意大利蜜蜂amPGI基因的克隆與表達(dá)分析

歐陽(yáng)霞輝,徐文凱,鄭相相,彭 帥,劉麗霞

(西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院,蘭州 730030)

葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(Glucose-6-phosphate isomerase,PGI)普遍存在于真核生物和原核生物中,是參與糖酵解途徑的一種重要的多功能酶,主要通過轉(zhuǎn)移碳位上的質(zhì)子催化葡萄糖-6-磷酸與果糖-6-磷酸的相互轉(zhuǎn)換[1]。PGI根據(jù)行使功能的不同,又稱神經(jīng)細(xì)胞素(Neuroleukin,NLK)、自分泌運(yùn)動(dòng)因子(Autocrine mobility factor,AMF)和分化成熟調(diào)節(jié)因子(Differentation and maturation mediator,DMM)[2-3]。PGI作為一種非常保守的酶[4],不僅參與糖代謝,還在動(dòng)物細(xì)胞中作為自分泌運(yùn)動(dòng)因子,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖浸潤(rùn),從而調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)因子活性[5-6]。由于PGI在生物體內(nèi)行使多種功能,所以該酶的基因缺陷可引起多種疾病[7]。

自首次從兔肌肉中分離PGI以來(lái),有關(guān)PGI的研究報(bào)道逐漸增加,研究對(duì)象廣泛,如人類、魚類、植物及微生物等[8]。有關(guān)哺乳動(dòng)物PGI的研究報(bào)道顯示,PGI與胚胎細(xì)胞和癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖密切相關(guān)。Kugler等[9]研究發(fā)現(xiàn)PGI基因缺失會(huì)導(dǎo)致老鼠胚胎死亡。趙亮[10]研究證實(shí)PGI在白血病細(xì)胞中高表達(dá),下調(diào)PGI基因后可抑制糖酵解途徑并引發(fā)細(xì)胞凋亡。王芬等[11]干擾PGI在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)后,MCF-7細(xì)胞的糖代謝和細(xì)胞增殖被抑制,從而加快細(xì)胞凋亡。在昆蟲中,對(duì)果蠅和桔小實(shí)蠅的初步研究發(fā)現(xiàn),PGI是一種重要的糖酵解酶,參與昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育過程中的能量代謝[12],同時(shí)還是幾丁質(zhì)生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一[13-14],在幾丁質(zhì)的形成中起重要作用[15]。

盡管國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)PGI已經(jīng)作了比較詳盡的研究,但有關(guān)昆蟲PGI基因的研究報(bào)道依然較少,對(duì)昆蟲PGI的了解有限,仍有很多問題尚待解決。本研究以重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲—意大利蜜蜂(Apis mellifera)為研究對(duì)象,對(duì)其PGI基因進(jìn)行克隆和分析,并進(jìn)一步檢測(cè)該基因在意大利蜜蜂不同品級(jí)不同發(fā)育階段的表達(dá)譜,明確該基因的分子結(jié)構(gòu)特征和表達(dá)模式,以期為進(jìn)一步闡明am PGI在意大利蜜蜂生長(zhǎng)與發(fā)育過程中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 取樣 意大利蜜蜂采自甘肅省蘭州市五泉王氏養(yǎng)蜂場(chǎng),采樣如下:工蜂取第2天的卵(G-2),第3天孵化期幼蟲(G-3),幼蟲期第5、7、9、11天的幼蟲(G-5、G-7、G-9、G-11),蛹期的預(yù)蛹(GY)、白眼蛹(G-B)、紅眼蛹(G-H),羽化成蟲(GC);雄蜂取第2天的卵(X-2),第3天孵化期幼蟲(X-3),幼蟲期第4、6、8、10、12天的幼蟲(X-4、X-6、X-8、X-10、X-12),蛹期的預(yù)蛹(X-Y)、白眼蛹(X-B)、紅眼蛹(X-H),羽化成蟲(X-C);蜂王取第2天的卵(W-2),第3天孵化期幼蟲(W-3),幼蟲期第4、5、6、7天的幼蟲(W-4、W-5、W-6、W-7),蛹期的預(yù)蛹(W-Y)、白眼蛹(W-B)、紅眼蛹(WH),羽化成蟲(W-C)。

1.1.2 試劑 Trizol購(gòu)自Invitrogen公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqDNA聚合酶、DNA Marker、克隆載體p MD18-T、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、TB Green Premix ExTaqⅡ(Tli RNase H Plus)均購(gòu)自大連寶生物工程公司;膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自索萊寶(北京)有限公司;引物合成和DNA序列測(cè)定由生工生物工程(上海)股份有限公司完成;其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA的合成 采用Trizol法提取80～110 mg組織樣品總RNA[16]。采用分光光度計(jì)測(cè)定RNA樣品的濃度及OD260nm/280nm值,并通過瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)RNA質(zhì)量。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptRTMaster Mix(Perfect Real Time)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為c DNA,于-20℃保存。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中PGI已有同源序列(XM_623549.6),利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1),以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為:上、下游引物各0.2μL,EXTaq酶5μL,模板0.5μL,最后用dd H2O補(bǔ)足至10μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性5 min,98℃變性10 s,50℃退火30 s,72℃延伸2 min 30 s,共30個(gè)循環(huán),72℃延伸10 min,4℃保存。經(jīng)瓊脂糖凝膠鑒定的目的片段利用膠回收試劑盒回收,且與p MD18-T載體連接,轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α,接種于LB平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)后,挑斑、搖菌,經(jīng)PCR擴(kuò)增驗(yàn)證目的基因的片段大小,提取重組質(zhì)粒p MD18-T-amPGI,送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)定,將正確的序列提交至GenBank。

1.2.3 序列分析 采用ORF finder搜索開放閱讀框,翻譯成氨基酸序列。采用DNAStar進(jìn)行序列同源性比對(duì),通過MEGA 5.0軟件基于NJ法 構(gòu) 建 系 統(tǒng) 進(jìn) 化 樹。采 用Protparam和ProtScale分析amPGI的理化性質(zhì)及親疏水性;利用SOPMA和SWISS-MODEL預(yù)測(cè)amPGI結(jié)構(gòu)。采用Interpro預(yù)測(cè)amPGI的保守結(jié)構(gòu)域;利用Motif Scan在線程序預(yù)測(cè)翻譯后修飾位點(diǎn)。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析意大利蜜蜂PGI表達(dá)模式 以意大利蜜蜂β-actin(登陸號(hào):NM_001185146.1)為內(nèi)參基因[17](引物序列見表1),使用Line Gene9660 qPCR儀進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)。以意大利蜜蜂不同品級(jí)不同時(shí)期樣品的cDNA為模板,每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反 應(yīng) 體 系(20μL)為:TB Green Premix ExTaqⅡ(Tli RNase H Plus)(2×)10 μL,上下引物各0.8μL,c DNA 2μL,RNase Free H2O 6.4μL;反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性1 min,95℃變性10 s,60℃退火30 s,40個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct法進(jìn)行基因相對(duì)表達(dá)量計(jì)算[18],應(yīng)用SPSS 21進(jìn)行單因素方差分析和多重比較,并利用GraphPad Prism 7軟件繪圖。

表1 引物序列Table1 Primer sequence

2 結(jié)果與分析

2.1 amPGI基因的克隆

經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增,最終獲得一條1 674 bp的目的條帶(圖1),經(jīng)克隆測(cè)序、比對(duì)鑒定,確定是意大利蜜蜂PGI基因序列,命名為amPGI,將序列提交GenBank,登錄號(hào)為MK713970。該序列包含一個(gè)1 674 bp的開放閱讀框,編碼一個(gè)由577個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。

2.2 amPGI同源性分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),意大利蜜蜂與大蜜蜂Apis dorsata(XP_006610643.1)、小蜜蜂Apis florea(XP_003690758.1)、美洲東部熊蜂Bombus impatiens(XP_003490330.1)、歐洲雄蜂Bombus terrestris(XP_003396233.1)、苜蓿切葉蜂Megachile rotundata(XP_003701061.1)、印度跳蟻Harpegnathos saltator(XP_011142877.1)、紅火蟻Solenopsis invicta(XP_025997003.1)、小火蟻Wasmannia auropunctata(XP_011696577.1)、茶翅蝽Halyomorpha halys(XP_014282603.1)的PGI的氨基酸序列相似度分別為96.3%、96.0%、90.1%、90.1%、85.7%、82.4%、80.3%、79.9%、62.5%,可見意大利蜜蜂amPGI與大蜜蜂PGI的序列相似度最高(圖2)。

基于NJ法對(duì)已報(bào)道的昆蟲PGI序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,結(jié)果顯示,意大利蜜蜂與大蜜蜂的親緣關(guān)系最近,并與其他幾種蜜蜂聚成一個(gè)大類,與茶翅蝽的關(guān)系比較遠(yuǎn),這與序列比對(duì)的結(jié)果和物種的實(shí)際進(jìn)化歷程相符,說(shuō)明PGI在進(jìn)化過程中非常保守(圖3)。

2.3 amPGI氨基酸序列理化特性、親疏水性預(yù)測(cè)與分析

Protparam分析結(jié)果顯示,amPGI分子質(zhì)量為62.97 ku,等電點(diǎn)(PI)為7.73,不穩(wěn)定指數(shù)為27.32,半衰期為30 h,同時(shí)含有57個(gè)負(fù)電荷氨基酸殘基(Asp+Glu)和58個(gè)正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys),為偏堿性的穩(wěn)定蛋白。amPGI蛋白含有20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸,亮氨酸(Leu)含量最多(11.0%),半胱氨酸(Cys)含量最低,僅占0.7%。

ProtScale的分析結(jié)果表明,amPGI蛋白為親水蛋白,且第324位的丙氨酸疏水性最強(qiáng)(Max=2.756),第445位的谷氨酸親水性最強(qiáng)(Min=-2.767)(圖4)。

2.4 amPGI蛋白結(jié)構(gòu)功能預(yù)測(cè)與分析

2.4.1 結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析 使用在線軟件SOPMA預(yù)測(cè)意大利蜜蜂amPGI蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu),其中α-螺旋(Alpha helix)占47.76%、β-轉(zhuǎn)角(Beta turn)占6.82%、延伸鏈(Extended strand)占14.00%、無(wú)規(guī)卷曲(Random coil)占31.42%。利用SWISS-MODEL在線軟件基于PDB數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)amPGI進(jìn)行同源建模(模板為4wmj.1.A),獲得amPGI蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型(圖5)。由三級(jí)結(jié)構(gòu)可知,α-螺旋占主導(dǎo)地位,與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

2.4.2 保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)與分析 利用Ex PASy的inter Pro在線程序預(yù)測(cè)意大利蜜蜂amPGI蛋白的保守結(jié)構(gòu)域,結(jié)果顯示該蛋白屬于糖磷酸異構(gòu)酶家族,為葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶,有2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域,其結(jié)構(gòu)域位點(diǎn)分別為127～289、337～528,表明該蛋白在生物進(jìn)化過程中高度保守。同時(shí)含有10個(gè)催化核心的活性位點(diǎn)(圖5),氨基酸位置分別為161I、163G、164S、213S、214K、215T、218T、275G、357Q、361E。

2.4.3 翻譯后修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)與分析 Motif Scan分析特定位點(diǎn)結(jié)果顯示:amPGI含有5個(gè)N-糖基化位點(diǎn);1個(gè)c AMP和cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn);4個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn);7個(gè)N-豆蔻?；稽c(diǎn);4個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)。

2.5 amPGI實(shí)時(shí)熒光定量PCR

amPGI基因在意大利蜜蜂不同品級(jí)、不同發(fā)育時(shí)期均有表達(dá),且差異顯著(P＜0.05)。在工蜂發(fā)育的各個(gè)時(shí)期中(圖6-A),卵前期和蛹期該基因表達(dá)量較低,幼蟲期5日齡其表達(dá)量最高,從卵期2日齡到幼蟲期5日齡和從蛹期到成蟲期其表達(dá)量逐漸增加。在雄蜂發(fā)育的各個(gè)時(shí)期中(圖6-B),卵期和蛹期該基因表達(dá)量較低,成蟲期其表達(dá)量最高,從卵期2日齡到幼蟲期4日齡和從紅眼蛹期到成蟲期其表達(dá)量逐漸增加。在蜂王發(fā)育的各個(gè)時(shí)期中(圖6-C),卵前期和蛹期該基因表達(dá)量較低,幼蟲期6日齡其表達(dá)量最高,從卵期2日齡到卵期3日齡其表達(dá)量逐漸增加,且幼蟲期4日齡與卵期3日齡其表達(dá)量無(wú)差異,同時(shí)從蛹期到成蟲期其表達(dá)量也逐漸增加。

意大利蜜蜂不同品級(jí)、不同發(fā)育時(shí)期該基因表達(dá)情況對(duì)比分析結(jié)果表明(圖7),不同品級(jí)從卵期到幼蟲期第1天(卵的孵化階段)、從蛹期到成蟲期(蛹的羽化階段)該基因表達(dá)量都急劇增加。此外,不同品級(jí)卵前期和蛹期該基因表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定。

3 討論

PGI既催化糖代謝,又參與幾丁質(zhì)(也稱甲殼素)合成,其中糖代謝提供機(jī)體所需的大量能量,幾丁質(zhì)則在昆蟲外骨骼的形成中發(fā)揮著重要作用[15,19-20]。PGI是由單一基因位點(diǎn)編碼的關(guān)鍵蛋白酶,該基因缺失或功能異常會(huì)導(dǎo)致機(jī)體死亡,如該基因缺失可導(dǎo)致老鼠胚胎死亡[9]。目前對(duì)PGI的研究主要集中于高等動(dòng)物、魚類、植物以及微生物[21],而在蜜蜂等昆蟲類動(dòng)物中還鮮有報(bào)道。

在桔小實(shí)蠅中,PGI基因高表達(dá)于脂肪體和馬氏管[15],而脂肪體是昆蟲中大分子有機(jī)物(糖類、蛋白類)代謝的關(guān)鍵位置[22],另外發(fā)現(xiàn),PGI還是節(jié)肢動(dòng)物中一種重要的適應(yīng)性分子標(biāo)記[23]。本研究克隆得到意大利蜜蜂am PGI基因,其編碼區(qū)全長(zhǎng)1 674 bp,編碼557個(gè)氨基酸,且amPGI與大蜜蜂的親緣關(guān)系最近,序列相似度達(dá)到96.3%。半衰期越長(zhǎng)蛋白結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定,不穩(wěn)定指數(shù)小于40為穩(wěn)定蛋白[24],且α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角化學(xué)鍵鍵能較高,不易變性,能夠維持蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu),意大利蜜蜂amPGI蛋白半衰期為30 h,不穩(wěn)定指數(shù)小于40,同時(shí)α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角總占比達(dá)54.58%,說(shuō)明amPGI是一種穩(wěn)定蛋白。已知蛋白質(zhì)翻譯后修飾有400多種[25],是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的重要方式[26],其中磷酸化和去磷酸化過程調(diào)控著細(xì)胞的增殖分化和新陳代謝[27],am PGI存在9個(gè)磷酸化位點(diǎn),同時(shí)保守結(jié)構(gòu)域發(fā)揮著重要作用,是蛋白的核心,2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域內(nèi)包含10個(gè)催化核心的活性位點(diǎn),且161I、163G、164S、213S和214K處在疏水區(qū)域的分子內(nèi)部,說(shuō)明其在意大利蜜蜂的發(fā)育過程中可能與細(xì)胞增殖分化的能量代謝有關(guān)。

為進(jìn)一步探討amPGI在意大利蜜蜂生長(zhǎng)發(fā)育過程中的生物學(xué)功能,檢測(cè)并分析該基因在意大利蜜蜂不同品級(jí)、不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況。幼蟲期和成蟲期是昆蟲運(yùn)動(dòng)、營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)化和快速發(fā)育的關(guān)鍵階段,且有研究發(fā)現(xiàn)果蠅幼蟲的生長(zhǎng)依賴于一種類似哺乳動(dòng)物瓦氏效應(yīng)的有氧糖酵解形式[12],意大利蜜蜂不同品級(jí)、不同發(fā)育時(shí)期的幼蟲期和成蟲期該基因表達(dá)量大體上都比卵前期和蛹期高,推測(cè)這兩個(gè)階段利用糖酵解途徑合成所需的大量能量,這與陳力[15]研究結(jié)果頗為相似。此外,桔小實(shí)蠅不同發(fā)育時(shí)期PGI基因的表達(dá)與幾丁質(zhì)含量變化具有顯著線性相關(guān)性[15],推測(cè)其利用幾丁質(zhì)合成途徑合成生長(zhǎng)發(fā)育所需的幾丁質(zhì)。不同發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn)變時(shí)細(xì)胞活力會(huì)迅速增強(qiáng)[28],對(duì)ATP、氨基酸和核苷酸等大分子物質(zhì)需求量增加,從而會(huì)提高糖酵解和幾丁質(zhì)合成速率,不同品級(jí)卵的孵化和蛹的羽化過程中該基因表達(dá)量都急劇增加,以適應(yīng)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育過程中的代謝需求。

工蜂屬于生殖器官發(fā)育不完善的雌性,相比雄蜂和蜂王,工蜂成蟲中amPGI可能主要參與幾丁質(zhì)的合成。工蜂發(fā)育的各個(gè)時(shí)期中成蟲期該基因表達(dá)量較高,但明顯低于雄蜂和蜂王成蟲期的表達(dá)。雄性原始生殖細(xì)胞的增殖、精子的超活化以及精卵結(jié)合都受益于糖酵解[29],且抑制糖酵解及其相關(guān)蛋白酶的活性會(huì)影響雄性原始生殖細(xì)胞的增殖,并導(dǎo)致精子功能異常[30-31],在雄蜂發(fā)育的各個(gè)時(shí)期中成蟲期該基因高表達(dá),推測(cè)糖酵解在雄蜂精巢的成熟過程中發(fā)揮著重要作用。卵母細(xì)胞可吸收來(lái)自于卵丘細(xì)胞糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸,并以此作為能量物質(zhì)促進(jìn)卵母細(xì)胞的分裂和卵子的形成[32-33],且體外培養(yǎng)的高表達(dá)糖酵解相關(guān)酶的卵子質(zhì)量更佳[34],在蜂王發(fā)育的各個(gè)時(shí)期中成蟲期該基因表達(dá)量與雄蜂成蟲期相當(dāng),由此可知am PGI基因在蜂王卵巢及卵子的發(fā)育過程中具有重要作用。

本研究預(yù)測(cè)分析amPGI蛋白的理化性質(zhì)及生物學(xué)功能,同時(shí)檢測(cè)并分析am PGI基因在意大利蜜蜂不同品級(jí)、不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況,以期為進(jìn)一步闡明amPGI在意大利蜜蜂生長(zhǎng)與發(fā)育過程中的功能奠定基礎(chǔ),為糖酵解、幾丁質(zhì)合成等相關(guān)通路的研究提供理論依據(jù)。