S1P對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠caspase-3、ERK及肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的影響

李點(diǎn) 鄭正 江葉舟

(湖南省胸科醫(yī)院綜合科，湖南 長(zhǎng)沙 410003)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是呼吸系統(tǒng)疾病中的常見(jiàn)病和多發(fā)病，具有較高的患病率和病死率，對(duì)社會(huì)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，已成為重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1-2]。COPD又稱(chēng)為慢阻肺，是一種可以預(yù)防和治療的疾病，主要特征為持續(xù)性氣流受到限制，在肺部主要表現(xiàn)為進(jìn)行性發(fā)展的不完全性氣流受限，并且和香煙煙霧等有害氣體的吸入有密切關(guān)系，其中吸入香煙煙霧也是導(dǎo)致COPD最重要的發(fā)病因素[3]。肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(Pulmonary vascular smooth muscle cells, PASMCs)是肺血管的重要組成部分，增加肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡可以逆轉(zhuǎn)肺動(dòng)脈高壓肺血管重建[4]。有研究表明，COPD的全身、局部炎癥及缺氧等因素均可導(dǎo)致PASMCs的增殖和凋亡[5]。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)介導(dǎo)著細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程，在凋亡過(guò)程中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)是最關(guān)鍵的蛋白酶，增加caspase-3蛋白的表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[6]。1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine1-phosphate,SIP)是一類(lèi)真核生物體內(nèi)天然存在的具有生物活性的細(xì)胞膜鞘類(lèi)脂質(zhì)代謝中間產(chǎn)物[7]。有研究證實(shí)S1P介導(dǎo)著多種生物學(xué)過(guò)程，其不僅可以和細(xì)胞表面特定的受體相互結(jié)合，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、血管再生和免疫細(xì)胞遷移等，另外，其也可以作為細(xì)胞的第二信使調(diào)節(jié)Ca2+穩(wěn)態(tài)、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖等作用[8]。有研究發(fā)現(xiàn)S1P可通過(guò)促進(jìn)下游ERK信號(hào)傳導(dǎo)而引起細(xì)胞增殖反應(yīng)[9]。FTY720為S1P受體激動(dòng)劑芬戈莫德，其廣泛應(yīng)用于臨床，在結(jié)構(gòu)上與S1P具有相似性，且本身并不能被S1P受體識(shí)別，可以變相的增強(qiáng)S1P的生物學(xué)功能[10]。本研究通過(guò)應(yīng)用FTY720對(duì)COPD大鼠進(jìn)行處理，觀察S1P信號(hào)對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞及caspase-3和ERK蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用12周的清潔級(jí)健康雄性SD大鼠60只，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，體重200～220 g，所有大鼠無(wú)特定病原體，均飼養(yǎng)在同溫度、同濕度的環(huán)境中，自由飲水，普通飼料飼養(yǎng)16周。本研究遵守動(dòng)物倫理要求，并經(jīng)湖南省胸科醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 試劑和儀器 分戈莫德(FTY720)購(gòu)自美國(guó)Selleck公司；黃果樹(shù)香煙購(gòu)自貴州中煙工業(yè)公司；兔抗大鼠ERK和caspase-3抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；Tunel試劑盒購(gòu)自Roche公司；β-actin單抗購(gòu)自武漢谷歌生物科技有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自天津泰斯特公司；圖像分析軟件購(gòu)于寧波江豐生物信息技術(shù)有限公司。

1.3 動(dòng)物分組和模型建立 將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、COPD組和S1P組。采用煙霧暴露聯(lián)合脂多糖氣管內(nèi)滴注的方法建立COPD大鼠模型，把模型組和S1P組大鼠均置于動(dòng)物煙熏箱進(jìn)行煙熏(煙熏箱中煙霧濃度保持在450～500 bpm，持續(xù)30 min，間隔3 h煙熏1次，每12 h更換煙盒1次)，并氣管內(nèi)滴注脂多糖0.2 mg/kg，每日1次，持續(xù)12周。分別于第1天和第84天，稱(chēng)取COPD組和S1P組大鼠體質(zhì)量，采用Wistar大鼠肺功能檢測(cè)儀檢測(cè)呼吸峰流速、呼氣峰流量和每分鐘通氣量，當(dāng)以上指標(biāo)下降程度超過(guò)30%時(shí)即為COPD模型成功。

建模成功后，S1P組大鼠每天給予10 mg/kg FTY720灌胃給藥，隔天1次，每周3次。對(duì)照組和COPD組大鼠每天給予等量的生理鹽水灌胃，每周3次。在給藥前對(duì)大鼠進(jìn)行乙醚氣道麻醉，操作時(shí)動(dòng)作輕柔，避免對(duì)大鼠造成損傷，增加大鼠感染及病死率。

1.4 標(biāo)本采集 測(cè)定大鼠收縮壓后，麻醉所有大鼠并處死，取出右肺組織，保存在-80℃的冰箱中備用。一部分用于HE染色，另一部分用于蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)。

1.5 肺功能檢測(cè) 每千克大鼠腹腔注射40 mg的戊巴比妥鈉麻醉，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，維持平靜呼吸3 min并連接Maclab 數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，3 min后給予一定氣量充氣模仿深呼吸，利用危機(jī)處理計(jì)算大鼠肺功能指標(biāo)。

1.6 右心室收縮壓(RVSP)的測(cè)定 每千克大鼠腹腔注射40 mg的戊巴比妥鈉麻醉，在大鼠右側(cè)頸外靜脈插入聚乙烯導(dǎo)管直到肺動(dòng)脈干，穩(wěn)定10 min后，采用YP101型壓力轉(zhuǎn)換傳感器及YSD4-G型生理記錄儀檢測(cè)大鼠平均肺動(dòng)脈壓力，以mmHg來(lái)表示(1 mmHg=0.133 kPa)。

1.7 右心室肥大指數(shù)(RVMI)測(cè)定 測(cè)定右心室RVSP值后，將大鼠放血處死，迅速開(kāi)胸取出心臟及肺組織。沿房室交界處除去左右心房以及周?chē)笱?，留取右心?RV)以及左心室和室間隔(LV+S)，采用濾紙吸干組織中多余的水分并經(jīng)電子天平分別稱(chēng)取質(zhì)量，計(jì)算RV質(zhì)量與LV+S質(zhì)量的比值，即為RVMI值。

1.8 HE染色檢測(cè)肺組織病理形態(tài) 將處死的大鼠左肺組織采用大頭針固定在泡沫板上，并用手術(shù)刀在距離肺的尖部0～5 cm處切取肺組織，并將組織固定在中性甲醛中24 h，取出后，經(jīng)乙醇脫水、石蠟包埋、切片后，再進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組肺血管形態(tài)。另取直徑為100 μm左右的肺動(dòng)脈，采用ICM-102細(xì)胞圖像分析軟件對(duì)其形態(tài)進(jìn)行定量統(tǒng)計(jì)，以血管壁橫斷面積占血管橫斷面積的比值(WA，%) 作為衡量低氧肺血管重構(gòu)的指標(biāo)。

1.9 TUNEL檢測(cè)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的凋亡 按照羅氏公司提供的TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，將大鼠左側(cè)肺組織進(jìn)行石蠟包埋、切片后加入20 μg/mL蛋白酶K，0.3%雙氧水及0.1%TritonX-100，而后加入TUNEL反應(yīng)液，加入標(biāo)記熒光素抗體的HRP封閉以及DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行鏡檢。在顯微鏡下隨機(jī)選取直徑在100 μm左右的肺動(dòng)脈，統(tǒng)計(jì)500個(gè)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中凋亡細(xì)胞數(shù)，得出細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)，AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.10 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)COPD大鼠caspase-3和p-ERK蛋白表達(dá) 將3組大鼠的肺組織分別提取100 mg，將細(xì)胞進(jìn)行裂解并提取核蛋白，并對(duì)核蛋白的濃度進(jìn)行測(cè)量，分裝后，保存在零下20攝氏度的環(huán)境中。將提取出的蛋白溶液和緩沖溶液進(jìn)行混均，按照4∶1比例進(jìn)行，然后將蛋白液煮沸使其變性。在電泳板內(nèi)分別注入50 μm的蛋白樣品，把電泳后的樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，加入脫脂奶粉，并進(jìn)行封閉，時(shí)常為1 h。加入1抗后進(jìn)行TTBS漂洗，每次漂洗10 min，一共進(jìn)行3次漂洗，最后加入2抗對(duì)溶液進(jìn)行稀釋?zhuān)僭诔氐沫h(huán)境中封閉1 h。取出PVDF膜，TTBS漂洗10 min×3，DAB顯色后數(shù)碼相機(jī)照相。

2 結(jié)果

2.1 COPD大鼠肺功能 對(duì)照組大鼠肺功能FEV0.3/FVC、Cdyn值高于COPD組，RI值低于COPD組(P<0.05)；與COPD組相比，S1P組FEV0.3/FVC、Cdyn值顯著升高，RI值明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠肺功能比較

2.2 3組大鼠RVSP與RVMI比較 與對(duì)照組大鼠相比，COPD組大鼠RVSP值顯著升高，干預(yù)后的S1P組大鼠RVSP值得到了明顯的降低，且低于COPD組(均P<0.05)；與對(duì)照組相比，COPD組大鼠RVMI值顯著升高(P<0.05)；與COPD組相比，S1P組大鼠RVMI明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 3組大鼠RVSP值測(cè)定結(jié)果比較

2.3 3組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)比較 與對(duì)照組相比，COPD組大鼠肺動(dòng)脈組織中膜明顯變厚，肺血管生成明顯，內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)損傷甚至脫落；干預(yù)后的S1P組大鼠肺組織得到了明顯的改善，見(jiàn)圖1。

圖1 肺組織HE染色(200×)

2.4 3組大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡比較 與對(duì)照組相比，COPD組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞形體完整，基本無(wú)固縮；與COPD組相比，S1P組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞出現(xiàn)大量的固縮，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡，見(jiàn)圖2。對(duì)照組、COPD組及S1P組大鼠的AI指數(shù)分別為(12.7±0.58)%，(1.23±0.22)%和(32.4±0.76)%，COPD組大鼠的AI指數(shù)明顯低于對(duì)照組，S1P組AI指數(shù)顯著高于S1P組(均P<0.05)。

圖2 肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡(200×)

2.5 3組大鼠caspase-3和p-ERK蛋白表達(dá) 與對(duì)照組大鼠相比，COPD組大鼠肺組織中caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高，p-ERK蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與COPD組相比，S1P組大鼠肺組織中caspase-3蛋白得到了顯著的抑制，且p-ERK蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 3組大鼠caspase-3和p-ERK蛋白表達(dá)比較

3 討論

COPD主要是由長(zhǎng)期氣道阻塞導(dǎo)致患者肺泡缺氧和二氧化碳潴留，進(jìn)而引起肺血管收縮、肺血管重構(gòu)等臨床癥狀，嚴(yán)重的可導(dǎo)致肺動(dòng)脈高血壓癥、右心衰竭癥甚至死亡[11]。慢性炎癥、低氧或缺氧等癥狀均可導(dǎo)致肺血管重塑，且肺血管重塑是導(dǎo)致COPD進(jìn)一步惡化的關(guān)鍵因素[12]。低氧導(dǎo)致肺內(nèi)高血壓，從而促進(jìn)肺動(dòng)脈纖維母細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的的促有絲分裂因子、生長(zhǎng)因子的釋放，而這些因子的釋放進(jìn)一步促進(jìn)平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的增殖并進(jìn)一步刺激細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，導(dǎo)致肺動(dòng)脈血管壁增厚，加重氣道阻塞[13]。肺動(dòng)脈高壓是以肺動(dòng)脈壓力以及肺部血管阻力升高為特點(diǎn)的病理生理綜合征，其主要病理機(jī)制為血管收縮、血管重塑，導(dǎo)致右心室負(fù)荷增加，右心衰竭[14]。RVSP、RVMI是反映肺動(dòng)脈及血管重塑的指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，COPD組大鼠肺功能FEV0.3/FVC、Cdyn值明顯降低，RI值明顯升高；且RVSP和RVMI明顯較對(duì)照組也明顯升高；干預(yù)后的S1P組FEV0.3/FVC、Cdyn值顯著升高，RI值明顯降低；且RVSP和RVMI明顯均得到了顯著的抑制，這也印證了以往的研究[15]。COPD患者肺動(dòng)脈管增厚明顯，管腔明顯變窄，本研究結(jié)果也證實(shí)了這一病理變化。

肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞在胚胎血管發(fā)育期為合成表型，處于增殖狀態(tài)；而出生后該細(xì)胞由合成表型轉(zhuǎn)為收縮型，處于靜止?fàn)顟B(tài)，主要維持肺部血管的張力和正常血管構(gòu)型。當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)低氧等刺激時(shí)，該細(xì)胞則又轉(zhuǎn)化為合成表型，從而進(jìn)入增殖狀態(tài)。有研究表明，COPD患者平滑肌細(xì)胞增加數(shù)量高于非COPD患者[16-17]。本研究結(jié)果也證實(shí)，COPD大鼠血管壁增厚、TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)少于正常對(duì)照組，COPD大鼠AI明顯低于對(duì)照組，這些結(jié)果均證實(shí)COPD鼠存在明顯的血管壁增厚、平滑肌細(xì)胞增殖現(xiàn)象。S1P脂質(zhì)具有一定的多效性，參與多種生理、病理過(guò)程，包括血管生成、細(xì)胞的增殖和遷移，炎癥細(xì)胞的運(yùn)輸，細(xì)胞因子的產(chǎn)生、細(xì)胞骨架重組、內(nèi)皮屏障調(diào)節(jié)血管張力控制等[18-19]。本研究證實(shí)，S1P可有效抑制COPD大鼠平滑肌細(xì)胞增殖，改善RVSP、RVMI和肺功能，進(jìn)而改善肺血管重塑；同時(shí)，其還能有效的促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的凋亡，由此推測(cè)S1P改善COPD大鼠肺動(dòng)脈高壓的作用可能與其促進(jìn)平滑肌細(xì)胞凋亡的作用有關(guān)。蔡學(xué)定等[20]研究證實(shí)，姜黃素可能通過(guò)抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β軸，改善低氧誘導(dǎo)的PASMCs異常增殖，HPH大鼠肺血管重塑和右心肥大，降低肺動(dòng)脈壓力。陳廷偉等[21]通過(guò)對(duì)COPD大鼠研究發(fā)現(xiàn)，S1P可能參與COPD大鼠肺部炎癥的進(jìn)程。

ERK介導(dǎo)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生物學(xué)過(guò)程，阻斷ERK通路的激活，可促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[22]。ERK上游的蛋白會(huì)磷酸化ERK，活化后P-ERK會(huì)作用于細(xì)胞漿內(nèi)多種信號(hào)分子，P-ERK也會(huì)直接進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)而作用于轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[23]。本研究結(jié)果顯示，COPD組大鼠p-ERK蛋白的表達(dá)明顯降低，其活性被明顯抑制。Caspase-3是caspase家族中級(jí)聯(lián)反應(yīng)最關(guān)鍵的一種蛋白酶，caspase-3正常情況下在細(xì)胞質(zhì)中沒(méi)有活性，當(dāng)其被凋亡信號(hào)激活后，caspase-3被分裂為兩個(gè)亞基，進(jìn)而結(jié)合為四聚體成為有活性的酶，活化后的caspase-3會(huì)對(duì)不同的底物進(jìn)行切割，讓DNA發(fā)生裂解，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[24]。本研究結(jié)果顯示，COPD組大鼠的caspase-3蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組，給予COPD大鼠1-磷酸鞘氨醇受體激活劑芬戈莫德灌胃處理后，大鼠的caspase-3表達(dá)得到抑制，同時(shí)ERK蛋白的表達(dá)被激活，提示S1P可有效的抑制COPD大鼠caspase-3表達(dá)，激活ERK蛋白活性。趙龍等[25]研究發(fā)現(xiàn)，1-磷酸鞘氨醇可通過(guò)抑制肺組織細(xì)胞凋亡進(jìn)而影響肺氣腫的形成，進(jìn)一步改善COPD患者的癥狀及病理改變，其機(jī)制可能與S1P信號(hào)激活S1P/Akt/ERK信號(hào)通路有關(guān)。

4 結(jié)論

S1P可抑制COPD大鼠caspase-3蛋白表達(dá)，激活ERK蛋白，對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的凋亡有一定的促進(jìn)作用。但本研究也有一定局限性，COPD是多方面作用的結(jié)果，涉及多條信號(hào)通路，而其對(duì)信號(hào)通路是否有作用，有什么樣的作用仍需要后續(xù)深入研究。