企鵝珍珠貝礦化基因表達(dá)模式和貝殼超微結(jié)構(gòu)對珍珠質(zhì)層顏色影響的研究*

張佳誼 楊 蕾 陳 一 王愛民 戰(zhàn) 欣

企鵝珍珠貝礦化基因表達(dá)模式和貝殼超微結(jié)構(gòu)對珍珠質(zhì)層顏色影響的研究*

張佳誼1, 2楊 蕾1, 2陳 一1, 2王愛民1, 2戰(zhàn) 欣1, 2①

(1. 南海海洋資源利用國家重點實驗室 海南海口 570228; 2. 海南大學(xué)海洋學(xué)院 海南?？?570228)

為探究企鵝珍珠貝貝殼內(nèi)表面珍珠質(zhì)層不同區(qū)域顏色差異形成的原因, 選取9個生物礦化相關(guān)基因, 利用實時熒光定量PCR擴(kuò)增技術(shù)對其在外套膜不同部位的表達(dá)水平進(jìn)行測定, 并利用掃描電子顯微鏡對貝殼珍珠質(zhì)層不同區(qū)域的內(nèi)表面及縱斷面的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。結(jié)果表明: 有8個礦化基因在企鵝珍珠貝外套膜遠(yuǎn)端膜區(qū)和中央膜區(qū)的表達(dá)量具有顯著差異(<0.05); 貝殼珍珠質(zhì)層內(nèi)表面顏色不同的兩個區(qū)域(生長區(qū)和中心區(qū))表面的超微結(jié)構(gòu)和縱斷面文石板片厚度均存在差異。研究推測, 礦化基因可能是通過在外套膜不同區(qū)域的差異表達(dá), 影響企鵝珍珠貝珍珠質(zhì)的形成, 進(jìn)而影響珍珠質(zhì)層的顏色。而文石板片厚度很可能與貝殼珍珠質(zhì)層顏色無關(guān), 而是與貝殼珍珠質(zhì)層分泌的早晚有關(guān)。研究為探究企鵝珍珠貝珍珠質(zhì)層內(nèi)表面顏色顯著不同區(qū)域的形成機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

企鵝珍珠貝; 珍珠質(zhì)層; 礦化基因; 掃描電子顯微鏡

企鵝珍珠貝()是一種廣泛分布于熱帶和亞熱帶海區(qū)的海洋雙殼貝類, 在我國廣東、海南等省主要用于生產(chǎn)附殼珍珠。貝殼是由外套膜分泌形成的, 貝殼的珍珠質(zhì)層是具有彩虹光澤的內(nèi)部生物礦物層, 與大珠母貝()和馬氏珠母貝()相同, 企鵝珍珠貝貝殼珍珠質(zhì)層內(nèi)表面也呈現(xiàn)明顯的顏色分區(qū), 在靠近貝殼外緣的珍珠質(zhì)層(以下稱生長區(qū))呈現(xiàn)綠色、古銅色等混合顏色, 而在貝殼內(nèi)表面中心區(qū)域(以下稱中心區(qū))呈白色(蒙釗美, 1996; 陳明強(qiáng)等, 2020)。企鵝珍珠貝等育珠母貝在進(jìn)行珍珠培育時, 將貝的外套膜遠(yuǎn)端膜區(qū)(分泌生長區(qū)珍珠質(zhì)層的外套膜)切成小片, 插入育珠母貝體內(nèi), 進(jìn)行珍珠培育。研究發(fā)現(xiàn), 小片培育的珍珠與小片所在貝的貝殼生長區(qū)顏色相同, 此貝殼生長區(qū)珍珠質(zhì)層顏色的形成原因一直受到廣泛關(guān)注。目前關(guān)于珍珠質(zhì)層顏色的理論主要有金屬元素致色假說(楊明月等, 2004; 姜琦等, 2019)、類胡蘿卜素致色假說(Urmos, 1991; 聞海波等, 2012; 李西雷等, 2018)、有機(jī)質(zhì)大分子致色假說(孔蓓等, 2002; 張妮等, 2004; 李耿等, 2007; 李雪英等, 2007; 嚴(yán)俊等, 2011, 2013)等, 但是目前尚無定論。

企鵝珍珠貝中心區(qū)曾經(jīng)是其生長區(qū), 即中心區(qū)在由生長區(qū)變?yōu)橹行膮^(qū)的過程中, 其顏色也逐漸由彩色變?yōu)榘咨?。因? 研究生長區(qū)和中心區(qū)不同顏色形成的機(jī)理, 不僅可以研究貝殼珍珠質(zhì)層顏色變化的機(jī)理, 同時也可以為珍珠質(zhì)層顏色形成機(jī)理的研究提供理論參考。企鵝珍珠貝的貝殼分為三層, 由文石板片構(gòu)成的珍珠質(zhì)層位于貝殼內(nèi)側(cè), 由方解石構(gòu)成的棱柱層位于貝殼的中間, 貝殼表面為角質(zhì)層(Kinoshita, 2011)。礦化基因在外套膜表達(dá), 調(diào)節(jié)外套膜的蛋白質(zhì)分泌活動, 外套膜分泌的蛋白質(zhì)形成生物礦物框架并調(diào)節(jié)碳酸鈣的成核和生長(Sarashina, 2006; Marin, 2007), 調(diào)控?zé)o定形碳酸鈣轉(zhuǎn)化為文石或方解石(Weiss, 2002; Addadi, 2003; Gehrke, 2005), 進(jìn)而形成珍珠質(zhì)層和棱柱層。珍珠質(zhì)層和棱柱層中存在多種基質(zhì)蛋白, 比如MSI60、N16家族, nacrein等, 基質(zhì)蛋白最主要的功能是誘導(dǎo)并調(diào)控碳酸鈣晶體的晶體形狀與類型(Marin, 2007; Marin, 2012), 甚至可以調(diào)控貝殼形成的整個生物礦化過程(Miyamoto, 1996; Kong, 2009)。因此生物礦化基因可以通過調(diào)控基質(zhì)蛋白影響碳酸鈣晶體的結(jié)構(gòu)與方向, 從而使珍珠質(zhì)層呈現(xiàn)出各種顏色(劉曉麗, 2015)。一般情況下, 外套膜的邊緣膜區(qū)形成棱柱層, 遠(yuǎn)端膜區(qū)和中央膜區(qū)分別形成貝殼珍珠質(zhì)層的生長區(qū)和中心區(qū)。貝殼的內(nèi)部珍珠質(zhì)層由多邊形文石板片組成, 文石板片通過薄的有機(jī)夾層附著在片狀結(jié)構(gòu)上, 形成“磚漿”的微結(jié)構(gòu)。在貝殼的形成期間, 角質(zhì)層先形成貝殼的外表面, 隨后形成棱柱層, 最后珍珠質(zhì)層在棱柱層上面形成(Crenshaw, 1972; Kawaguchi, 1993)。

前人研究認(rèn)為由于企鵝珍珠貝貝殼生長區(qū)和中心區(qū)文石板片厚度不同, 導(dǎo)致珍珠質(zhì)層呈現(xiàn)顏色差異, 由此我們推測: 由于貝殼中心區(qū)曾經(jīng)是生長區(qū), 因此, 其靠近棱柱層位置的文石板片厚度應(yīng)與生長區(qū)文石板片厚度相似、與靠近貝殼內(nèi)表面的文石板片厚度應(yīng)呈顯著差異, 而分泌中心區(qū)和生長區(qū)的外套膜中央膜區(qū)和遠(yuǎn)端膜區(qū)中礦化基因的表達(dá)模式也應(yīng)呈顯著差異。因此, 我們檢測9個礦化基因在企鵝珍珠貝外套膜兩個區(qū)域的表達(dá)模式及貝殼兩個區(qū)域表面的超微結(jié)構(gòu)和貝殼縱斷面4個位置文石板片厚度的差異, 進(jìn)而研究貝殼中心區(qū)和生長區(qū)顏色形成的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用企鵝珍珠貝采集自海南海昌蝦苗繁育基地, 按照Elisabeth Strack的劃分標(biāo)準(zhǔn), 采集6個企鵝珍珠貝的外套膜遠(yuǎn)端膜區(qū)和中央膜區(qū),-20 °C保存于RNA貯存液(Takara, 大連)中, 同時將其貝殼用清水沖刷數(shù)次, 除去表面污垢, 去除內(nèi)部組織后, 用去離子水沖洗數(shù)次, 室溫下自然晾干, 用于貝殼結(jié)構(gòu)觀察。

1.2 總RNA提取及cDNA合成

采用TRIzol試劑(ThermoFisher Scientific, USA), 根據(jù)說明書進(jìn)行6個個體外套膜遠(yuǎn)端膜區(qū)和中央膜區(qū)總RNA的提取, 利用1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測其完整性, 用微量分光光度計(NanoDrop 2000, Thermo Scientific, USA)檢測其濃度和質(zhì)量。以提取的總RNA為模板, 按照PrimeScript ? RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara, 大連)說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄, 得到cDNA。

1.3 組織熒光定量分析

檢測反轉(zhuǎn)錄后的cDNA產(chǎn)物濃度, 并稀釋至100 ng/μL, 選取9個礦化基因特異性引物(表1), 由鉑尚生物技術(shù)公司合成。以Li等(2017)在實驗中所用的基因為內(nèi)參基因, 使用QuantStudio? 6 Flex Real-Time PCR 擴(kuò)增儀按照TB Green ? Premix Ex Taq ? (Takara, 大連)的使用說明進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng), 反應(yīng)體系為20 μL, TB Green Premix Ex Taq 10 μL, 上下游引物各0.4 μL (10 μmol/L), cDNA模板1 μL, ddH2O 8.2 μL, 反應(yīng)程序為95 °C預(yù)變性30 s; 95 °C變性5 s, 52 °C退火30 s, 循環(huán)40次; 融解曲線反應(yīng)程序為95 °C 15 s, 60°C 1 min, 95 °C 15 s。以基因為內(nèi)參,以外套膜遠(yuǎn)端膜區(qū)為對照, 運用公式2-ΔΔCt計算各基因的相對表達(dá)量, 公式中ΔΔCt=(Ct目的基因? Ct內(nèi)參基因)中央膜區(qū)? (Ct目的基因? Ct內(nèi)參基因)遠(yuǎn)端膜區(qū)。運用Excel進(jìn)行檢驗, 對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,<0.05表示差異顯著, 用Excel軟件作圖。

1.4 掃描電鏡觀察和文石板片厚度測量

企鵝珍珠貝珍珠質(zhì)層光學(xué)照片如圖1所示, 貝殼經(jīng)機(jī)械破碎, 取顏色各異的生長區(qū)與中心區(qū)碎片若干, 貝殼碎片縱截面如圖1右下角插圖所示, 上方黑色層為棱柱層, 下方白色層為珍珠質(zhì)層, A、B表示電鏡觀察位置, A為靠近棱柱層的文石層, B為靠近珍珠質(zhì)層內(nèi)表面的文石層。生長區(qū)的觀察區(qū)域為G-A、G-B, 中心區(qū)的觀察區(qū)域為C-A、C-B, 每個貝殼碎片分別觀察生長區(qū)和中心區(qū)的內(nèi)表面及縱斷面的上述四個區(qū)域。制作完成的貝殼碎片樣品置于去離子水中超聲清洗8 min, 室溫下自然晾干, 對貝殼珍珠質(zhì)層表面及縱斷面進(jìn)行鍍金處理, 采用場發(fā)射掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察, 儀器型號為Thermoscientific Verios G4 UC, 加速電壓10-20kV。

采用Image J軟件測量貝殼G-A、G-B、C-A、C-B四個區(qū)域文石板片的厚度(圖1), 數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 用Excel軟件進(jìn)行檢驗,<0.05表示差異顯著。

2 實驗結(jié)果

2.1 礦化基因在外套膜不同區(qū)域的表達(dá)模式

熒光定量PCR結(jié)果顯示, 除外, 其他8個礦化基因在企鵝珍珠貝外套膜遠(yuǎn)端膜區(qū)和中央膜區(qū)的表達(dá)量均具有顯著差異, 其中和在中央膜區(qū)的表達(dá)量顯著高于遠(yuǎn)端膜區(qū), 而在中央膜區(qū)的表達(dá)量顯著低于遠(yuǎn)端膜區(qū)(圖2)。

表1 基因特異性熒光定量PCR引物

圖1 (a) 企鵝珍珠貝貝殼內(nèi)表面珍珠質(zhì)層光學(xué)照片; (b) 生長區(qū)縱斷面; (c) 中心區(qū)縱斷面

注: G和C分別表示生長區(qū)和中心區(qū); A和B表示電鏡觀察位置

2.2 貝殼掃描電鏡圖

圖3為企鵝珍珠貝貝殼生長區(qū)與中心區(qū)內(nèi)表面的掃描電鏡圖, 可見生長區(qū)內(nèi)表面成熟文石板片較多, 形狀較規(guī)則, 呈近似六邊形, 邊緣平整, 且排列整齊, 局部放大可見文石板片的堆疊以及未成形的文石板片晶體; 中心區(qū)內(nèi)表面成熟文石板片較少, 邊緣模糊。

圖2 9個生物礦化基因表達(dá)模式

注: 柱上不同字母表示各組織間的表達(dá)量存在顯著差異(<0.05)

采用ImageJ軟件測量珍珠質(zhì)層縱斷面中文石板片的厚度(圖4), 結(jié)果表明, 貝殼4個區(qū)域的文石板片平均厚度之間存在顯著性差異, C-A>G-A>G-B>C-B (<0.05)(表2)。其中, 中心區(qū)靠近棱柱層的C-A區(qū)文石板片厚度最大, 為(0.50±0.13) μm。而且, 不論是中心區(qū)還是生長區(qū), 靠近棱柱層(A位置)的文石板片厚度均顯著大于B位置(<0.05)。

圖3 珍珠質(zhì)層內(nèi)表面掃描電鏡圖

注: a: 生長區(qū); b: 中心區(qū)

圖4 內(nèi)殼珍珠質(zhì)層縱斷面不同區(qū)域掃描電鏡圖

注: a: G-A區(qū); b: C-A區(qū); c: G-B區(qū); d: C-B區(qū)

表2 珍珠質(zhì)層縱斷面不同部位文石板片厚度

3 討論

9個檢測的礦化基因中, 8個基因的表達(dá)模式在企鵝珍珠貝外套膜中央?yún)^(qū)域和遠(yuǎn)端膜區(qū)存在顯著差異(<0.05)。其中2個基因和在外套膜中央膜區(qū)的表達(dá)量顯著高于遠(yuǎn)端膜區(qū), Miyamoto等(1996)在1996年發(fā)現(xiàn)在外套膜中央膜區(qū)表達(dá)水平較高, 而在與棱柱層形成有關(guān)的外褶中幾乎不表達(dá); 在2005年發(fā)現(xiàn)在馬氏珠母貝的外套膜上皮細(xì)胞中表達(dá)量較高, 通過抑制CaCO3的沉淀, 在貝殼和外套膜之間的膜外空間的鈣化中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用, 在鈣質(zhì)棱柱層和文石珍珠質(zhì)層的形成中都起著重要作用(Miyamoto, 2005)。MSI60是參與貝殼珍珠質(zhì)層形成的蛋白之一, Takeuchi等(2006)在2005年發(fā)現(xiàn)其在馬氏珠母貝外套膜的中央膜區(qū)表達(dá)量較高。另外5個基因包括在外套膜中央膜區(qū)的表達(dá)量顯著低于遠(yuǎn)端膜區(qū), 幾丁質(zhì)是β-(1-4)連接的N-乙酰葡萄糖胺的線性聚合物, 是僅次于纖維素的第二豐富的天然高分子多糖, 是軟體動物貝殼和珍珠質(zhì)層形成的關(guān)鍵成分;在外套膜上皮細(xì)胞中表達(dá), 是幾丁質(zhì)合成過程中的關(guān)鍵酶, 而則是最大的幾丁質(zhì)水解酶類之一, 能將幾丁質(zhì)分解成N-乙酰葡糖胺。Levi-Kalisman等(2001)利用冷凍透射顯微鏡研究的珍珠質(zhì)層結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn), 文石層間的片層主要是由高度有序排列的β-幾丁質(zhì)纖維組成; 另外Zhan等(2020)在2020年發(fā)現(xiàn)在企鵝珍珠貝珍珠質(zhì)層的生長區(qū)與中心區(qū), Na、Mg、P、B、Li、Mo幾種元素的分布水平具有顯著性差異, 他們認(rèn)為這與兩個區(qū)域的顏色差異有關(guān); 因此我們推測和通過調(diào)控幾丁質(zhì)的合成與分解來調(diào)控珍珠質(zhì)層中有機(jī)基質(zhì)的形成, 而不同區(qū)域的有機(jī)基質(zhì)又與不同種類的元素相結(jié)合, 從而導(dǎo)致企鵝珍珠貝內(nèi)部珍珠質(zhì)層生長區(qū)與中心區(qū)的顏色變化。Yano等(2006)在2006年發(fā)現(xiàn)只在馬氏珠母貝的外套膜中表達(dá), 特別是在外套膜的遠(yuǎn)端膜區(qū), 許多shematrins在外套膜邊緣合成, 并分泌到外殼的棱柱層, 在一定程度上決定了貝殼的韌性。是一種堿性蛋白, Wang等(2011)在2011年發(fā)現(xiàn)其在馬氏珠母貝外套膜的遠(yuǎn)端膜區(qū)特異性表達(dá), 并能促進(jìn)碳酸鈣晶體在體外的形成, 在貝殼生物礦化中起著重要作用。是一種酸性殼基質(zhì)蛋白, 2012年, Isowa等(2012)發(fā)現(xiàn)其在棱柱層中方解石的沉淀過程中起重要作用, 僅在外套膜的遠(yuǎn)端膜區(qū)表達(dá), 并在近緣物種大珠母貝、企鵝珍珠貝中發(fā)現(xiàn)了其同源物。在遠(yuǎn)端膜區(qū)的表達(dá)水平較高, Yu等(2018)發(fā)現(xiàn)其在企鵝珍珠貝黑色素合成和珍珠質(zhì)層顏色形成中起著關(guān)鍵作用。本文的熒光定量結(jié)果與馬氏珠母貝和大珠母貝等的研究結(jié)果基本一致。因此我們推測上述礦化基因的表達(dá)差異從分子水平上導(dǎo)致了生長區(qū)與中心區(qū)顏色的差異。

由掃描電鏡圖得知, 企鵝珍珠貝貝殼的超微結(jié)構(gòu)與大珠母貝、馬氏珠母貝類似, 具有典型的文石板片和有機(jī)基質(zhì)通過周期性堆疊形成的層狀結(jié)構(gòu)。由于受到掃描電子顯微鏡視域的影響, 同一區(qū)域文石板片厚度較均一。通過分析表2中文石板片平均厚度可知, 無論是在生長區(qū)還是中心區(qū), 靠近棱柱層的文石板片平均厚度顯著大于靠近內(nèi)表面的文石板片平均厚度; 生長區(qū)靠近棱柱層的文石板片平均厚度小于中心區(qū), 但靠近內(nèi)表面的文石板片平均厚度卻大于中心區(qū)。首先, 這表明在生長區(qū)和中心區(qū), 沿棱柱層至貝殼內(nèi)表面的方向, 文石板片呈現(xiàn)逐漸變薄的趨勢; 而且, 中心區(qū)靠近棱柱層的文石板片應(yīng)為此區(qū)過去作為生長區(qū)時形成的, 但是中心區(qū)靠近棱柱層的文石板片厚度顯著大于生長區(qū)靠近棱柱層和靠近內(nèi)表面的文石板片厚度, 說明文石板片厚度很可能與貝殼珍珠質(zhì)層顏色無關(guān), 這與Zhang等(2016)的研究結(jié)果存在差異, 我們認(rèn)為文石板片厚度與貝殼珍珠質(zhì)層分泌的早晚有關(guān), 在檢測的四個區(qū)域中, 分泌的越早, 文石板片厚度越大。

4 結(jié)論

本研究測定9個礦化基因在企鵝珍珠貝外套膜遠(yuǎn)端膜區(qū)和中央膜區(qū)的表達(dá)水平, 其中8個礦化基因在上述兩個區(qū)域的表達(dá)量具有顯著差異(<0.05), 因此礦化基因的表達(dá)差異可能從分子水平導(dǎo)致貝殼珍珠質(zhì)層內(nèi)表面生長區(qū)與中心區(qū)顏色的差異。生長區(qū)和中心區(qū)表面的超微結(jié)構(gòu)和縱斷面文石板片厚度均存在顯著差異(<0.05), 但該差異與生長區(qū)和中心區(qū)的顏色差異并無顯著聯(lián)系, 我們認(rèn)為貝殼珍珠質(zhì)層分泌的早晚影響文石板片的厚度。

孔蓓, 鄒進(jìn)福, 陳積光, 等, 2002. 海水養(yǎng)殖珍珠表層微形貌的結(jié)構(gòu)研究-以廣西防城養(yǎng)殖珍珠為例[J]. 礦產(chǎn)與地質(zhì), 16(6): 342-345.

劉曉麗, 2015. 馬氏珠母貝外套膜不同區(qū)域差異礦化基因的克隆及功能研究[D]. 湛江: 廣東海洋大學(xué): 3-4.

李西雷, 李卿青, 朱庭耀, 等, 2018. 添加類胡蘿卜素對三角帆蚌總類胡蘿卜素含量及貝殼珍珠質(zhì)顏色的影響[J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報, 27(4): 477-486.

張妮, 郭繼春, 張學(xué)云, 等, 2004. 珍珠表面微形貌的AFM和SEM研究[J]. 巖石礦物學(xué)雜志, 23(4): 370-374.

楊明月, 郭守國, 史凌云, 等, 2004. 淡水養(yǎng)殖珍珠的化學(xué)成分與呈色機(jī)理研究[J]. 寶石和寶石學(xué)雜志, 6(2): 10-13.

陳明強(qiáng), 魏海軍, 李有寧, 等, 2020. 企鵝珍珠貝F3選育系的珍珠層顏色及生長性狀的比較分析[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報, 51(3): 659-668.

嚴(yán)俊, 張剛生, 2011. 褶紋冠蚌貝殼結(jié)構(gòu)特征及其珍珠層呈色機(jī)制研究[J]. 安慶師范學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版), 17(3): 83-85.

嚴(yán)俊, 胡仙超, 王巨安, 等, 2013. 不同顏色的淡水養(yǎng)殖珍珠呈色機(jī)理研究[J]. 巖礦測試, 32(2): 263-268.

李耿, 林瓴, 沙拿利, 等, 2007. 淡水養(yǎng)殖珍珠的光澤、顏色與有機(jī)質(zhì)關(guān)系初探[J]. 桂林工學(xué)院學(xué)報, 27(4): 569-571.

李雪英, 王海增, 孫省利, 等, 2007. 不同顏色珍珠的傅里葉變換紅外光譜和石墨爐原子吸收光譜分析[J]. 寶石和寶石學(xué)雜志, 9(1): 15-18.

聞海波, 聶志娟, 曹哲明, 等, 2012. 不同顏色珍珠層的三角帆蚌組織中類胡蘿卜素含量的分析[J]. 大連海洋大學(xué)學(xué)報, 27(3): 265-268.

姜琦, 白志毅, 孫朝虎, 2019. 三角帆蚌所育不同顏色珍珠及其相關(guān)組織金屬元素種類和含量差異分析[J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報, 28(6): 882-889.

蒙釗美, 李有寧, 邢孔武, 1996. 珍珠養(yǎng)殖理論與技術(shù)[M]. 北京: 科學(xué)出版社: 39-40.

ADDADI L, RAZ S, WEINER S, 2003. Taking advantage of disorder: amorphous calcium carbonate and its roles in biomineralization [J]. Advanced Materials, 15(12): 959-970.

CRENSHAW M A, 1972. The inorganic composition of molluscan extrapallial fluid [J]. The Biological bulletin, 143(03):506-512.

GEHRKE N, NASSIF N, PINNA N,, 2005. Retrosynthesis of nacre via amorphous precursor particles [J]. Chemistry of Materials, 17(26): 6514-6516.

ISOWA Y, SARASHINA I, SETIAMARGA D H E,, 2012. A comparative study of the shell matrix protein aspein in pterioid bivalves [J]. Journal of Molecular Evolution, 75(1/2): 11-18.

KAWAGUCHI T, WATABE N, 1993. The organic matrices of the shell of the American oysterGmelin [J]. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 170(1): 11-28.

KINOSHITA S, WANG N, INOUE H,, 2011. Deep sequencing of ESTs from nacreous and prismatic layer producing tissues and a screen for novel shell formation-Related genes in the pearl oyster [J]. PLoS One, 6(6): e21238.

KONG Y W, JING G, YAN Z G,, 2009. Cloning and characterization of Prisilkin-39, a novel matrix protein serving a dual role in the prismatic layer formation from the oyster[J]. Journal of Biological Chemistry, 284(16): 10841-10854.

LEVI-KALISMAN Y, FALINI G, ADDADI L,, 2001. Structure of the Nacreous Organic Matrix of a Bivalve Mollusk Shell Examined in the Hydrated State Using Cryo-TEM [J]. Journal of Structural Biology, 135(1):8-17.

LI H M, LIU B S, HUANG G J,, 2017. Characterization of transcriptome and identification of biomineralization genes in winged pearl oyster () mantle tissue [J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics, 21: 67-76.

MARIN F, 2012. The formation and mineralization of mollusk shell [J]. Front Biosci, 4(3):1099-1125.

MARIN F, LUQUET G, MARIE B,, 2007. Molluscan Shell Proteins: Primary Structure, Origin, and Evolution [J]. Current Topics in Developmental Biology, 80: 209-276.

MIYAMOTO H, MIYASHITA T, OKUSHIMAT M,, 1996. A carbonic anhydrase from the nacreous layer in oyster pearls [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 93(18): 9657-9660.

MIYAMOTO H, MIYOSHI F, KOHNO J, 2005. The carbonic anhydrase domain protein nacrein is expressed in the epithelial cells of the mantle and acts as a negative regulator in calcification in the mollusc[J]. Zoological Science, 22(3): 311-315.

SARASHINA I, ENDO K, 2006. Skeletal matrix proteins of invertebrate animals: comparative analysis of their amino acid sequences [J]. Paleontological Research, 10(4): 311-336.

TAKEUCHI T, ENDO K, 2006. Biphasic and dually coordinated expression of the genes encoding major shell matrix proteins in the pearl oyster[J]. Marine Biotechnology, 8(1): 52-61.

URMOS J, SHARMA S K, MACKENZIE F T, 1991. Characterization of some biogenic carbonates with Raman spectroscopy [J]. American Mineralogist, 76(3/4): 641-646.

WANG X Y, LIU S F, XIE L P,, 2011.mantle gene 3 (PFMG3) promotes differentiation in mouse osteoblasts (MC3T3-E1) [J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 158(2): 173-180.

WEISS I M, TUROSS N, ADDADI L,, 2002. Mollusc larval shell formation: amorphous calcium carbonate is a precursor phase for aragonite [J]. Journal of Experimental Zoology, 293(5): 478-491.

YANO M, NAGAI K, MORIMOTO K,, 2006. Shematrin: a family of glycine-rich structural proteins in the shell of the pearl oyster[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 144(2): 254-262.

YU F F, PAN Z N, QU B L,, 2018. Identification of a tyrosinase gene and its functional analysis in melanin synthesis of[J]. Gene, 656: 1-8.

ZHAN X, WEI H J, JIE Y,, 2020. Variation of element concentration in nacreous marginal area and central area ofshell [J]. Journal of Shellfish Research, 39(3): 679-682.

ZHANG W G, ZHANG G S, 2016. Dynamic structural color from the one-dimensional photonic structure in the nacre of[J]. Optik, 127(18): 7162-7166.

EFFECT OF GENE EXPRESSIONS AND SHELL ULTRASTRUCTURE ON THE COLOR OF NACREOUS LAYER IN

ZHANG Jia-Yi1, 2, YANG Lei1, 2, CHEN Yi1, 2, WANG Ai-Min1, 2, ZHAN Xin1, 2

(1. State Key Laboratory of Marine Resource Utilization in South China Sea, Haikou 570228, China; 2. College of Marine Science, Hainan University, Haikou 570228, China)

To understand the mechanism of coloration in the shell nacreous areas of, real-time fluorescent quantitative PCR amplification technology was used to determine expression levels of nine biomineralization genes in different parts of the mantle, and the microstructure of shell nacreous layer with different colors were observed with the scanning electron microscope. The thickness of aragonite sheet in different shell areas was measured with the software Image J. The results reveal significant differences in the expression levels of 8 biomineralization genes among two areas ofmantle (<0.05), and significantly different microstructure (<0.05) between growth area and central area on the inner surface of nacre. The biomineralization genes may affect the structure of nacreous layer and the thickness of aragonite sheet, and the nacreous color may be impaired by the surface structure of the shell. This study provided information for understanding the mechanism of color formation of shell nacreous layer in.

; nacreous layer; biomineralization genes; scanning electron microscope

S917.4

10.11693/hyhz20210600146

*國家自然科學(xué)基金項目, 31772847號。張佳誼, 碩士研究生, E-mail: 1290414937@qq.com

戰(zhàn) 欣, 碩士生導(dǎo)師, 副教授, E-mail: zhanxinuni@163.com

2021-06-24,

2021-08-18