高效液相色譜法測定氧化型染發(fā)產(chǎn)品中2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚及其硫酸鹽的含量

邸 錚,楊 玲,賈伯陽,杜 勇,左 雪,張 蓉,鄔國慶

(北京市藥品檢驗研究院,北京 102206)

2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚是氧化型染發(fā)產(chǎn)品的常用成分,通常以硫酸鹽的形式存在,結構式見圖1。在染發(fā)產(chǎn)品的典型配方中,前體物質(如對苯二胺)被氧化劑(如過氧化氫)激活,形成有活性的亞氨基-亞胺離子前體,再與2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚或其硫酸鹽結合,形成新的化合物,進而改變頭發(fā)的顏色,其中2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚及其硫酸鹽起到“偶聯(lián)劑”的作用[1]。目前,2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚及其硫酸鹽在染發(fā)產(chǎn)品中應用廣泛,是染發(fā)領域研究的熱點。

圖1 2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚硫酸鹽的結構式Fig.1 Structure of 2-amino-4-hydroxyethylaminoanisole sulfate

美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)公布的信息顯示,2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚硫酸鹽在94種染發(fā)產(chǎn)品中的質量分數(shù)為0.008%～1.5%(稀釋前最高為3%)[1];歐盟和我國《化妝品安全技術規(guī)范》(2015年版)中規(guī)定,該物質在用于氧化型染發(fā)劑時,其最大使用量為1.5%[2-3]。2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚是一種仲胺,容易發(fā)生亞硝化反應,生成可能致癌的N-亞硝胺[1],并且有文獻報道,2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚硫酸鹽是一種罕見的新型接觸性過敏原[4]。因此,加強對氧化型染發(fā)產(chǎn)品中2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚及其硫酸鹽的監(jiān)測十分必要。

測定染發(fā)產(chǎn)品中化合物的常見方法有高效液相色譜法(HPLC)[5-7]和液相色譜-串聯(lián)質譜法[8-9],但是關于測定2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚及其硫酸鹽的報道較少,因此建立2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚及其硫酸鹽的測定方法,對于補充染發(fā)產(chǎn)品的監(jiān)測種類具有重要意義。

2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚及其硫酸鹽在液相色譜上均以不含鹽的游離態(tài)形式出峰,且具有明顯的光譜吸收特征,但其水溶液的穩(wěn)定性較差,在液相分析過程中,很容易隨著分析時間的延長,氧化分解出大量雜質,影響定量結果的準確性?；诖?本工作通過研究不同抗氧化劑對2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚分解速率的影響,建立了HPLC測定氧化型染發(fā)產(chǎn)品中2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚及其硫酸鹽含量的方法,并采用高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(HPLCMS/MS)對結果進行確證,為含此類化合物的染發(fā)產(chǎn)品的質量控制提供了依據(jù)。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

1260型高效液相色譜儀,配二極管陣列檢測器;QTRAP 5500 型高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀;CP255D 型電子分析天平;KQ-500 型超聲波清洗器;Milli-Q 型超純水系統(tǒng)。

磷酸鹽緩沖溶液:稱取十二水合磷酸氫二鈉3.6 g、磷酸二氫鉀5.6 g,用水溶解并定容至1 L,充分混勻,用0.22μm 微孔濾膜過濾,備用。

L-半胱氨酸溶液:稱取L-半胱氨酸0.25 g,用水溶解并定容至100 mL,配制成2.5 g·L－1L-半胱氨酸溶液。

提取劑:2.5 g·L－1半胱氨酸溶液與無水乙醇按體積比3∶7進行混合,備用。

2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚標準儲備溶液:稱取2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚25.31 mg,置于25 mL棕色容量瓶中,用提取劑溶解并稀釋至刻度,搖勻,配制成0.992 2 g·L－12-氨基-4-羥乙氨基茴香醚標準儲備溶液,于4℃保存。使用時,用提取劑稀釋至所需質量濃度。

2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚的純度為98%;乙腈、乙酸銨為色譜純;十二水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、L(＋)-抗壞血酸、L-半胱氨酸、亞硫酸氫鈉均為分析純;無水乙醇為優(yōu)級純;試驗用水為超純水。

樣品均為市售氧化型染發(fā)產(chǎn)品,包含染發(fā)膏和氧化乳兩種劑型。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 HPLC

Waters Atlantis?T3 MV Kit色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm);柱溫35 ℃;進樣量5μL;流動相A 為含10%(體積分數(shù),下同)乙腈的磷酸鹽緩沖溶液,B 為乙腈;流量1.0 mL·min－1;檢測波長304 nm。梯度洗脫程序:0～16.0 min時,A 為100%;16.0～16.1 min 時,A 由100%降 至25%,保持8.9 min;25.0～26.0 min時,A 由25%升至100%,保持14.0 min。

1.2.2 HPLC-MS/MS

1)色譜條件 Waters Atlantis?T3 色譜柱(100 mm×2.1 mm,3μm);柱溫30 ℃;進樣量2μL;流動相A 為10 mmol·L－1乙酸銨溶液,B為乙腈;流量0.5 mL·min－1。梯度洗脫程序:0～2.0 min時,A 為100%;2.0～8.0 min 時,A 由100%降至80%;8.0～12.0 min時,A 由80%降至5%,保持3.0 min。

2)質譜條件 電噴霧離子(ESI)源,正離子模式;離子源溫度550℃;電離電壓5 500 V;氣簾氣壓力207 k Pa,碰撞氣壓力選擇中等,霧化氣壓力379 k Pa,輔助氣壓力345 k Pa;多反應監(jiān)測(MRM)模式。二級質譜參數(shù)見表1,其中“*”為定量離子。

表1 二級質譜參數(shù)Tab.1 MS/MS parameters

1.3 試驗方法

稱取染發(fā)膏0.5 g(精確至0.001 g)于比色管中,加入適量提取劑,渦旋30 s,超聲15 min,冷卻后再用提取劑定容至10 mL,充分混勻,經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾,濾液供HPLC 分析,再用甲醇將其稀釋至適當質量濃度后,采用HPLC-MS/MS進行分析確證。

2 結果與討論

2.1 色譜行為

按照儀器工作條件對100 mg·L－12-氨基-4-羥乙氨基茴香醚標準溶液和供試品溶液分別進行測定,所得色譜圖見圖2。

圖2 色譜圖Fig.2 Chromatograms

2.2 檢測波長的選擇

采用二極管陣列檢測器,在檢測波長為210～400 nm 時對100 mg·L－12-氨基-4-羥乙氨基茴香醚標準溶液進行掃描,結果見圖3。

圖3 2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚的紫外吸收Fig.3 UV absorption of 2-amino-4-hydroxyethylaminoanisole

結果顯示,2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚在254,304 nm 處均有紫外吸收,考慮到大部分染發(fā)劑組分在210～280 nm 內有紫外吸收,為了避免其他雜質峰的干擾,試驗選擇檢測波長為304 nm。

2.3 流動相的選擇

在前期研究的基礎上[6],參考文獻[10],考察了不同流動相體系(乙腈-乙酸銨溶液、磷酸鹽緩沖溶液-乙腈)對2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚與其他30余種染發(fā)劑組分分離效果的影響。

結果顯示:當以10%乙腈溶液-20 mmol·L－1乙酸銨溶液體系為流動相時,目標物與2-氨基-6-氯-4-硝基苯酚、2-硝基對苯二胺兩種組分無法完全分離;增加乙酸銨溶液的比例,目標物出峰時間延長,并且2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚的分解產(chǎn)物會影響對氨基苯酚和羥乙基對苯二胺兩種組分的分離和定量;當以含10%乙腈的磷酸鹽緩沖溶液-乙腈體系為流動相時,目標物僅與2-硝基對苯二胺無法分離。由于2-硝基對苯二胺是氧化型染發(fā)產(chǎn)品中的禁用成分,一般不會影響2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚的定量,因此試驗選擇以含10%乙腈的磷酸鹽緩沖溶液-乙腈體系為流動相,梯度洗脫程序見1.2.1節(jié)。

2.4 抗氧化劑的選擇

2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚水溶液的穩(wěn)定性較差,測定時容易被氧化分解出大量雜質,影響測定結果的準確性。試驗結果表明,添加抗氧化劑,可以改善2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚的化學穩(wěn)定性。常用的抗氧化劑有亞硫酸氫鈉、抗壞血酸、巰基乙酸鹽、半胱氨酸等,其原理都是在遇到空氣時,上述抗氧化劑優(yōu)先被氧化,消耗掉空氣中的氧氣,達到保護目標物免于被氧化的目的[11]。在100 mg·L－12-氨基-4-羥乙氨基茴香醚標準溶液中加入含有0.02 mol·L－1抗氧化劑的乙醇溶液,放置0,3,6,8,10,12,16,18,20,24 h進行測定,考察了L(＋)-抗壞血酸、L-半胱氨酸、亞硫酸氫鈉為抗氧化劑時對2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚保留率(不同時段測定值占初始質量濃度的百分數(shù))的影響。

結果表明:當不加抗氧化劑時,24 h 時目標物的保留率為92.8%;以L-半胱氨酸為抗氧化劑時,24 h時目標物的保留率為97.5%,說明L-半胱氨酸對目標物起到了保護作用;而以L(＋)-抗壞血酸、亞硫酸氫鈉為抗氧化劑時,8 h后目標物的保留率比不加抗氧化劑時的小,說明L(＋)-抗壞血酸、亞硫酸氫鈉加速了目標物的分解。這是由于L-半胱氨酸中含有活性較高的巰基,很容易與氧氣發(fā)生反應[11-12],從而減緩了目標物的分解。因此,試驗最終選擇2.5 g·L－1(約0.02 mol·L－1)的L-半胱氨酸溶液為抗氧化劑。另外,在試驗過程中發(fā)現(xiàn),L-半胱氨酸被氧化后生成了不溶于乙醇的白色絮狀沉淀L-胱氨酸,可能會堵塞進樣系統(tǒng),因此樣品溶液經(jīng)過濾后再進樣分析。

圖4 抗氧化劑對2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚保留率的影響Fig.4 Effect of antioxidant on retention rate of 2-amino-4-hydroxyethylaminoanisole

2.5 提取劑的選擇

試驗考察了不同體積分數(shù)(5%,10%,30%,70%,90%)的乙醇-2.5 g·L－1L-半胱氨酸溶液的混合液為提取劑時對實際樣品中2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚測定值的影響。

結果顯示:隨著乙醇體積分數(shù)的增加,2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚的測定值逐漸增大;當乙醇體積分數(shù)為70%,90%時,2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚的測定值均較大,并且基本一致;另外,隨著乙醇體積分數(shù)的增加,樣品溶液的澄清度提高,過濾難度明顯降低,可有效提高檢測效率。因此,試驗選擇提取劑中乙醇的體積分數(shù)為70%。

2.6 工作曲線、檢出限和測定下限

精密移取適量的2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚標準儲備溶液,用空白基質樣品溶液配制成2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚質量濃度為1.984,4.961,9.922,24.80,49.61,99.22,248.0,496.1 mg·L－1的基質匹配標準溶液系列。按照儀器工作條件對上述基質匹配標準溶液系列進行測定,以2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚的質量濃度為橫坐標,其對應的峰面積為縱坐標繪制工作曲線。結果顯示,2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚的質量濃度在1.984～496.1 mg·L－1內與其對應的峰面積呈線性關系,線性回歸方程為y＝3.765x＋0.763 9,相關系數(shù)為0.999 9。

以3倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N),10倍信噪比計算測定下限(10S/N)。結果顯示,2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚的檢出限為8μg·g－1,測定下限為26μg·g－1。以2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚硫酸鹽計,檢出限為12μg·g－1,測定下限為40μg·g－1。

2.7 穩(wěn)定性試驗

按照儀器工作條件對4.961,99.22 mg·L－1基質匹配標準溶液分別于0,4,8,12,16,20,24 h時進行測定,計算峰面積的相對標準偏差(RSD)。

結果表明,4.961,99.22 mg·L－1基質匹配標準溶液在24 h內峰面積的RSD(n＝7)分別為0.83%和0.62%,表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.8 精密度和回收試驗

取6份空白基質供試品各0.5 g,分別加入質量濃度為1.5 mg·L－1的2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚標準溶液1 mL,按照試驗方法進行測定。結果顯示,回收率為95.5%,測定值的RSD 為1.9%,說明在測定下限附近的加標回收率及精密度良好。

取18份2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚質量分數(shù)為0.23%的供試品各0.2 g(精確至0.001 g),分別加入質量濃度為0.992 2 g·L－1的2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚標準儲備溶液0.4,0.5,0.6 mL,每個濃度水平平行制備6份溶液,按照試驗方法進行測定,計算回收率和測定值的RSD,結果見表2。

表2 回收試驗結果(n=6)Tab.2 Results of test for recovery(n=6)

結果顯示,回收率為99.6%～101%,測定值的RSD 為2.2%～2.4%,表明該方法的回收率和精密度較好。

2.9 HPLC-MS/MS的定性確證

為保證測定結果的準確性,試驗采用HPLCMS/MS對樣品進行進一步確認。目標化合物在電噴霧正離子源(ESI＋)電離方式下可以獲得響應值較高的母離子;在優(yōu)化的二級質譜條件下,可生成m/z138.0,95.2,123.1等3個響應值較高的子離子,選擇信號響應最強的m/z138.0 為定量離子。在1.2.2節(jié)確證條件下,若供試品中出現(xiàn)m/z183.0＞138.0和m/z183.0＞95.2兩組離子對,且離子對間的相對豐度比在允許偏差±20%以內時,可以確認供試品中含有2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚(硫酸鹽)。按照1.2.2節(jié)對100 mg·L－12-氨基-4-羥乙氨基茴香醚標準溶液和供試品溶液進行測定,所得MRM 色譜圖見圖5。

圖5 MRM 色譜圖Fig.5 MRM chromatograms

2.10 樣品分析

按照試驗方法對7個標簽或產(chǎn)品配方中標示有2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚硫酸鹽的氧化型染發(fā)產(chǎn)品進行測定(以2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚硫酸鹽計),結果見表3。

表3 樣品分析結果Tab.3 Analytical results of samples

結果顯示:HPLC 與HPLC-MS/MS的分析結果一致;5個產(chǎn)品中檢出2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚硫酸鹽,檢出量為0.053 6%～0.369 0%,而其余2個產(chǎn)品中未檢出2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚硫酸鹽,與標示內容不相符。

在氧化型染發(fā)產(chǎn)品的安全監(jiān)測中,除了要控制各成分含量在限值范圍內,還要確定實際檢出成分與產(chǎn)品配方及包裝標示內容是否一致。本工作通過優(yōu)化檢測波長、流動相、抗氧化劑、提取劑等條件,建立了HPLC測定氧化型染發(fā)產(chǎn)品中2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚及其硫酸鹽含量的方法,并通過HPLCMS/MS對結果進行確證。該方法簡單快速、準確度高、專屬性強,為氧化型染發(fā)產(chǎn)品的質量監(jiān)控提供了技術支持。