髓系白血病單核細(xì)胞（THP-1）分化巨噬細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生量[圖4（a）]。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）產(chǎn)生的一氧化氮也有助于抗菌防御，這一觀點得到了實驗證實，實驗證明缺少誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的小鼠感染金黃色葡萄球菌的情況更嚴(yán)重[41]。為了應(yīng)對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，血小板膜包覆納米顆粒也同樣促進(jìn)人髓系白血病單核細(xì)胞分化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮[圖4（b）]。金黃色葡萄球菌感染誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡，這種細(xì)胞死亡過程依賴炎癥小體激活并與IL-1β的釋放相關(guān)聯(lián)[42]。在實驗早期，IL-1β的產(chǎn)生量有所減少[圖4（c）]；一致地是，細(xì)胞毒性測定中乳酸鹽脫氫酶（LDH）的釋放量也有減少[圖3（a）]，這表明細(xì)胞焦亡是巨噬細(xì)胞對金黃色葡萄球菌攻擊產(chǎn)生的反應(yīng)，并且血小板膜包覆納米顆粒吸收毒素，在一定程度上可以減輕相關(guān)細(xì)胞毒性和細(xì)胞因子的釋放。血小板表達(dá)IL-1β受體（IL-1R）[43]，因此用血小板膜包覆納米顆粒隔絕IL-1β細(xì)胞因子可能有助于觀察到差異。最后，金黃色葡萄球菌毒素[44-45]和活化的血小板[46]也會引起中性粒細(xì)胞胞外殺菌網(wǎng)絡(luò)（NET），這可能會有促炎和促凝血作用，導(dǎo)致加重敗血癥[47]或心內(nèi)膜炎[48]。通過免疫染色觀察和Picogreen定量檢測釋放的DNA，發(fā)現(xiàn)血小板膜包覆納米顆粒顯著抑制了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的由體外人中性粒細(xì)胞組成的中性粒細(xì)胞胞外殺菌網(wǎng)絡(luò)的形成[圖4（d）、（e）]。

圖4.血小板膜包覆納米顆粒對巨噬細(xì)胞活化和中性粒細(xì)胞殺菌機(jī)制的影響。（a）對超氧化物的生成進(jìn)行DCFH-DA測定，可知血小板膜包覆納米顆粒會增加巨噬細(xì)胞的氧化迸發(fā)；（b）在血小板膜包覆納米顆粒處理的巨噬細(xì)胞中觀察到亞硝酸鹽的產(chǎn)生量增加，亞硝酸鹽的生成量反映了一氧化氮的生成量；（c）在血小板膜包覆納米顆粒處理的巨噬細(xì)胞中，最早時間點（第4 h）處細(xì)胞因子IL-1β的產(chǎn)生量減少；（d）在存在或不存在血小板膜包覆納米顆粒情況下，由耐甲氧西林金黃色葡萄球菌引發(fā)的人類中性粒細(xì)胞胞外殺菌網(wǎng)絡(luò)的免疫染色，PMA作為陽性對照；（e）采用PicoGreen測定對中性粒細(xì)胞胞外殺菌網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行定量分析。*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001。

3.5.血小板膜包覆納米顆粒可提高系統(tǒng)性感染耐甲氧西林金黃色葡萄球菌小鼠的存活率

上述體外研究表明，血小板膜包覆納米顆粒可以阻斷耐甲氧西林金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的血小板和巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性，增強(qiáng)兩種細(xì)胞類型的抗菌能力。這些發(fā)現(xiàn)表明血小板膜包覆納米顆粒有潛在的治療體內(nèi)金黃色葡萄球菌感染的作用。在先前用于藥代動力學(xué)和生物分布評估的嚙齒動物靜脈注射研究中，超過90%的血小板膜包覆納米顆?？梢栽?0 min內(nèi)分布到組織內(nèi)，尤其是肝臟和脾臟[38]。重要的是，先前在非感染性適應(yīng)癥小鼠模型中使用血小板膜包覆納米顆粒時未出現(xiàn)凝血異常，如免疫性血小板減少癥[49]和動脈粥樣硬化[50]等癥狀。8只小鼠為一組，準(zhǔn)備100 μL的腹腔內(nèi)注射液（含3×108菌落形成單位的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌），通過腹腔注射到小鼠體內(nèi)誘發(fā)系統(tǒng)性感染。在加入血小板膜包覆納米顆粒的實驗組中，在小鼠感染耐甲氧西林金黃色葡萄球菌后，立即將5 mg·mL-1血小板膜包覆納米顆粒直接注射到血流中，經(jīng)過3 h后再次注射[圖5（a）]。注射兩次的目標(biāo)是提供一個適度擴(kuò)展的治療覆蓋窗口，尋求減輕病原體介導(dǎo)的毒性損傷的方法，防止細(xì)胞因子風(fēng)暴的傳播，并防止因敗血癥引起的早期死亡。經(jīng)過血小板膜包覆納米顆粒處理的小鼠的存活率顯著提高，在沒有接受抗生素治療的情況下，仍有37.5%的小鼠存活了5天，而對照組中的所有小鼠都在前48 h內(nèi)死亡[圖5（b）]。在處理條件相同的一個單獨實驗中，在感染耐甲氧西林金黃色葡萄球菌6 h后收集血液，確定細(xì)菌菌落形成單位和血清細(xì)胞因子的水平。血液中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的菌落形成單位顯著降低（P=0.036），這與注射兩劑血小板膜包覆納米顆粒相關(guān)[圖5（c）、（d）]；脾臟計數(shù)出現(xiàn)減少的趨勢，但程度輕微未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組相比，血小板膜包覆納米顆粒組中血清白細(xì)胞介素6對抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的水平也有所降低[圖5（e）]。

圖5.血小板膜包覆納米顆?？商岣呦到y(tǒng)性感染耐甲氧西林金黃色葡萄球菌小鼠的存活率。（a）體內(nèi)實驗設(shè)置的示意圖。（b）在小鼠腹腔內(nèi)注射耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（每只小鼠注射3×108菌落形成單位）144 h后小鼠的存活率。接種細(xì)菌后立即注射100 μg 5 mg·mL-1的血小板膜包覆納米顆粒，3 h后再注射一次（每組n=8）。血小板膜包覆納米顆粒具有顯著提高存活率的優(yōu)點。（c）～（e）在血小板膜包覆納米顆粒處理實驗中，血液、脾臟和血清的殺滅細(xì)菌能力得到增強(qiáng)。

4.討論

本研究證明了血小板膜包覆納米顆?？捎糜谥委熛到y(tǒng)性感染耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的原理。這種益處很有可能是多方面的，包括：①減少與毒素相關(guān)的血小板損傷，從而更快速有效地發(fā)揮血小板的抗菌活性；②保護(hù)巨噬細(xì)胞免受耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的溶解損傷，從而使巨噬細(xì)胞更有效地調(diào)配活性氧和一氧化氮，實現(xiàn)有效殺菌；③隔離血小板膜中的某些細(xì)菌毒素（如成孔毒素）。此外，因為血小板表達(dá)Toll樣受體（如TLR2）和細(xì)胞因子受體（如IL-1R），所以它可以清除促炎細(xì)菌細(xì)胞壁成分和細(xì)胞因子以調(diào)節(jié)敗血癥引發(fā)的過度炎癥。后一種機(jī)制與巨噬細(xì)胞膜包覆納米粒子的體內(nèi)治療效果相似，在感染細(xì)菌脂多糖內(nèi)毒素血癥和大腸桿菌敗血癥的小鼠模型中，可以阻擋兩種疾病帶來的致命傷害[34]。雖然先前的研究表明紅血球“納米海綿”可以保護(hù)小鼠免受來自金黃色葡萄球菌上清液中分泌蛋白制劑引起的致命傷害[31]，但是目前的血小板膜包覆納米顆粒研究是第一份關(guān)于仿生膜包覆納米顆粒治療活體金黃色葡萄球菌系統(tǒng)性感染的報告。

最近的一項研究表明，全世界因敗血癥引發(fā)的人類死亡率高達(dá)19.7%[51]，但是目前仍然沒有專門批準(zhǔn)的藥物治療敗血癥[52]。抗生素耐藥性細(xì)菌菌株（如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌）的種類和數(shù)量不斷增加，這讓有效治療敗血癥變得更加困難[53]。在此背景下，與單克隆抗體方法或其他針對單個毒素或宿主炎癥因子的特殊分子結(jié)構(gòu)的方法相比，由血小板膜包覆納米顆?；蛴善渌?xì)胞膜包覆“納米海綿”是一種治療敗血癥更“通用”的方法。其他研究結(jié)果也證明了血小板膜包覆納米顆粒具有高效的治療能力。例如，有證據(jù)表明血小板膜包覆納米顆?？蓽p少巨噬細(xì)胞的細(xì)胞吞噬，同時不會在自體血漿中誘導(dǎo)人類補(bǔ)體激活；它們可以有選擇性地與人類和嚙齒動物受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，同樣也能與血小板黏附型病原體結(jié)合[31]，這可能有利于它們在血管內(nèi)感染了金黃色葡萄球菌的常見部位積聚。

總之，本研究表明，血小板膜包覆納米顆粒可以保護(hù)感染系統(tǒng)性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的血小板，期間通過吸收循環(huán)毒素來減小血小板受到的損傷、延長血小板的存活時間、加快血小板的激活速度、增強(qiáng)血小板殺菌能力。血小板膜包覆納米顆粒還可以保護(hù)和支持巨噬細(xì)胞的先天免疫功能。這種仿生解毒策略作為一種輔助療法值得進(jìn)一步探索，以改善感染耐甲氧西林金黃色葡萄球菌患者的臨床狀況，為當(dāng)前的臨床管理方法擴(kuò)展了一條新途徑。

5.研究局限性

系統(tǒng)性感染耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的小鼠研究不能完全代替人類感染的機(jī)理，因為小鼠對病原體具有相對抵抗力，并且需要非常高的劑量才能引起器官衰竭和死亡風(fēng)險。此外，對于疑似敗血癥患者，需要進(jìn)行快速的臨床干預(yù)——通常是在確認(rèn)病原體微生物學(xué)之前——并且患者可能患有一種或多種并存病，增加了發(fā)生負(fù)面結(jié)果的風(fēng)險。因此，“納米海綿”療法被視為是護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)的補(bǔ)充。

Acknowledgements

This work was supported by National Institutes of Health grants HL125352 and U01AI124316(VN).

Compliance with ethics guidelines

Jwa-Kyung Kim,Satoshi Uchiyama,Hua Gong,Alexandra Stream,Liangfang Zhang,and Victor Nizet declare that they have no conflict of interest or financial conflicts to disclose.