金納米粒子修飾電極循環(huán)伏安法測(cè)定食品中的碘

陳林林，范天嬌，李 偉，鄭鳳鳴，楊茜瑤，張佳欣，辛嘉英,2

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院, 黑龍江哈爾濱 150028；2.中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所羰基合成與選擇氧化國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 甘肅蘭州 730000）

碘是維持人體正常生命活動(dòng)必要的微量元素之一，在甲狀腺功能和形態(tài)的維持方面具有重要作用[1]，人們通過(guò)加碘食鹽或一些海產(chǎn)品、醬類(lèi)食品、乳制品等含碘食品攝入碘[2]，但是，人體對(duì)碘的攝入量無(wú)論過(guò)多還是過(guò)少都是有害的[3]。碘缺乏與碘過(guò)量都會(huì)引起甲狀腺腫大等疾病[4]。因此，通過(guò)對(duì)食品中碘含量的測(cè)定，控制人體碘的攝入量對(duì)人體健康十分重要。

目前，碘的測(cè)定方法主要有氧化還原滴定法[5]、熒光光譜法[6]、高效液相色譜法[7]、分光光度法[8]、電化學(xué)方法[9-10]等。由于I-能夠引起銅納米粒子的熒光猝滅，WANG等[11]利用聚二甲基二烯丙基氯化銨（PDDA）完成了超靈敏、無(wú)標(biāo)記的I-檢測(cè)，該方法的檢出限為0.45 μmol/L。SONG[12]根據(jù)I-誘導(dǎo)CQDs/AuNPs聚集，導(dǎo)致顏色和吸光度的變化，基于CQDs/AuNPs復(fù)合物，建立了一種檢出限為2.3 μmol/L的I-的比色檢測(cè)方法。在食品檢測(cè)領(lǐng)域中電化學(xué)一直是近些年來(lái)的研究熱點(diǎn)[13-14]。QIN等[15]利用銀納米結(jié)構(gòu)的高表面積和快速電子轉(zhuǎn)移速率提高了電極的響應(yīng)信號(hào)，采用循環(huán)伏安法進(jìn)行I-的定量研究，線性范圍為50 μmol/L～20.2 mmol/L。TRéSOR等[9]研究了I-在復(fù)合電極上的電化學(xué)還原行為，研制了一種銀基固體碳糊電極，用于碘的靈敏測(cè)定，檢出限為3.7×10-9mol/L。上述熒光和比色的方法存在著檢測(cè)成本偏高、靈敏度較差等缺點(diǎn)，電化學(xué)方法具有工藝流程簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低、檢測(cè)速率快、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。此外，納米材料，尤其是金屬納米材料由于具有高比表面積、電催化作用并能夠加快電子傳質(zhì)速率而被廣泛的應(yīng)用于電極表面的修飾[16-17]，也為電極檢測(cè)提供更好地分析性能。雖然已經(jīng)展現(xiàn)了一定的優(yōu)越性，但在食品中碘的測(cè)定上仍然存在著電極修飾過(guò)程復(fù)雜，穩(wěn)定性較差等不足。

為了探究靈敏度更高，操作更簡(jiǎn)便，成本低的I-檢測(cè)方法，本研究利用甲烷氧化菌素（Methanobactin,Mb）原位還原納米金（Mb@AuNPs）制備修飾電極用于食品中I-的測(cè)定。其中，Mb是由甲烷氧化菌分泌的小肽，并具有類(lèi)過(guò)氧化物酶活性[18]，因此可加速I(mǎi)-在電極表面的氧化還原反應(yīng)。此外，Mb可作為還原劑與穩(wěn)定劑將Au（III）還原成Au（0），形成納米金（AuNPs）。該反應(yīng)過(guò)程中，形成的Mb@AuNPs十分穩(wěn)定。因此，采用電沉積的方法將Mb@AuNPs自組裝修飾在金電極表面，進(jìn)而構(gòu)建一種電極組裝簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好、靈敏度高、檢出限低的食品中碘的測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲基彎菌M. trichosporiumOB3b 由清華大學(xué)提供，本實(shí)驗(yàn)室4 ℃保存；氯金酸（HAuCl4）溶液阿拉丁試劑有限公司；甲烷氧化菌素（Mb） 實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵培養(yǎng)[19]；鐵氰化鉀（K3[Fe（CN）6]）、亞鐵氰化鉀（K4[Fe（CN）6]）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4）、碘化鉀（KI）、氯化鉀（KCl） 天津市天力化學(xué)試劑有限公司；中鹽食鹽、海天黃豆醬、飛鶴奶粉 均由超市購(gòu)買(mǎi)；實(shí)驗(yàn)中所用試劑 均為分析純。

Pt 213鉑電極、R0302氯化銀電極 天津艾達(dá)試劑公司；CHI660A型電化學(xué)工作站、φ=3 mm金盤(pán)電極 上海辰華儀器公司；JEM-2100透射電子顯微鏡 上海化科實(shí)驗(yàn)器材有限公司；PB-10 pH計(jì) 賽麗朵思公司；HNY-100B恒溫培養(yǎng)振蕩器 天津市歐諾儀器儀表有限公司；R-20旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Mb@AuNPs的制備 將實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)和純化的Mb[20]與HAuCl4溶液以1:3的比例混合，Mb濃度經(jīng)鉻天青法[21]測(cè)定為0.26 mmol/L，混合后根據(jù)劉豐源[22]的優(yōu)化條件在60 ℃水浴加熱2 h顏色變?yōu)樗{(lán)紫色取出，放置于4 ℃環(huán)境中備用。采用透射電子顯微鏡分析Mb@AuNPs的表觀形貌特征。

1.2.2 自組裝電極的制備與表征 根據(jù)文獻(xiàn)[23]進(jìn)行裸電極的制備，將拋光的裸電極置于Mb@AuNPs溶液中，以0.1 V/s的掃描速率，在-0.6～0.4 V電位窗口，CV掃描30圈，將上述電極置于電解液中，并通過(guò)循環(huán)伏安法[24]在-0.2～0.6 V電位窗口范圍內(nèi)對(duì)其進(jìn)行電化學(xué)性能表征，獲得Mb@AuNPs自組裝修飾電極。

1.2.3 Mb@AuNPs自組裝修飾電極檢測(cè)I-的條件優(yōu)化

1.2.3.1 電沉積圈數(shù)對(duì)I-檢測(cè)的影響 以0.1 V/s的掃描速率CV掃描10、20、30、40、50圈將Mb@AuNPs修飾于裸金電極表面，制備Mb@AuNPs自組裝修飾電極，將上述制備好的電極分別置于0.02 mol/L的碘化鉀（KI）溶液中，在pH7.0的0.1 mol/L磷酸鈉鹽PBS緩沖液與KI溶液3:1體積比混合的溶液中，再以0.1 V/s的掃描速率在電位窗口為0～0.7 V的范圍內(nèi)CV掃描2圈，得到I-在修飾電極表面的響應(yīng)信號(hào)，以峰電流為標(biāo)準(zhǔn)選擇電沉積圈數(shù)。

1.2.3.2 緩沖溶液濃度對(duì)I-檢測(cè)的影響 以上述選擇的電沉積圈數(shù)修飾Mb@AuNPs電極，置于0.02 mol/L的 碘 化 鉀（KI）溶 液 分 別 于pH7.0的0.02、0.05、0.1、0.15、0.2 mol/L PBS溶液中進(jìn)行I-的測(cè)定，選擇較優(yōu)的PBS濃度。

1.2.3.3 緩沖溶液pH對(duì)I-檢測(cè)的影響 選擇上述最優(yōu)電沉積圈數(shù)以及緩沖液濃度，將修飾電極置于pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的緩沖溶液中進(jìn)行I-檢測(cè)，選擇較優(yōu)的體系pH。

1.2.3.4 掃描速率對(duì)I-檢測(cè)的影響 在上述選定的修飾電極與檢測(cè)體系條件下，以0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 V/s的掃描速率在電位窗口為0～0.7 V的范圍內(nèi)CV掃描。根據(jù)峰電流的變化，優(yōu)化檢測(cè)條件，判斷反應(yīng)類(lèi)型。

1.2.4 I-的電化學(xué)檢測(cè) 配制濃度分別為0.01、0.1、1、2、5、10 μmol/L的KI溶液，將Mb@AuNPs自組裝修飾電極分別置于不同濃度I-與pH7.0的0.1 mol/L磷酸鹽PBS緩沖液3:1混合的溶液中，利用CV法，在電位窗口為0～0.7 V，0.1 V/s掃速條件下，進(jìn)行I-的檢測(cè)。建立循環(huán)伏安掃描的氧化峰電流（A）與檢測(cè)I-濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線；測(cè)定空白加樣數(shù)據(jù)20次，計(jì)算出檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。

1.2.5 抗干擾實(shí)驗(yàn) 利用電流-時(shí)間I-t曲線的方法，在緩沖溶液中加入兩次0.001 mol/L KI溶液，隨后加入KI溶液100倍濃度的鈣離子（Ca2+）、鉀離子（K+）、鋅離子（Zn2+）、硫酸根離子（SO42）-、葡萄糖、氯化鈉（NaCl）、溴離子（Br-），觀察I-t曲線電流變化，考察其對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，評(píng)價(jià)自組裝修飾電極抗干擾性能。

1.2.6 重復(fù)性、穩(wěn)定性與重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 在I-檢測(cè)體系中連續(xù)CV掃描 8次；修飾電極在20 d內(nèi)在I-檢測(cè)體系中CV掃描；平行制備8根相同的修飾電極依次對(duì)I-檢測(cè)，根據(jù)掃描結(jié)果確定方法的精密度、穩(wěn)定性與重現(xiàn)性。

1.2.7 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn) 依據(jù)文獻(xiàn)[25-26]對(duì)加碘鹽進(jìn)行預(yù)處理：將10.0 g加碘鹽與0.10 g抗壞血酸于棕色容量瓶中沸水定容至100 mL，使加碘鹽中的碘酸根（IO3-）還原為I-；對(duì)其他食品進(jìn)行的預(yù)處理：參考文獻(xiàn)[27-28]方法，將粉碎黃豆醬、奶粉取0.5 g置于坩堝中，依次加入1.0 mL 1 mol/L的氫氧化鉀（KOH）溶液，0.5 mL 1 mol/L硫代硫酸鈉溶液與10 g/L抗壞血酸溶液，馬弗爐溫度550 ℃灰化40 min，冷卻，加水溶解、過(guò)濾備用。

選擇加碘鹽、黃豆醬、奶粉作為實(shí)際樣品，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，考察Mb@AuNPs自組裝修飾電極在實(shí)際樣品檢測(cè)中的檢測(cè)性能，于3 mL經(jīng)預(yù)處理的樣品中加入20 mg/kg的KI標(biāo)準(zhǔn)溶液，計(jì)算方法的加標(biāo)回收率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，利用SPSS 17.0軟件采用Duncan’s 新復(fù)極差檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性差異分析，顯著性水平P＜0.05，并運(yùn)用Origin 2017繪制數(shù)據(jù)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Mb@AuNPs表征

將制備好的待測(cè)樣品滴加到帶有碳膜的銅網(wǎng)上，自然冷卻風(fēng)干后利用透射電鏡掃描，圖1A～C為不同放大倍數(shù)下Mb原位還原AuNPs復(fù)合納米粒子的透射電鏡圖譜，制備的Mb@AuNPs形狀近似為圓球形，粒徑多為10～15 nm，平均粒徑為12.94 nm，分散性較好，Mb包覆在AuNPs表面，避免了AuNPs之間的聚集[29]，使形成的Mb@AuNPs更穩(wěn)定。

圖1 Mb@AuNPs透射電子顯微鏡圖Fig.1 TEM images of Mb@AuNPs

2.2 Mb@AuNPs自組裝修飾電極表征

由圖2可知，通過(guò)CV的方法對(duì)Mb@AuNPs自組裝修飾電極進(jìn)行表征，修飾后的電極與裸電極相比，氧化還原峰電流從0.888×10-4A降低到0.634×10-4A，說(shuō)明Mb@AuNPs已成功修飾到了電極表面，這可能是由于Mb@AuNPs在電極表面形成了一層有序致密的自組裝膜，Mb@AuNPs膜可阻礙電極表面與電解液間的電子傳遞，從而導(dǎo)致氧化還原峰電流的降低[30]。

圖2 修飾電極的CV圖譜Fig.2 CV responses of modified electrode

2.3 Mb@AuNPs自組裝修飾電極檢測(cè)I-的優(yōu)化條件

2.3.1 沉積圈數(shù)對(duì)修飾電極I-檢測(cè)的影響 由圖3可知，該CV圖譜存在氧化還原峰電流，表明I-在電極表面的反應(yīng)過(guò)程可逆。不同掃描圈數(shù)修飾電極檢測(cè)I-的峰電流存在顯著差異（P＜0.05），掃描圈數(shù)10～50圈修飾電極檢測(cè)I-氧化峰電流先增大后減小。掃描圈數(shù)10～30，氧化峰電流從4.77×10-5A上升至7.14×10-5A，掃描30圈后，電流響應(yīng)下降，由7.14×10-5A下降至4.74×10-5A。隨著掃描圈數(shù)的增加，Mb@AuNPs修飾到電極表面形成的膜更加致密，電子的阻礙作用增強(qiáng)，但是掃描圈數(shù)增加至30圈后，可能是由于沉積圈數(shù)的增加降低了電極的電化學(xué)活性表面積，這是由于大尺寸納米粒子對(duì)電催化活性的負(fù)面影響所致[31]。因此，可以認(rèn)為掃描圈數(shù)為30圈的修飾電極檢測(cè)效果較好。

圖3 不同電沉積圈數(shù)的影響Fig.3 Influence of different number of electrodeposition cycles

2.3.2 緩沖溶液PBS濃度對(duì)I-檢測(cè)的影響 由圖4可知，在檢測(cè)體系中分別加入不同濃度的PBS緩沖溶液，PBS濃度為0.02～0.05 mol/L循環(huán)伏安曲線的氧化峰電流隨PBS溶液濃度的增加而增大，從7.10×10-5A上升到了8.44×10-5A；PBS濃度為0.05～0.2 mol/L循環(huán)伏安曲線的氧化峰電流隨PBS溶液濃度的增加而降低，從8.44×10-5A降低到4.53×10-5A；緩沖溶液PBS濃度為0.05 mol/L時(shí)，I-在修飾電極上呈現(xiàn)出了最優(yōu)的電流響應(yīng)。隨著緩沖溶液濃度的升高緩沖容量會(huì)有一定程度的增大，進(jìn)而促進(jìn)電極表面的電子傳遞速率，增大氧化還原峰信號(hào)，但由于I-在電極表面的反應(yīng)過(guò)程可逆，當(dāng)PBS緩沖溶液的濃度超過(guò)一定的限度時(shí)，可能會(huì)對(duì)反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用而降低電流響應(yīng)[32]。因此，可選擇緩沖溶液濃度0.05 mol/L為檢測(cè)體系的較優(yōu)條件。

圖4 不同緩沖溶液PBS濃度的影響Fig.4 Effect of PBS concentration in different buffer solutions

2.3.3 緩沖溶液pH對(duì)I-檢測(cè)的影響 由圖5可知，在檢測(cè)體系中分別加入不同pH的PBS緩沖溶液。pH6.0～8.0的范圍內(nèi)，I-在修飾電極上的電信號(hào)響應(yīng)先增大后減小，這表明修飾電極的電化學(xué)性質(zhì)在很大程度上取決于檢測(cè)體系的pH。如圖5所示，氧化峰電流在pH6.0～6.5呈上升趨勢(shì)，當(dāng)pH為6.5時(shí)氧化峰電流值達(dá)到最大，并且當(dāng)pH進(jìn)一步加大時(shí)氧化峰電流減小。這可能是由于質(zhì)子參與了I-在電極上的氧化還原反應(yīng)[33]，當(dāng)pH＞6.5時(shí)，由于缺少質(zhì)子，導(dǎo)致I-在修飾電極上發(fā)生氧化反應(yīng)的難度增加。因此，為了提高檢測(cè)的靈敏度，可以選擇pH6.5為檢測(cè)體系緩沖溶液的較優(yōu)條件。

圖5 不同緩沖溶液pH的影響Fig.5 Effect of pH value of different buffer solutions

2.3.4 掃描速率對(duì)I-檢測(cè)體系的影響 為了了解電極反應(yīng)的控制步驟，利用CV研究了掃描速率對(duì)0.02 mol/L I-在修飾電極中催化氧化的影響，由圖6可知，峰值電流Ip與掃描速率V之間的電位關(guān)系可以獲得電化學(xué)信息，通過(guò)CV圖譜可知，在0.04～0.12 V/s掃速范圍內(nèi)氧化峰電流與掃描速率成正比，在掃速增加的同時(shí)，電位增大，氧化峰電位右移。峰電流與掃描速率的平方根之間建立的線性方程為Ip=35.286v1/2-0.1369（V1/2·S-1/2）（R2=0.9996），線性關(guān)系良好，這些特征與JIGYASA等[34]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，表明電子在電極自組裝膜表面的轉(zhuǎn)移過(guò)程是控制擴(kuò)散過(guò)程[33]。

圖6 不同掃描速率的影響Fig.6 Influence of different scanning rate

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

如圖7所示，隨著I-濃度的升高，氧化還原峰電流出現(xiàn)了明顯的升高， I-濃度C與峰電流Ip之間存在明顯的線性關(guān)系，利用Origin軟件擬合可得到線性回歸方程為Ip= 11.65C+0.00514，線性范圍為0.01～10 μmol/L，決定系數(shù)R2=0.9992，說(shuō)明I-濃度與峰電流的線性關(guān)系良好。

圖7 修飾電極對(duì)不同濃度I-標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)Fig.7 Response of modified electrode to different concentrations of I-standard solution

計(jì)算可得該方法的檢出限為2.88 nmol/L，定量限可達(dá)9.60 nmol/L，低于國(guó)標(biāo)方法[35]與相關(guān)研究結(jié)果（如表1），且電極構(gòu)建較簡(jiǎn)便。

表1 Mb@AuNPs自組裝修飾電極與其它電化學(xué)檢測(cè)方法比較Table 1 Mb@AuNPs comparison of self-assembled decorated electrode with other electrochemical detection methods

2.5 抗干擾性能

為探究該修飾電極檢測(cè)I-的選擇性，在檢測(cè)體系中分別加入100倍濃度的干擾離子，研究其對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，結(jié)果如圖8所示，在0.001 mol/L的KI溶液中加入100倍濃度的K+、Zn2+、SO42-、葡萄糖、NaCl等的檢測(cè)結(jié)果與未加入相比，添加干擾物之后I-t曲線峰電流無(wú)明顯變化，Ca2+、Br-對(duì)修飾電極有輕微的電流響應(yīng)，但是對(duì)檢測(cè)結(jié)果的無(wú)明顯影響，可證明該修飾電極對(duì)Ca2+、K+、Zn2+、SO42-、葡萄糖、NaCl與Br-的催化性能，即上述物質(zhì)對(duì)I-的檢測(cè)結(jié)果影響較小，表明該電極在I-的檢測(cè)上具有較強(qiáng)的抗干擾能力。

圖8 干擾物質(zhì)對(duì)修飾電極檢測(cè)I-的影響Fig.8 The influence of interfering substance on the detection of I- in modified electrode

2.6 重復(fù)性、穩(wěn)定性與重現(xiàn)性

用循環(huán)伏安法研究了Mb@AuNPs電極的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和重復(fù)性。在1 mmol/L I-溶液中使用相同的修飾電極進(jìn)行8次重復(fù)試驗(yàn)，氧化峰電流的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.06%，可證明該修飾電極的重復(fù)性良好。通過(guò)在20 d內(nèi)測(cè)試該電極對(duì)I-的電化學(xué)響應(yīng)，測(cè)定電極的穩(wěn)定性，制備的電極電流響應(yīng)約為初始電極響應(yīng)的81%。對(duì)8根平行制備的電極進(jìn)行分析，測(cè)定的電流響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.53%，可證實(shí)修飾電極的重現(xiàn)性。

2.7 加標(biāo)回收率

對(duì)加碘鹽、奶粉以及黃豆醬進(jìn)行碘的電化學(xué)方法定量，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，得到結(jié)果如表2所示。

表2 檢測(cè)方法的加標(biāo)回收率Table 2 Recovery rate of standard addition of detection method

于3 mL經(jīng)預(yù)處理的樣品中添加20 mg/kg I-標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行分析并計(jì)算回收率，結(jié)果如表2，回收率為96.22%～103.57%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD在2.12%～4.95%，加碘食鹽、奶粉和黃豆醬中的碘含量符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)添加量。表明該方法穩(wěn)定可靠，可用于實(shí)際樣品中碘含量的測(cè)定。

3 結(jié)論

基于電沉積方法制備甲烷氧化菌素原位還原納米金Mb@AuNPs自組裝修飾電極，通過(guò)循環(huán)伏安法考察I-在修飾電極上的電化學(xué)行為，得到修飾電極檢測(cè)體系的優(yōu)化條件。在該條件下修飾電極對(duì)I-的檢測(cè)性能良好，I-濃度與氧化峰電流間具有良好的線性關(guān)系，檢出限與相關(guān)文獻(xiàn)相比相對(duì)較低，且該電極具有良好的重現(xiàn)性、精密度和穩(wěn)定性以及較強(qiáng)的抗干擾能力?？蓪?shí)現(xiàn)對(duì)實(shí)際食品樣品的檢測(cè)，且電極制備方法簡(jiǎn)單、易操作，可為食品中碘測(cè)定方法的改進(jìn)提供依據(jù)。