黃芪根腐病生防菌株的篩選鑒定及其防效評價

張愛梅,李曦冉,郭保民,陳 鑫

(西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,蘭州 730070)

黃芪(Astragalus membranaceus)是黃芪屬多年生草本豆科植物,以根入藥[1-2],居于中國常用中藥前列。《中華人民共和國藥典》中記載黃芪具有補氣升陽、生津養(yǎng)血和斂瘡生肌等功效,可用于氣虛乏力、食少便溏和中氣下陷等癥狀[3]。近年來,由于黃芪的需求量持續(xù)增加[4],連作周期頻繁縮短,連作面積不斷增加,致使黃芪土傳病害日益凸顯,其中黃芪根腐病尤為突出,嚴重制約黃芪的品質(zhì)和產(chǎn)量[5]。已有研究發(fā)現(xiàn),黃芪根腐病致病菌主要為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)和腐皮鐮刀菌(Fusarium solaniun)[6]。目前,黃芪根腐病的防治有農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和生物防治等方法[7]。傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)防治成本高,實施困難;化學(xué)防治在短期內(nèi)經(jīng)濟有效,但其在土壤及植物中容易形成殘留,并引發(fā)病原菌抗藥性的產(chǎn)生,長期使用還會引發(fā)環(huán)境問題;生物防治方法因其作用明顯[8-9],有利于農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和生態(tài)環(huán)境的改善而越來越受到人們的重視[10],生物防治?？衫梦⑸锛捌浯x產(chǎn)物來達到生防目的。

微生物是一大類寶貴的生物資源,其分布廣泛且種類繁多,植物內(nèi)生細菌因長期與植物共存,并與宿主植物經(jīng)過長期協(xié)同進化而形成互利共生的關(guān)系,是植物病害生物防治的天然資源菌[11]?，F(xiàn)有研究表明,幾乎所有的植物,甚至同一植物的不同組織及部位都存在著內(nèi)生菌[12]。沙棘(Seabuckthorn)為胡頹子科沙棘屬植物,可在貧瘠干旱及高寒環(huán)境生存,其根系發(fā)達,根部經(jīng)固氮弗蘭克氏菌侵染后能形成明顯根瘤[13-14]。張愛梅等[14-15]前期研究發(fā)現(xiàn),沙棘根瘤中除了共生固氮的弗蘭克氏菌外,還定殖著其他內(nèi)生細菌資源;且發(fā)現(xiàn)沙棘根瘤內(nèi)生細菌能產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì),對黃瓜枯萎病具有抑制作用。根瘤內(nèi)生細菌相對于植物其他組織部位的內(nèi)生細菌而言,其對土壤的適應(yīng)性更強,用于土傳性病害的生物防治更具優(yōu)勢[16]。因此,本研究以25株具有抑菌性能的沙棘根瘤內(nèi)生細菌為材料,篩選抗黃芪根腐病病原真菌的菌株,并進行黃芪盆栽防治試驗,以綜合評價生防細菌的抑菌及生防效果,為黃芪根腐病的生物防治提供菌種資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 前期分離篩選得到具有抑菌性能的中國沙棘根瘤內(nèi)生細菌25株。供試黃芪根腐病病原真菌4株,腐皮鐮刀菌(F.solaniun)G2和G3,尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)G5和G6。1.1.2 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:用于內(nèi)生細菌的活化培養(yǎng);馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA):用于生防菌株的篩選;營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NB):用于生防菌發(fā)酵液的制備;馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PD):用于病原菌發(fā)酵液的制備。

1.2 方法

1.2.1 黃芪根腐病生防內(nèi)生細菌初篩與復(fù)篩黃芪根腐病生防內(nèi)生細菌初篩采用平板對峙法,參照Akowuah等[17]的方法進行。對初篩后抑菌率較高的5株內(nèi)生細菌進行復(fù)篩,方法與初篩相同。

抑菌率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100%[18]。

1.2.2 沙棘根瘤內(nèi)生細菌鑒定參考 參照文獻[19],根據(jù)菌落及顯微形態(tài)特征進行形態(tài)學(xué)初步鑒定,對篩選得到的抑菌性能較好的內(nèi)生細菌菌株進行產(chǎn)氣、淀粉水解等生理生化試驗。內(nèi)生細菌DNA的提取參照張愛梅等[20]的方法進行,對提取的DNA進行PCR擴增,PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后,送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序。所得序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST同源性比對,用MEGA 7.0軟件進行同源性分析,以鄰接法[21]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 內(nèi)生細菌對黃芪根腐病防治效果的盆栽試驗 參照鄭豆豆等[22]的方法,略作修改。試驗設(shè)3種處理:(1)移苗后只接無菌水,做對照;(2)移苗19 d后,接種病原菌;(3)移苗19 d后,先接種病原菌;再培養(yǎng)16 d后,接種生防菌。盆栽時每盆移載黃芪幼苗5株,每個處理重復(fù)3次。用灌根法接種,接種液量為5 m L。接種的病原菌G5于28℃、180 r·min-1的PD培養(yǎng) 基中培 養(yǎng)5 d,孢子濃度調(diào)至1.0×106CFU·L-1。黃芪幼苗生長至55 d后取樣調(diào)查,參照病害分級標(biāo)準(zhǔn)[22]統(tǒng)計發(fā)病程度,按下列公式計算發(fā)病率、病情指數(shù)、防治效果。

發(fā)病率=發(fā)病植株總數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100%

病情指數(shù)=∑(病級株數(shù)×代表值)/(總株數(shù)×最高病級代表值)×100%

防控效果=(對照病情指數(shù)-病情指數(shù))/對照病情指數(shù)×100%

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,用Origin 7.5和MEGA 7.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃芪根腐病生防內(nèi)生細菌初篩

從25株具抑菌性的沙棘根瘤內(nèi)生細菌中,篩選到11株對黃芪根腐病病原真菌具有抑制效果的內(nèi)生細菌(表1),11株均能抑制G5的生長,9株可抑制G6的生長,7株對G3有抑制效果,5株對G2有抑制效果。從初篩結(jié)果可以看出,TT14、GB108、SY50、SY60和NR205對供試的4株黃芪根腐病病原真菌均具有較好的抑制 效果。

表1 內(nèi)生細菌對4種供試病原真菌的抑菌率Table1 Antagonism of endophytic bacteria to four indicating pathogen fungus

由圖1可見,菌株TT14對供試病原菌G5和G3的抑制效果最強,抑菌率分別為56.52%和78.89%;菌株GB108對G2和G6的抑制效果最強,抑菌率分別為81.59%和79.93%。

2.2 黃芪根腐病生防內(nèi)生細菌復(fù)篩

復(fù)篩結(jié)果(圖2)顯示,5株內(nèi)生細菌對供試黃芪根腐病病原菌均有較好的抑制效果。其中,菌株TT14對供試病原菌G5、G6、G3和G2的抑制效果相對較高,抑菌率分別達到55.27%、57.19%、74.98%和61.23%。

復(fù)篩與初篩抑菌率結(jié)果相近,說明內(nèi)生細菌對黃芪根腐病的抑制效果穩(wěn)定。菌株TT14的整體抑制效果最佳,對4株供試病原菌的抑菌率均在55.27%以上,故將菌株TT14作為后續(xù)研究的供試生防菌株。

2.3 生防菌株鑒定

2.3.1 形態(tài)鑒定 將菌株TT14于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)后觀察可見,菌落形狀不規(guī)則,扁平,直徑為2 mm,呈乳白色不透明,菌落表面光滑、濕潤,邊緣呈波狀。鏡檢觀察其為G+菌,細胞呈短桿狀,有芽孢(圖3)。

2.3.2 生理生化鑒定 生理生化反應(yīng)結(jié)果的測定以實驗室保存的模式菌株大腸桿菌和枯草芽孢桿菌為對照,菌株TT14生理生化鑒定結(jié)果見表2。菌株TT14的產(chǎn)酸、運動性、接觸酶、酯酶反應(yīng)均顯陽性,能利用淀粉、纖維素、硫化氫、硝酸鹽、檸檬酸和明膠;產(chǎn)氣、甲基紅和V-P反應(yīng)為陰性,不產(chǎn)吲哚乙酸,無固氮能力。結(jié)合形態(tài)特征,初步鑒定菌株TT14為特基拉芽孢桿菌(Bacillus tequilensis)。

表2 菌株TT14部分生理生化試驗結(jié)果Table2 Physiological and biochemical test results of strain TT14

2.3.3 分子鑒定 對生防細菌TT14的16S r RNA基因擴增產(chǎn)物測序,測得其16S r RNA基因序列長度為1 450 bp左右。將該序列提交至NCBI進行比對,并選取相似性高的序列,運用MEGA 7.0軟件中的Neighbor-Joining分析方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。結(jié)果顯示,菌株TT14與Bacillus tequilensis(NR 104919.1)位于同一分支,其聚類支持強度為88%,結(jié)合其形態(tài)特征及生理生化試驗結(jié)果,將菌株TT14鑒定為特基拉芽孢桿菌(Bacillus tequilensis)。

2.4 菌株TT14對黃芪根腐病防治效果的盆栽試驗結(jié)果

盆栽試驗表明,生防細菌TT14對黃芪幼苗的生長有明顯影響。接種菌株TT14菌液第12天時,黃芪幼苗生長情況較只接病原菌的黃芪幼苗的株高和葉片均表現(xiàn)出一定程度的差異,至第20天時差異顯著,黃芪生長狀況如圖5所示。從結(jié)果可知,接種菌株TT14的黃芪幼苗,平均苗高達25.62 cm,且根部呈淡黃色,有側(cè)根,葉片濃密呈深綠色;只接病原菌的黃芪幼苗,平均苗高為17.14 cm,根部略微發(fā)紅,基本無側(cè)根,葉片稀疏且顏色發(fā)黃。

防效試驗結(jié)果表明,只接種病原菌時,黃芪幼苗病情指數(shù)為57.98;先接病原菌,再接種生防細菌TT14時,黃芪幼苗病情指數(shù)下降為19.90?？梢?先接病原菌,再接種生防細菌TT14時,黃芪幼苗根腐病病情指數(shù)及發(fā)病率較只接病原菌時分別降低42.86%和38.08%。生防細菌TT14接種第20天時,其對黃芪根腐病的防治效果如表3所示,結(jié)果表明,菌株TT14對黃芪根腐病的防效達到65.68%,相比只接種黃芪根腐病病原菌的黃芪幼苗,起到較好的防控效果。試驗還發(fā)現(xiàn),接種TT14后的黃芪幼苗平均根苗比及根部干質(zhì)量分別為43.55%和14.28 mg,較只接病原的黃芪幼苗分別提高8.52%和50.77%,比空白對照組的黃芪幼苗分別提高1.94%和12.26%。這表明,生防細菌TT14對黃芪根腐病有顯著的生防效果。

表3 菌株TT14對黃芪根腐病的生防效果Table3 Biological control effect of strain TT14 on Astragalus root rot

3 討論

本研究的初篩和復(fù)篩結(jié)果顯示,生防細菌TT14對供試的4株黃芪根腐病病原菌均有較好且相對穩(wěn)定的抑制效果,初篩抑菌率達54.52%以上,復(fù)篩抑菌率均在55.27%以上。盆栽試驗發(fā)現(xiàn),菌株TT14對黃芪根腐病有明顯的防治效果,接種菌株TT14后,黃芪幼苗的防治效果達65.68%。這說明,生防細菌TT14對黃芪根腐病有一定控制效果。

黃芪根腐病是影響黃芪生長的一種主要病害,許多研究者開展過黃芪根腐病的微生物防治研究,騰艷萍等[23]利用3株木霉菌對黃芪根腐病菌的最高抑菌率達75%,但發(fā)現(xiàn)病原菌與木霉菌存在生長競爭;高芬等[24]用黃芪根際促生菌防治黃芪根腐病時,最高抑菌率僅為40.85%。說明生防微生物來源不同,抑菌效果也不一樣。本研究采用來源于中國沙棘根瘤的內(nèi)生細菌,其對供試4株病原菌的抑菌率為55.27%～74.98%,其生防效果顯著,原因可能是植物內(nèi)生細菌可產(chǎn)生抗生素、細菌素、溶菌酶、超氧化物歧化酶、生物堿等多種代謝產(chǎn)物,抑制或殺死病原菌[25-26]。植物內(nèi)生細菌因其生境特殊,并與植物長期共存,是一大類有應(yīng)用潛力的微生物資源,已有學(xué)者利用植物內(nèi)生細菌進行辣椒根腐病[27]、小麥根腐病[28]、番瓜根腐病[29]等常見根腐病的防治研究。

本研究篩選得到的生防細菌TT14,經(jīng)鑒定其為特基拉芽孢桿菌(B.tequilensis)。特基拉芽孢桿菌在生防領(lǐng)域的研究,已有學(xué)者開展過相關(guān)的工作,Bhattacharya等[30]發(fā)現(xiàn)特基拉芽孢桿菌對F.oxysporum有較好的抑制效果,但抑菌機理尚不明確?？赡苁且驗樘鼗挎邨U菌繁殖速度快,抗逆性強[30],且其產(chǎn)生的脂肽生物表面活性劑,對浮游細胞和生物膜上附著的固有細胞具有殺菌活性;或是特基拉芽孢桿菌產(chǎn)生的促進生物膜形成的表面活性劑[31],加速占領(lǐng)生存空間,提高代謝化合物的利用,從而阻礙病原菌菌絲的生長[32],也可能是多種物質(zhì)之間協(xié)同作用的效應(yīng)。但拮抗細菌TT14的抑菌機理仍需深入研究。

盆栽試驗表明,接種生防細菌TT14的黃芪幼苗株高比僅接病原菌的平均高8.48 cm,且側(cè)根濃密,葉片繁茂,根部干質(zhì)量增加,其原因可能是TT14產(chǎn)生的抗菌類物質(zhì)抑制了病原菌對宿主植物的侵害,或者通過競爭生態(tài)位和營養(yǎng)來抑制植物病原菌的侵染和生長[33];此外接種生防細菌TT14的黃芪幼苗株高比空白對照組平均高2.26 cm,根苗比和根部干質(zhì)量也分別提高1.94%和12.26%,這表明TT14可以促進黃芪幼苗的生長,具有一定促生作用。楊鎮(zhèn)等[34]、Mohanty等[35]研究發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生細菌能產(chǎn)生植物激素,促進宿主植物的生長,同時還可促進宿主植物對氮、磷、鉀、鐵等營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。盆栽試驗還發(fā)現(xiàn),菌株TT14對黃芪根腐病有明顯的防治效果,接種菌株TT14后,黃芪幼苗的防控效果達65.68%,病情指數(shù)下降至19.90。辛中堯等[36]利用枯草芽孢桿菌B1和B2防治黃芪根腐病,其防治效果為50.77%,低于本研究的結(jié)果,其原因可能是前者為大田試驗,后者為盆栽試驗,二者試驗環(huán)境不同所致。

本研究已經(jīng)驗證生防細菌TT14在盆栽試驗中有良好的生防效果,但在田間環(huán)境下,栽培條件、自然環(huán)境、微生態(tài)環(huán)境及內(nèi)生菌形態(tài)穩(wěn)定性等多種因素都會影響內(nèi)生菌生防作用的發(fā)揮。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),多數(shù)內(nèi)生細菌在實驗室培養(yǎng)條件下抑菌效果明顯,但在田間環(huán)境中,植物內(nèi)生菌生防效果不穩(wěn)定[37-38]。植物本身就是一種復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng),內(nèi)生菌生活在其中,其生防作用的發(fā)揮受到多種因素制約。其中最重要的兩個因素為內(nèi)生菌的生防機制和轉(zhuǎn)運及內(nèi)生菌在植物體內(nèi)的數(shù)量[25]。因此在后續(xù)研究中仍需在不同條件下進行大田防治試驗,進一步探究生防內(nèi)生細菌在田間的定殖能力、促生能力和綜合防治能力,以期為黃芪根腐病的生物防治提供菌種資源。