熱處理對鱸魚肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)及功能特性的影響

鄭云芳，李晨，張芳，汪少蕓

(福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350108)

0 引言

海鱸魚學(xué)名為日本真鱸，肉質(zhì)鮮美[1]、口感爽滑、滋味醇香、營養(yǎng)豐富，富含多種維生素、不飽和脂肪酸以及各種人體所需的氨基酸[2]，有健脾胃、補(bǔ)肝腎、止咳化痰等作用.熱處理是鱸魚等食品加工過程中常見的一種方式.加熱處理可降低食品中的致病菌的數(shù)量，有效延長食品的貨架期，但是會改變食品的顏色、風(fēng)味.蛋白質(zhì)分子的規(guī)整結(jié)構(gòu)受熱誘導(dǎo)會展開或者折疊，使原本緊密的結(jié)構(gòu)變得松散.而溫度過高時，蛋白質(zhì)分子間的運(yùn)動加快，維持蛋白質(zhì)一級和二級結(jié)構(gòu)的氫鍵、肽鍵等共價鍵被破壞，蛋白質(zhì)發(fā)生聚集[3].蛋白分子肽鏈?zhǔn)軣岷?，連接肽鏈的共價鍵被破壞，可能引起蛋白質(zhì)之間的相互作用發(fā)生改變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[4]，最終改變肌原纖維蛋白的理化特性.不同的加熱溫度、加熱時間和加熱方式對鱸魚蛋白的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響蛋白的功能特性.

本研究通過設(shè)置不同的加熱溫度和時間，測定巰基質(zhì)量摩爾濃度、濁度、紫外吸收光譜、內(nèi)源性熒光、拉曼光譜、Ca2+-ATPase等指標(biāo)來反映蛋白結(jié)構(gòu)和功能特性的變化，并利用主成分和聚類分析等初步建立構(gòu)象變化與功能特性之間的聯(lián)系.通過研究相關(guān)的理化指標(biāo)，將蛋白結(jié)構(gòu)的變化與功能特性進(jìn)行有效關(guān)聯(lián)，可以為蛋白類食品的功能化設(shè)計打下一定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鮮活珠海鱸魚，購于福州市永輝超市；EGTA，購自美國Sigma公司；五水合硫酸銅、乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸鈉，購自西隴科學(xué)股份有限公司；5, 5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)，購自麥克林生化科技公司；超微量ATP酶(Ca2+)測試盒，購自南京建成研究所；酒石酸鉀鈉，購自廣東光華化學(xué)廠.所有藥品均為分析純.

1.2 主要儀器設(shè)備

高速冷凍離心機(jī) (TG16-WS湘智離心機(jī)有限公司)；紫外可見分光光度計 (GENESYS 10S 美國賽默飛世爾科技公司)；熒光光譜儀 (Fluoromax-4 法國Horiba Instrument公司)；Zetasizer激光粒度分析儀 (ZEN3600 英國馬爾文公司)；多功能酶標(biāo)儀 (SpectraMax i3x 美谷分子儀器上海有限公司).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1) 肌原纖維蛋白的提取.肌原纖維蛋白的提取是參照Park[5]的方法，略作修改.

2) 熱處理.將制得的肌原纖維蛋白溶液放置于離心管中，利用水浴鍋對肌原纖維蛋白進(jìn)行加熱處理，當(dāng)加熱溫度和時間達(dá)到設(shè)計的條件時取出樣品，置于冰水浴中冷卻至室溫.

3) 測定巰基質(zhì)量摩爾濃度.利用Ellman法測定肌原纖維蛋白的總巰基和活性巰基的質(zhì)量摩爾濃度[6].

4) 測定表面疏水性.利用溴酚藍(lán)法測定肌原纖維蛋白的表面疏水性[7].將1 mL肌原纖維蛋白與200 μL 1 mg·mL-1的溴酚藍(lán)混合，振蕩反應(yīng)10 min，5 000 r·min-1離心15 min，取上清液稀釋10倍后在595 nm處測定吸光度.以溴酚藍(lán)結(jié)合量表示表面疏水性.每個樣品重復(fù)測定3次.

5) 紫外吸收光譜測定.根據(jù)Wang等[8]的方法，略作修改.將加熱后的肌原纖維蛋白溶液用磷酸鹽緩沖液稀釋至0.5 mg·mL-1，掃描范圍為190～400 nm.每個樣品重復(fù)測定5次.

6) 內(nèi)源性熒光測定.參照Xu等[9]的方法測定.將肌原纖維蛋白濃度調(diào)整為0.5 mg·mL-1，設(shè)置激發(fā)波長為295 nm，發(fā)射光譜范圍為300～450 nm.每個樣品掃描5次.

7) Ca2+-ATPase活性檢測.利用超微量ATP酶(Ca2+)測試盒測定鱸魚肌原纖維蛋白的Ca2+-ATPase活性的變化.

8) 拉曼光譜測定.采用InVia Reflex激光顯微拉曼光譜儀測定熱處理后肌原纖維蛋白的二級結(jié)構(gòu)，設(shè)置激光波長為785 nm，掃描范圍400～3 600 cm-1，光譜分辨率為1 cm-1.每個樣品重復(fù)測定3次.

9) 濁度測定.參照韓敏義等[10]的方法測定熱處理前后的濁度.將蛋白濃度調(diào)整為1 mg·mL-1，測定處理前后的樣品在340 nm處的吸光度，以磷酸鹽緩沖液作為空白.每個樣品重復(fù)測定3次.

10) 乳化性測定.根據(jù)Agyare等[11]的方法測定乳化性.取3 mL蛋白溶液，加入1 mL花生油，10 000 r·min-1高速剪切均質(zhì)1 min，吸取50 μL乳化液，加入5 mL 0.1 g·mL-1SDS溶液，測定乳化液在500 nm處的吸光值，記作A0.靜置10 min后，重復(fù)上述操作，將測得的吸光值記作A10.

11) 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析.采用SPSS軟件進(jìn)行相關(guān)性和顯著性分析，采用Origin軟件進(jìn)行作圖.利用Simca多元變量統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行主成分和聚類分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 巰基質(zhì)量摩爾濃度

加熱溫度和加熱時間對巰基質(zhì)量摩爾濃度的影響如圖1所示.由圖1可知，不同加熱溫度處理后的肌原纖維蛋白的活性巰基質(zhì)量摩爾濃度先增后減.熱處理前后蛋白的總巰基質(zhì)量摩爾濃度減少.剛開始巰基質(zhì)量摩爾濃度的下降速度快，而后下降速度減緩.當(dāng)加熱溫度為90 ℃時，肌原纖維蛋白總巰基質(zhì)量摩爾濃度下降了13.90%.90 ℃時肌原纖維蛋白的活性巰基質(zhì)量摩爾濃度為83.03 mmol·kg-1，下降了17.16%.

注： 不同小寫字母表示熱處理與對照組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 以下同 圖1 加熱溫度和加熱時間對巰基質(zhì)量摩爾濃度的影響Fig.1 Effect of heating temperature and heating time on sulfhydryl molality

隨著加熱時間的延長，肌原纖維蛋白的總巰基和活性巰基的質(zhì)量摩爾濃度逐漸下降.當(dāng)加熱時間為20 min時，肌原纖維蛋白的總巰基質(zhì)量摩爾濃度為84.47 mmol·kg-1，下降了6.15%，活性巰基質(zhì)量摩爾濃度為65.07 mmol·kg-1，下降了4.20%.

總巰基所具備的活性為各種反應(yīng)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)[12].蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化常常與巰基和疏水基團(tuán)的暴露有關(guān)[13].熱處理后巰基質(zhì)量摩爾濃度下降的原因是因?yàn)榧訜崾辜≡w維蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變，埋藏于蛋白分子內(nèi)部的巰基轉(zhuǎn)移至表面，活性巰基增加.溫度進(jìn)一步上升，高溫促進(jìn)了巰基的氧化反應(yīng)，蛋白完全變性和聚集，生成二硫鍵和聚集體，巰基被掩蓋，因而質(zhì)量摩爾濃度降低.

2.2 表面疏水性

表面疏水性的大小以溴酚藍(lán)結(jié)合質(zhì)量表示，加熱溫度和加熱時間對表面疏水性(m溴酚藍(lán))影響如圖2所示.由圖2可以看出，隨著加熱溫度的提高，肌原纖維蛋白的表面疏水性先增大后減小.當(dāng)加熱溫度為60 ℃時，肌原纖維蛋白的表面疏水性達(dá)到最大.繼續(xù)增大加熱溫度，表面疏水性減小.隨著加熱時間的延長，肌原纖維蛋白的表面疏水性呈現(xiàn)減小的趨勢.當(dāng)加熱時間為20 min時，肌原纖維蛋白的表面疏水性降至最低點(diǎn)，比對照組下降了19.18%.

圖2 加熱溫度和加熱時間對表面疏水性的影響Fig.2 Effect of heating temperature and heating time on surface hydrophobicity

疏水域的暴露被認(rèn)為是形成大型肌球蛋白聚集體的先決條件.Benjakul等[14]發(fā)現(xiàn)在加熱過程中，魚類肌原纖維蛋白的表面疏水性的變化可以分為2個階段.第一階段，表面疏水性隨溫度升高逐漸增大；第二階段，疏水性殘基完全暴露于極性環(huán)境中，表面疏水性基本不變.

2.3 紫外吸收光譜

濁度大小以蛋白質(zhì)芳香族氨基酸的吸光值表示.加熱溫度和加熱時間對紫外吸收光譜的影響如圖3所示.圖3表明肌原纖維蛋白的紫外吸收隨著加熱溫度的增大而增強(qiáng)，最大吸收峰發(fā)生藍(lán)移.超過40 ℃時，紫外吸收增加的程度較為明顯.當(dāng)加熱溫度達(dá)到90 ℃時，與不加熱的肌原纖維蛋白相比，加熱處理后的肌原纖維蛋白的最大吸收峰值增加了33.84%.隨著加熱時間的延長，肌原纖維蛋白的紫外吸收光譜的紫外吸光度逐漸增加.當(dāng)加熱時間為20 min時，肌原纖維蛋白的最大吸收峰值增加了7.26%.

圖3 加熱溫度和加熱時間對紫外吸收光譜的影響Fig.3 Effect of heating temperature and heating time on ultraviolet absorption spectra

熱處理使肌原纖維蛋白紫外吸收強(qiáng)度增加的原因可能是熱處理使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)展開，構(gòu)象發(fā)生改變，埋藏在分子內(nèi)部的生色基團(tuán)暴露，導(dǎo)致紫外吸收特征峰值升高[15].紫外吸收光譜圖中的最大吸收峰發(fā)生藍(lán)移，說明蛋白質(zhì)所處的環(huán)境極性增加，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開[16].

2.4 熒光光譜

加熱溫度和加熱時間對熒光光譜的影響如圖4所示.由圖4可知，隨著加熱溫度的升高，肌原纖維蛋白的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度逐漸降低，發(fā)生了熒光猝滅，最大吸收峰輕微紅移.當(dāng)加熱溫度為90 ℃時，熒光強(qiáng)度下降了9%.隨著加熱時間的延長，肌原纖維蛋白的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度下降.當(dāng)加熱時間為20 min時，肌原纖維蛋白的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度下降的程度不明顯，僅減少了1.92%.加熱可能造成蛋白結(jié)構(gòu)的破壞，引起生色基團(tuán)暴露在溶劑中，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低[17].熱處理改變了蛋白肽鏈的折疊形式，蛋白展開，色氨酸殘基暴露于表面.活性基團(tuán)的暴露增強(qiáng)了分子間相互作用，造成分子的再聚集，進(jìn)一步導(dǎo)致更多色氨酸殘基被包埋于疏水區(qū)域，從而引起內(nèi)源熒光強(qiáng)度的下降.

圖4 加熱溫度和加熱時間對熒光光譜的影響Fig.4 Effect of heating temperature and heating time on fluorescence spectra

吸收峰位波長紅移原因可能是由于加熱使肌原纖維蛋白內(nèi)部疏水結(jié)構(gòu)與區(qū)域暴露，色氨酸側(cè)鏈基團(tuán)暴露在蛋白質(zhì)分子外部，處于極性環(huán)境中.袁麗等[18]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過不同的溫度處理后鳙魚肌球蛋白的熒光強(qiáng)度隨溫度升高，逐漸降低，出現(xiàn)熒光猝滅的現(xiàn)象.

2.5 Ca2+-ATPase活性

蛋白質(zhì)酶促反應(yīng)中無機(jī)磷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化表示熱處理過程中Ca2+-ATPase的變化情況, 如圖5所示.隨著加熱溫度的升高，Ca2+-ATPase活性逐漸減小.當(dāng)加熱溫度達(dá)到50 ℃時，肌原纖維蛋白的Ca2+-ATPase的活性急劇降低.當(dāng)加熱溫度超過80 ℃時，Ca2+-ATPase的活性幾乎降為0，此時隨著加熱溫度的繼續(xù)升高，Ca2+-ATPase的活性不變.

圖5 加熱溫度和加熱時間對Ca2+-ATPase的影響Fig.5 The effect of heating temperature and heating time on Ca2+-ATPase

Ca2+-ATPase活性隨加熱時間延長而降低.Ca2+-ATPase活性在加熱初始階段，急劇下降，幾乎降為0.繼續(xù)延長加熱時間，肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase的活性不變.肌球蛋白與Ca2+-ATPase的活性密切相關(guān)，Ca2+-ATPase的活性下降反映了肌球蛋白的熱變性和聚集.

2.6 二級結(jié)構(gòu)

拉曼光譜法不但具備無損檢測的特點(diǎn)，并且操作簡單，可被用于預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu).通過分析肌原纖維蛋白拉曼光譜譜圖的特征峰的峰位、峰強(qiáng)度以及峰面積，結(jié)合相關(guān)分析軟件可推測肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的變化.加熱溫度和加熱時間對二級結(jié)構(gòu)的影響如圖6所示.由圖6分析可知，隨著加熱溫度的提高，α-螺旋遞減,β-折疊和無規(guī)卷曲的比例增加.與對照組相比，當(dāng)加熱溫度為90 ℃時，肌原纖維蛋白的α-螺旋占比降至23.35%，下降了64.63%，此時無規(guī)卷曲和β-折疊的比例達(dá)到最大值，分別為25.50%和35.95%，增加了1.99倍和1.41倍.

圖6 加熱溫度和加熱時間對二級結(jié)構(gòu)的影響Fig.6 Effect of heating temperature and heating time on secondary structure

隨著加熱時間的延長，肌原纖維蛋白的α-螺旋占比降低，β-折疊和無規(guī)卷曲的比例增加，β-轉(zhuǎn)角的比例先增后減.當(dāng)加熱時間為20 min時，α-螺旋占比降至21.45%，比對照組下降了63.02%，β-折疊和無規(guī)卷曲增加至36.57%和25.18%，分別增加了97.89%和2.84倍.二級結(jié)構(gòu)比例的變化說明熱處理使肌原纖維蛋白的α-螺旋向β-折疊和無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)化.變性是由于肌原纖維蛋白中α-螺旋區(qū)域解折疊而引發(fā)的，然后暴露疏水和巰基殘基，這些殘基隨后參與聚集和膠凝過程.

2.7 濁度

利用比色法比較濁度，可用于檢測蛋白質(zhì)聚集的程度[19].加熱溫度和加熱時間對濁度的影響如圖7所示.圖7說明經(jīng)過不同加熱溫度處理后的肌原纖維蛋白濁度逐漸增大.90 ℃時，肌原纖維蛋白的濁度顯著增加，增大了40.51%.說明此時肌原纖維蛋白發(fā)生聚集，懸浮顆粒直徑變大，濁度升高.

隨著加熱時間的延長，肌原纖維蛋白的濁度逐漸增大.當(dāng)加熱時間為20 min時，肌原纖維蛋白的濁度增加了9.65%.在加熱過程中，肌球蛋白重鏈和輕鏈可能改變其構(gòu)象，然后聚集形成不溶性物質(zhì).質(zhì)地和功能特性的變化與蛋白質(zhì)變性和聚集有關(guān)[20].

圖7 加熱溫度和加熱時間對濁度的影響Fig.7 Effect of heating temperature and heating time on turbidity

2.8 乳化性

加熱溫度和加熱時間對乳化性的影響如圖8所示.圖中EAI為乳化活性指數(shù)，ESI為乳化穩(wěn)定指數(shù).由圖8可知，隨著加熱溫度的升高，肌原纖維蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性先增后減.80 ℃時，乳化活性達(dá)到最大值為24.695 m2·g-1，乳化性增加了19.46%.60 ℃時，肌原纖維蛋白的乳化穩(wěn)定性最大，增加了42.35%.經(jīng)過加熱蛋白的結(jié)構(gòu)展開，更容易向油-水界面和氣-液界擴(kuò)散，乳化性的增大.過高的溫度會破壞蛋白質(zhì)在兩相界面的吸附作用，不利于形成穩(wěn)定的乳化體系.

圖8 加熱溫度和加熱時間對乳化性的影響Fig.8 Effect of heating temperature and heating time on emulsifying properties

隨著加熱時間的延長，肌原纖維蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性先增后減.當(dāng)加熱時間為5 min時，肌原纖維蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性達(dá)到最大，分別為36.137 m2·g-1和33.88%.與對照組相比，肌原纖維蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性分別增加了1.02倍和4.92%.

2.9 主成分分析

利用多元變量統(tǒng)計分析軟件對不同加熱溫度處理后的肌原纖維蛋白理化指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如圖9所示.

圖9 不同加熱溫度的主成分得分圖和載荷圖Fig.9 Principal component score diagram and load diagram with different heating temperature

分解得到2個主成分.第一主成分的解釋率為0.572，第二主成分的解釋率為0.285.評分圖顯示不同加熱溫度下的樣品明顯分開，表示不同加熱溫度對肌原纖維蛋白的理化性質(zhì)有較大的影響.80 ℃和90 ℃的樣品位置接近，差別較小.α-螺旋和活性巰基的距離近，關(guān)聯(lián)性強(qiáng).β-折疊、乳化性和濁度的距離近，關(guān)聯(lián)性強(qiáng).α-螺旋、β-折疊、無規(guī)卷曲和乳化性被主成分介紹的程度高.

對不同加熱時間處理后的肌原纖維蛋白理化指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，分解得到2個主成分.第一主成分的解釋率為0.705，第二主成分的解釋率為0.199.如圖10所示，評分圖顯示不同加熱時間下的樣品明顯分開，表示不同加熱時間對肌原纖維蛋白的理化性質(zhì)有較大的影響.不加熱的樣品與加熱處理的樣品差別較大.加熱時間為15和20 min樣品的位置接近，差別較小.濁度和無規(guī)卷曲的距離近，關(guān)聯(lián)性強(qiáng).α-螺旋、Ca2+-ATPase和表面疏水性的距離近，關(guān)聯(lián)性強(qiáng).

圖10 不同加熱時間的主成分得分圖和載荷圖Fig.10 Principal component score diagram and load diagram with different heatingtime

2.10 聚類分析

觀察聚類圖(圖11)發(fā)現(xiàn)，20、30、40和80 ℃被聚為1類，50和60 ℃聚為1類.70和90 ℃各自分別為1類.乳化性、總巰基、濁度、I760/I1003、I850/I830、β-折疊、α-螺旋、無規(guī)卷曲、溶解度、起泡性、Ca2+-ATPase等指標(biāo)聚為1類，表明這些指標(biāo)間有密切聯(lián)系.

5和10 min被聚為1類，15和20 min聚為1類、0 min為1類.總巰基、濁度、I760/I1003、I850/I830、β-折疊、α-螺旋、無規(guī)卷曲、溶解度、起泡性、Ca2+-ATPase等指標(biāo)聚為1類，表明這些指標(biāo)間有密切聯(lián)系.

圖11 不同加熱溫度和加熱時間的聚類分析(Group 1～Group 4分別代表依屬于不同距離函數(shù)的指標(biāo))

3 結(jié)語

熱處理使肌原纖維蛋白的巰基質(zhì)量摩爾濃度減少、紫外吸光度和濁度增大、熒光強(qiáng)度下降、Ca2+-ATPase活性下降.加熱溫度升高，肌原纖維蛋白的表面疏水性先增大后減小.熱處理使肌原纖維蛋白的α-螺旋比例減少，β-折疊和無規(guī)卷曲的比例增加.熱處理后的肌原纖維蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性先增后減.主成分和聚類分析表明蛋白質(zhì)的不同結(jié)構(gòu)會對功能特性的影響是不同的.主成分分析表明α-螺旋、β-折疊、無規(guī)卷曲和乳化性被主成分介紹的程度高.可以通過設(shè)計不同加熱溫度和時間使肌原纖維蛋白的功能特性得到有效的發(fā)揮.