不同填充劑對農(nóng)村廚余垃圾堆肥氮轉(zhuǎn)化及相關(guān)功能基因的影響

王 佳,谷 潔,王小娟,宋籽霖,徐 良,于 靜,雷留生,代曉霞,趙文雅

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院,陜西楊凌 712100)

隨著農(nóng)村生活水平的提高,農(nóng)村生活垃圾目前在中國的年產(chǎn)生量已達(dá)到3億t[1],并且仍以8%～10%的速度逐年增加,其中廚余垃圾占比高達(dá)60%[2]。廚余垃圾具有含水率高,易腐爛變質(zhì)的特點,如果與其他生活垃圾一起進(jìn)行焚燒或填埋,可能會產(chǎn)生二噁英、滲濾液等有害物質(zhì)威脅人類健康[3]。同時,廚余垃圾中含有的有機物和營養(yǎng)元素也是農(nóng)村發(fā)展種植業(yè)所需要的。好氧堆肥作為有機廢棄物無害化、資源化的生物方法被廣泛使用。因此,利用好氧堆肥將農(nóng)村大量的廚余垃圾轉(zhuǎn)化為綠色有機肥料施用回土壤,不僅可以解決農(nóng)村廚余垃圾帶來的污染問題,而且為實現(xiàn)養(yǎng)分資源循環(huán)利用的農(nóng)業(yè)農(nóng)村綠色發(fā)展提供了保障。但目前發(fā)現(xiàn),伴隨著好氧堆肥的氮轉(zhuǎn)化過程會造成氮素?fù)p失,從而降低堆肥產(chǎn)品質(zhì)量[4]。農(nóng)村廚余垃圾的氮轉(zhuǎn)化的研究對減少含氮氣體的排放、降低養(yǎng)分損失有重要意義。

廚余垃圾高含水率、高密度的特性使得其不能單獨堆肥,需要添加填充劑來調(diào)節(jié)堆體含水量,增加堆料與O2的接觸面積,以確保好氧堆肥能夠順利進(jìn)行[5]。姚艷麗等[6]研究發(fā)現(xiàn)用牛糞和羊糞作為填充劑加快了甘蔗渣的腐熟進(jìn)程;張邦喜等[7]在雞糞-煙末堆肥中加入菌糠,提升了堆肥腐熟度并減少污染氣體的排放,緩解了堆肥氮素流失的問題。硝化和反硝化是氮轉(zhuǎn)化過程的關(guān)鍵步驟,與其相關(guān)的功能基因常被選作分子標(biāo)記物來研究此復(fù)雜的生物學(xué)過程[8]。但目前對于添加填充劑對廚余垃圾的氮轉(zhuǎn)化功能基因的研究還較少。本試驗基于前人研究基礎(chǔ),挑選北方農(nóng)村常見易獲得的3種填充劑(鋸末、樹葉和玉米秸稈)進(jìn)行廚余垃圾的好氧堆肥試驗,探討添加不同填充劑后的農(nóng)村廚余垃圾堆肥的腐熟情況,以及堆肥過程中氮轉(zhuǎn)化及相關(guān)功能基因的變化,為研究農(nóng)村廚余垃圾的無害化處理與資源化利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 堆肥材料與裝置

試驗的堆肥原料為廚余垃圾,收集于西北農(nóng)林科技大學(xué)周邊的農(nóng)村和菜市場,鋸末、玉米秸稈和樹葉均采集于學(xué)校周邊農(nóng)戶和農(nóng)莊,鋸末呈粉末狀,樹葉和玉米秸稈晾干粉碎均勻至2～3 cm長度。堆肥原料的基本性狀如表1。

表1 堆肥原料的基本性狀Table1 Properties of compost raw materials

堆肥試驗在3個完全相同的密閉反應(yīng)器中進(jìn)行,反應(yīng)器設(shè)有曝氣裝置以滿足好氧體系,工作容積為75 L。

1.2 試驗設(shè)計與方法

設(shè)置3個處理分別是添加15%(濕重)[9-11]的鋸末、樹葉、玉米秸稈和85%的廚余垃圾,記為SD、FL和CS處理。將廚余垃圾與填充劑按比例混合并調(diào)節(jié)C/N至20∶1～30∶1,含水率約為60%。將堆料混合均勻后裝進(jìn)密閉堆肥反應(yīng)器中,各堆體質(zhì)量約為15 kg,保持堆肥通風(fēng)速率為0.35 L/(h·kg)(干質(zhì)量)[12],堆肥過程共持續(xù)40 d,于堆肥第5天進(jìn)行第1次翻堆,以后保持每7 d翻堆1次。

1.3 樣品采集與分析方法

根據(jù)堆體溫度的變化,在堆肥第0天、第2天、第10天、第21天、第40天進(jìn)行樣品采集。采集時從堆體的不同部位取出并混合均勻,采集的樣品分為兩部分,一部分存于4℃冰箱以便于理化指標(biāo)的分析,另一份經(jīng)冷凍干燥研磨后,儲存于-80℃冰箱,用于DNA提取。

1.3.1 NH3、N2O和理化指標(biāo)的測定 每日上午8:00利用硼酸吸收液對NH3進(jìn)行收集,再用標(biāo)準(zhǔn)H2SO4溶液滴定[13]。N2O用氣體采樣袋收集,使用氣相色譜儀(7890A,美國)測定[14]。每日利用溫度計對堆體及其環(huán)境溫度進(jìn)行多次測定。p H、電導(dǎo)率、NH+4-N和NO-3-N具體測定方法參考土壤農(nóng)化分析[15]。利用元素分析儀(VARIO MACRO cube,德國)測定樣品的總碳(TC)、總氮(TN)含量[16]。

1.3.2 DNA的提取和氮轉(zhuǎn)化功能基因的測定使用Fast DNA Spin Kit for Soil(MP Biomedicals,美國)對0.100 0 g的堆肥樣品進(jìn)行DNA的提取,利用Nanodrop 2000對提取的DNA進(jìn)行純度、濃度檢測,合格后保存于-20℃冰箱;通過實時定量PCR(qPCR)(Bio-Rad CFX Connect TM,USA)測 定amo A、nap A、nirS和nosZ基因豐度[17]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析和方差分析(LSD,P＜0.05),繪圖采用origin 2019,冗余分析采用Canoco 4.5。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理堆肥過程中堆體理化參數(shù)的變化

2.1.1 堆肥過程中溫度的變化 溫度可以評價好氧堆肥是否成功腐熟,并能直觀反映堆肥進(jìn)程[18]。各堆體溫度動態(tài)變化如圖1所示,堆肥開始后堆肥溫度快速上升后進(jìn)入高溫期(≥50℃)。SD、FL和CS處理分別在第5天、第5天和第3天進(jìn)入高溫期,隨后達(dá)到溫度峰值分別為61.2℃(14 d)、64.4℃(11 d)和67.9℃(11 d),并且高溫期分別維持7、10和11 d,滿足中國堆肥無害化標(biāo)準(zhǔn)(GB 7959-87),表明玉米秸稈和樹葉更有利于廚余垃圾堆肥腐熟。最后隨著生物可降解的有機物質(zhì)的消耗,堆體溫度逐漸下降到環(huán)境溫度水平[7],進(jìn)入腐熟階段直至堆肥結(jié)束。

2.1.2 堆肥過程中p H和電導(dǎo)率的變化 在整個堆肥過程中,3個處理的p H為4.70～9.15,總體呈現(xiàn)先下降后上升最終達(dá)到穩(wěn)定的趨勢(圖2)。堆肥初期,易降解有機物被微生物快速分解成小分子有機酸,導(dǎo)致堆體p H快速下降,促使升溫期NH3排放較低[19],因為較低的p H可以抑制堆肥NH3揮發(fā)。隨后有機酸揮發(fā)和NH3大量排放,導(dǎo)致p H迅速上升。堆肥后期,p H達(dá)到一個相對穩(wěn)定的狀態(tài)或略微下降,p H在8.47～9.15,滿足堆肥產(chǎn)品呈弱堿性的腐熟標(biāo)準(zhǔn)[20]。

電導(dǎo)率值反映堆肥基質(zhì)的鹽度,用來表明堆肥腐熟產(chǎn)品對植物生長的潛在毒性[21]。SD、FL和CS處理的電導(dǎo)率值峰值分別為2.86 mS/cm、2.17 mS/cm和2.62 mS/cm,因為易分解的有機物被微生物分解生成NH+4和H+等無機鹽類的離子。隨后電導(dǎo)率值快速下降,可能由礦物鹽沉淀和NH3大量揮發(fā)所導(dǎo)致[22]。堆肥結(jié)束時SD、FL、CS處理的電導(dǎo)率值分別為1.02 mS/cm、1.71 mS/cm和1.54 mS/cm,均小于無害化規(guī)定值3 mS/cm[23],表明添加填充劑的廚余垃圾堆肥產(chǎn)品施加到土壤中不會對植物生長產(chǎn)生負(fù)面影響。

2.1.3 堆肥過程中NH+4-N、NO-3-N、全氮和C/N的變化 由圖3可知,各處理NH+4-N含量均呈先上升后下降的趨勢。SD、FL和CS處理NH+4-N含量在堆肥開始后逐漸上升并達(dá)到峰值分別是407.71、389.01和376.89 mg/kg,可能由堆料中含氮有機物的分解和氨化作用所致[24]。隨著溫度的降低,硝化作用的增強和堆料中有機氮含量減少,各處理的NH+4-N含量均呈現(xiàn)下降趨勢直到堆肥結(jié)束[25]。堆肥結(jié)束時,相比于SD處理的NH+4-N含量,FL和CS處理分別顯著降低6.07%和15.65%(P＜0.05),并且FL和CS處理較低的NH+4-N含量有利于減少NH3排放[26]。

堆肥前期各處理的NO-3-N含量均呈下降趨勢,原因可能是堆肥初期反硝化細(xì)菌活性消耗了堆料的NO-3-N和高溫抑制了硝化細(xì)菌的活性使NO-3-N生成受限[27]。21 d后,溫度下降到適宜硝化細(xì)菌生存的范圍,大量的NH+4-N轉(zhuǎn)化為NO-3-N,導(dǎo)致NO-3-N含量的急速上升[28]。堆肥結(jié)束后,SD、FL和CS處理的NO-3-N含量分別為3.80、44.98和25.27 mg/kg。

各處理TN含量在整個堆肥過程中逐漸增加,堆肥結(jié)束時SD、FL和CS處理的TN含量增加至2.83%～3.13%,一方面可能由于在廚余垃圾堆肥中添加填充劑提高固氮微生物的活性,將更多的氮素固定在堆體中[29];另一方面,微生物的氨同化作用使NH+4-N和α-酮戊二酸在谷氨酸合成酶的作用下生成有機氮[30],同時α-酮戊二酸也是碳源代謝的中間產(chǎn)物,添加填充劑類似于外加碳源,提高堆體的碳源代謝速度,不僅促進(jìn)微生物的氨同化作用,而且大量的有機質(zhì)被消耗并以水蒸氣、CO2、CH4和有機酸等形式逸出造成堆體質(zhì)量的下降,進(jìn)而造成一種“濃縮現(xiàn)象”[31],當(dāng)干物質(zhì)的“濃縮效應(yīng)”大于氮素的礦化作用,就會產(chǎn)生全氮含量的增加。王秀娟等[32]利用雞糞和玉米秸稈進(jìn)行堆腐試驗,堆肥結(jié)束時全氮含量增加2.4倍;Guo等[33]用豬糞秸稈堆肥也得到類似的結(jié)果。FL處理保氮效果最好,可能由于樹葉的高碳含量改善了廚余垃圾堆肥的初始C/N,有利于降低氮素?fù)p失和NH3釋放[34],而CS處理可能由于較高的堆體溫度加速氮素?fù)p失,使得保氮效果顯著低于其余兩個處理(P＜0.05)。

C/N是評估堆肥腐熟度和穩(wěn)定性的重要指標(biāo)[35]。本研究中各處理的C/N均呈下降趨勢。一般最終C/N小于20認(rèn)為堆肥完全腐熟[36],本研究堆肥結(jié)束時SD、FL和CS處理的C/N分別為10.95、10.04和10.47,均滿足堆肥腐熟要求,且FL處理C/N顯著低于其余兩個處理,表明添加FL處理腐熟程度更高[37]。

2.2 堆肥過程中NH3和N2 O的排放

NH3是堆肥過程中產(chǎn)生的主要臭味化合物,是造成堆肥氮損失的主要原因[38]。由圖4可知,堆肥過程中,各處理NH3排放均呈快速升高然后降低再保持平穩(wěn)的趨勢,且集中在堆肥高溫期。SD、FL和CS處 理 的NH3排 放 峰 值 分 別 是622.51 mg/d(14 d),492.90 mg/d(11 d)和638.94 mg/d(12 d),SD處理NH3排放峰值最晚,可能與進(jìn)入高溫期時間晚和高溫期溫度低有關(guān)[39]。SD、FL和CS處理NH3累積排放量分別為3 444.82 mg/d、2 280.12 mg/d和2 405.57 mg/d,相較于SD和CS處理,FL處理分別減少33.81%和5.22%,表明添加樹葉的廚余垃圾堆肥具有最好的NH3減排效果。

N2O是一種造成氮損失的溫室氣體[10]。N2O的排放主要集中在堆肥前期,這與馬強等[40]在生活垃圾堆肥中添加腐熟污泥的研究結(jié)果一致。堆肥前期有機物快速降解,消耗了大量氧氣造成堆體的局部厭氧,以及原始堆料含有大量的NO-3-N,在反硝化菌群的作用下可以產(chǎn)生大量N2O[28]。SD、FL和CS處理的N2O的排放峰值分別為71.04 mg/d(3 d)、29.34 mg/d(4 d)和38.98 mg/d(7 d)。在整個堆肥過程中,SD、FL和CS處理的N2O累積排放量分別為335.80 mg/d、128.44 mg/d和181.15 mg/d,相較于SD和CS處 理,FL處 理 分 別 減 少61.75%和29.10%,由此可見,以樹葉作為填充劑對廚余垃圾堆肥過程中N2O減排效果最好,這與Xu等[11]發(fā)現(xiàn)15%的園林垃圾顯著減少了廚余垃圾堆肥過程中的N2O的排放結(jié)果 一致。

2.3 堆肥過程中與氮轉(zhuǎn)化功能基因的豐度變化

如圖5所示,本研究共定量了4個氮轉(zhuǎn)化功能基因(1種硝化基因amo A和3種反硝化基因nap A、nirS和nosZ),3種 反 硝 化 基 因 豐 度 均 高于硝化基因,表明本研究中反硝化作用的活性高于硝化作用。amo A基因編碼的氨單加氧酶(氨氧化細(xì)菌)可以將氨氧化生成羥胺,這是硝化反應(yīng)最重要的一步[41]。各處理的amo A基因進(jìn)入高溫期后,硝化細(xì)菌活性被抑制,導(dǎo)致amo A基因豐度下降[42],隨著溫度的逐漸下降,SD、FL和CS處理的amo A基因豐度在堆肥結(jié)束時達(dá)到峰值,分別為1.55×107copies/g、5.25×108copies/g和1.99×109copies/g,這與Yin等[43]報道的結(jié)果一致。FL處理的amo A基因在2 d和10 d均顯著高于其余處理,SD處理的amo A基因在15 d顯著低于其余兩個處理(P＜0.05),由此表明,以樹葉作為填充劑可能通過促進(jìn)NH+4-N的氨氧化過程,減少了NH3的排放(圖4)。但由于硝化反應(yīng)對N2O排放貢獻(xiàn)遠(yuǎn)小于反硝化反應(yīng),所以并沒有促進(jìn)N2O的排放[44]。

nap A、nirS和nosZ基因分別是編碼反硝化反應(yīng)中硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶和氧化亞氮還原酶的功能基因[45]。nap A、nirS和nosZ基因在堆肥過程中的豐度變幅分別是1.67×1010～1.54×1012copies/g,1.84×107～3.26×109copies/g和2.25×109～3.18×1011copies/g。在整個堆肥過程中,各處理的反硝化基因基本呈逐漸上升趨勢,除了SD處理以外,FL和CS處理的3種反硝化基因的峰值均出現(xiàn)在堆肥的降溫期和腐熟期,與王成[46]在豬糞好氧堆肥過程中添加生物炭后的反硝化功能基因變化情況相似。FL處理的3種反硝化基因,在第2天均顯著低于其余兩個處理(P＜0.05),第10天,SD處理的反硝化基因顯著高于與其余兩個處理(P＜0.05),這與N2O在堆肥前期的排放規(guī)律基本一致(圖4),由此可知,在廚余垃圾堆肥N2O排放的主要時期,鋸末的添加可能通過促進(jìn)堆肥過程中反硝化微生物的增長,從而增加了N2O的排放,而樹葉在一定程度上會抑制反硝化功能微生物,減少了N2O的排放。

2.4 堆肥過程中環(huán)境因素、氣體排放和氮轉(zhuǎn)化功能基因之間的相關(guān)性

利用冗余分析(RDA)來研究環(huán)境因素(溫度、p H、電導(dǎo)率、C/N、NH+4-N、NO3-N和TN),含氮氣體(NH3和N2O)與氮轉(zhuǎn)化功能基因之間的相關(guān)性(圖6)。RDA1和RDA2一共解釋了氮轉(zhuǎn)化功能基因變化的83.8%,其中C/N(27.99%)、p H(27.57%)和TN(26.28%)是影響氮轉(zhuǎn)化功能基因的主要因素。本研究中,amo A基因與硝化反應(yīng)的底物NH+4-N呈負(fù)相關(guān),與反硝化產(chǎn)物NO-3-N呈正相關(guān),這與Li等[47]在牛糞甘蔗渣共堆肥中添加脫硫石膏后的研究結(jié)果一致。nap A基因、nirS基因和nosZ基因與C/N呈負(fù)相關(guān),與p H和TN呈正相關(guān)。碳源、氮源是反硝化細(xì)菌生長過程中所必需的,但高C/N反而會抑制反硝化菌群的活性[48]。Baudoin等[49]發(fā)現(xiàn),氮源的增加會加速土壤的氮循環(huán)為反硝化菌提供厭氧呼吸底物。宋亞娜等[50]研究發(fā)現(xiàn)對稻田進(jìn)行短期氮肥施用后,nirS基因豐度明顯增加,由此可知,FL處理初始的高C/N和低TN含量可能是抑制廚余垃圾堆肥反硝化過程的主要原因。p H也被發(fā)現(xiàn)是影響反硝化基因群落特征的一個重要因素,當(dāng)p H超出最適范圍,會降低反硝化過程中還原酶的活性甚至使其失活[51]。Cuhel等[52]發(fā)現(xiàn)酸性條件下土壤中nirS型反硝化菌的種群豐度顯著降低。而本研究中,與其他處理相比較,堆肥初始,FL處理p H最低,并且相較于其他處理在升溫期顯著降低了堆體p H(P＜0.05)。NH+4-N、溫度和電導(dǎo)率值是影響NH3、N2O排放的主要因素,這與Xu等[11]發(fā)現(xiàn)顯著影響不同比例園林廢棄物與廚余垃圾堆肥過程中排放氣體的因素一致。NH+4-N作為生成含氮氣體的底物,Kader等[53]報道了溫度升高可造成有機物的快速降解并產(chǎn)生大量銨根離子(NH+4),增加NH3的釋放量。Yang等[54]在 堆肥中加入CaSO4后提高堆體電導(dǎo)率值,促進(jìn)NH+4與Ca2+發(fā)生陽離子交換,減少了含氮氣體的揮發(fā)。

3 結(jié)論

添加鋸末、樹葉和玉米秸稈均可使廚余垃圾堆肥成功進(jìn)行且達(dá)到無害化腐熟標(biāo)準(zhǔn)。相較于鋸末,添加樹葉和玉米秸稈延長了堆體高溫期,添加3種填充劑的堆肥產(chǎn)物的C/N差異顯著,添加樹葉可以使廚余垃圾堆肥腐熟效果更好,添加樹葉對廚余垃圾堆肥過程中NH3和N2O減排效果最好,在N2O排放的主要時期,顯著降低反硝化功能基因的豐度;同時相較于其余兩種填充劑,顯著增加了堆肥產(chǎn)品的全氮含量(P＜0.05)。RDA結(jié)果表明C/N、p H和TN是造成氮轉(zhuǎn)化功能基因差異的主要驅(qū)動因子。