牛乳極性脂質(zhì)的提取工藝優(yōu)化及成分鑒定

劉明真，王彤文，張 濤，姜瀟瀟，劉文正，陶明煊，楊 瑤，劉 琛，郭宇星

（南京師范大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院, 江蘇南京 210000）

極性脂質(zhì)是所有生物膜中的天然成分，被廣泛應(yīng)用于改善食品的結(jié)構(gòu)和乳化特性，其工業(yè)來源主要為大豆和蛋類[1]。研究表明，動(dòng)物來源的極性脂質(zhì)中含有豐富的神經(jīng)鞘磷脂，對(duì)細(xì)胞代謝和調(diào)節(jié)有著積極的作用，因此，受到越來越多的關(guān)注[2]。然而，由于法律和現(xiàn)實(shí)條件的限制，動(dòng)物源大腦和骨髓的使用相對(duì)局限[3]，這也進(jìn)而影響了動(dòng)物源極性脂質(zhì)的開發(fā)利用。

乳中的極性脂質(zhì)主要存在于乳脂肪球膜（Milk fat globule membrane，MFGM）上[4-5]。牛乳中含有豐富的MFGM，它是乳中包裹在脂肪球體外部的一層膜[6-7]，由極性脂質(zhì)、膜蛋白、膽固醇等成分構(gòu)成，其中，乳極性脂質(zhì)含量約占總?cè)橹竞康?%[8-9]。乳極性脂質(zhì)主要包括磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰絲氨酸（PS）和神經(jīng)鞘磷脂（SM）[10]。研究表明，乳極性脂質(zhì)可以保護(hù)肝臟[11]，具有促進(jìn)新生兒腸道成熟和神經(jīng)生長[12]、改善腸道菌群[13]，抗大腸癌等[14]作用。同時(shí)由于乳極性脂質(zhì)特殊的兩性分子結(jié)構(gòu)，使其具有一定的功能性應(yīng)用價(jià)值[15-16]。目前，乳極性脂質(zhì)被廣泛應(yīng)用于化工、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域，如嬰幼兒配方奶粉、脂質(zhì)體等的制備[17]。酪乳和黃油乳清作為乳制品行業(yè)的副產(chǎn)物，含有較高的MFGM和較低的甘油三酯[18]，同時(shí)具有比牛奶更長的貯藏期，因此，更易作為牛乳極性脂質(zhì)提取的原料[19]。

目前報(bào)導(dǎo)的乳極性脂質(zhì)的提取方式大致可以分為物理提取法和化學(xué)提取法[20-21]。物理提取法是利用超臨界萃取技術(shù)或膜技術(shù)進(jìn)行分離提取，操作簡單但價(jià)格較昂貴[22]。GASSI等[23]從奶油乳清中經(jīng)過脫脂、熱處理、酸沉淀酪蛋白、再通過透析和超濾法獲得極性脂質(zhì)?；瘜W(xué)提取法是通過氯仿、甲醇、乙醚、乙醇等有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，氯仿-甲醇作為一種常用的有機(jī)溶劑，可以把樣品中所有的脂溶性物質(zhì)完全提取出來，且對(duì)中性脂質(zhì)和極性脂質(zhì)的提取效率均較高，但步驟較繁瑣，耗時(shí)較長[22,24]。乳中提取牛乳極性脂質(zhì)還未建立完善的提取工藝，酪乳粉是乳極性脂質(zhì)很好的來源。本研究擬建立并優(yōu)化氯仿-甲醇浸提法從酪乳粉中提取乳極性脂質(zhì)，采用響應(yīng)面法對(duì)比不同條件下提取樣品中磷脂的含量，篩選出最優(yōu)的提取參數(shù)，并通過薄層層析法對(duì)提取樣品中的極性脂質(zhì)進(jìn)行分析與鑒定。該研究旨在于探索適用于酪乳加工業(yè)的簡單脂質(zhì)提取方法，一方面可為乳極性脂質(zhì)的開發(fā)提供研究基礎(chǔ)，另一方面也可為提升酪乳粉的開發(fā)利用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酪乳 美國Bob’s Red Mill公司，配料表如表1所示；大豆卵磷脂（純度＞95%） 上海生物工程有限公司；磷脂酰絲氨酸（PS） 標(biāo)準(zhǔn)品，美國Sigma公司；磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PI）、神經(jīng)鞘磷脂（SM） 標(biāo)準(zhǔn)品，中國食品藥品檢定研究院；丙酮、氯仿、甲醇、膽固醇、三氯化鐵、硫氰酸銨 均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

表1 酪乳粉成分Table 1 Ingredient list of buttermilk powder

GL-21M高速冷凍離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；V5100型可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮有限公司；ZNCL-GS型智能磁力攪拌器 上海越眾儀器設(shè)備有限公司；IS128C型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 上海儀邁儀器科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳極性脂質(zhì)的提取 參考王然然等[25]的方法并做修改。稱取1.5 g酪乳粉配制成質(zhì)量濃度為10%（m/v）的溶液，置于40 ℃水浴鍋中攪拌至全部溶解。使用滴管緩慢滴加3 mol/L乳酸溶液調(diào)整pH至4.6，用高速離心機(jī)以8000 r/min離心30 min，收集上清液于燒杯中，備用。向燒杯中加入6 mL一定體積比的氯仿-甲醇混合液，然后用磁力攪拌器在不同溫度下攪拌一定時(shí)間，將混合溶液以8000 r/min離心20 min，收集下層有機(jī)相，上層水相繼續(xù)加入氯仿-甲醇混合液重復(fù)上述步驟兩次。將收集的下層有機(jī)相過濾后用蒸發(fā)濃縮至粘稠狀，隨后轉(zhuǎn)移至小燒杯中，氮?dú)獯蹈?。最后在小燒杯中加入丙酮，攪拌后，過濾收集沉淀，氮?dú)獯蹈?，置?20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 乳極性脂質(zhì)提取條件單因素實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面優(yōu)化

1.2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn) 稱取1.5 g酪乳粉，控制轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速為300 r/min，以磷脂含量為指標(biāo)，分別對(duì)氯仿-甲醇體積比、料液比、提取溫度、提取時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，確定各因素對(duì)提取樣品磷脂含量的影響。實(shí)驗(yàn)基本條件為：氯仿-甲醇體積比為2:1，料液比為1:4，提取溫度為25 ℃，提取時(shí)間為5 min。分別考察氯仿-甲醇體積比（v/v, %）（3:1、5:2、2:1、1:1、2:3）；酪乳粉酸沉后的上清液和有機(jī)試劑總體積之比即料液比（v/v, %）（1:1、1:2、1:3、1:4、1:5）；提取溫度（10、20、30、40、50 ℃）；提取時(shí)間（1、3、5、10、15 min）各因素對(duì)提取樣品磷脂含量的影響。

1.2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，分別選取氯仿-甲醇比（A）、料液比（B）、提取溫度（C）、提取時(shí)間（D）4個(gè)單因素最佳值及其前后相鄰值作為試驗(yàn)因素，并選取磷脂含量為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，得到磷脂提取最優(yōu)條件。試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表2，采用Design-Expert 11軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表2 響應(yīng)面因素水平編碼Table 2 Factors and levels of response surface text

1.2.3 乳極性脂質(zhì)含量的測定 乳極性脂質(zhì)的主要成分為甘油磷脂類，所以采用磷脂測定法測定乳極性脂質(zhì)的含量。參考龔金炎等[26]的方法并做修改。使用氯仿配制0.2 mg/mL的大豆磷脂標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL大豆磷脂標(biāo)準(zhǔn)溶液于具塞離心管中，加氯仿至4 mL，加硫氰亞鐵銨顯色劑4 mL，振蕩混勻1 min，300 r/min離心10 min，取下層。以氯仿為空白，在485 nm處測定吸光值A(chǔ)，以A對(duì)濃度C（mg/mL）進(jìn)行線性回歸，繪制大豆磷脂標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=5.0883x-0.0011（R2=0.9989）。

隨后用氯仿配制1 mg/mL極性脂質(zhì)樣品，按上述方法測定，將測定OD值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算磷脂濃度C，根據(jù)以下公式計(jì)算磷脂含量：

式中：V測為測樣體積； M測為測樣質(zhì)量； M提取為提取樣品質(zhì)量； M總為酪乳粉總質(zhì)量。

1.2.4 乳極性脂質(zhì)的鑒定 使用薄層層析法對(duì)乳極性脂質(zhì)進(jìn)行鑒定[27]。以氯仿為溶劑，將提取的乳極性脂質(zhì)樣品和PC、PE、PI、PS、SM標(biāo)準(zhǔn)品配制成1 mg/mL的溶液。分別用毛細(xì)管吸取半管極性脂質(zhì)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)樣在硅膠板下端1 cm左右，點(diǎn)樣2～3次，迅速吹干。將點(diǎn)完樣的硅膠板立式放入裝有展開劑（氯仿-甲醇-水-氨水比例為3:2:0.3:0.1，v/v/v/v）的層析缸中。至展開劑到達(dá)硅膠板上端1 cm處拿出硅膠板，吹干后置于碘缸中顯色，根據(jù)以下公式計(jì)算遷移率Rf：

式中：a為展開后斑點(diǎn)中心到原點(diǎn)之間的距離，mm；b為原點(diǎn)到溶劑前沿的距離，mm。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有的實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，單因素方差分析檢驗(yàn)組件的顯著性差異，數(shù)據(jù)用±s表示，組間差異采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 極性脂質(zhì)提取條件優(yōu)化

2.1.1 氯仿-甲醇比對(duì)極性脂質(zhì)提取的影響 由圖1可看出，在3:1～2:1范圍內(nèi)，磷脂含量隨氯仿-甲醇體積比的減小而增加，在2:1～2:3范圍內(nèi)，磷脂含量隨著氯仿-甲醇體積比的減小而減小。當(dāng)氯仿-甲醇體積比為2:1時(shí)，磷脂的含量達(dá)到最大值，此時(shí)磷脂含量為（1.372±0.035）mg/g。

圖1 有機(jī)試劑氯仿與甲醇的體積比對(duì)磷脂含量的影響Fig.1 Effect of the volume ratio of chloroform and methanol on extraction quantity of phospholipid contents

2.1.2 料液比對(duì)極性脂質(zhì)提取的影響 圖2為原料酪乳粉與有機(jī)溶劑的質(zhì)量比即料液比對(duì)磷脂含量的影響，隨著有機(jī)溶劑用量的增多，所得磷脂含量也增加，說明有機(jī)溶劑用量越多溶解的磷脂越多，提取率越高；但當(dāng)料液比達(dá)到1:4之后，磷脂含量又有所下降。隨著料液比增加，不僅總體積增大；而且當(dāng)料液比達(dá)到一定值時(shí)，磷脂的溶解達(dá)到了飽和狀態(tài)，增加有機(jī)溶劑用量使物料中的非磷脂成分融入溶劑中，影響提取的磷脂含量。陳康等[28]提取南極磷蝦磷脂時(shí)也發(fā)現(xiàn)增加有溶劑用量到一定值后磷脂提取量不會(huì)增加。所以從節(jié)約材料的角度考慮，最優(yōu)料液比為1:4。

圖2 物料與有機(jī)溶劑的料液比對(duì)磷脂含量的影響Fig.2 Effect of the weight ratio of material and organic solvent on extraction quantity of phospholipid contents

2.1.3 溫度對(duì)極性脂質(zhì)提取的影響 由圖3可知，提取溫度對(duì)磷脂含量有很大的影響，在10～50 ℃的范圍內(nèi)，磷脂含量隨著溫度的升高先增加后降低，在20 ℃時(shí)，磷脂的含量達(dá)到最高（1.440±0.008）mg/g，與其他組的差異顯著（P＜0.05），在20～50 ℃范圍內(nèi)，磷脂含量開始減少。酪乳中含有豐富的酪蛋白，并且磷脂主要存在于MFGM上，過高的溫度會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)熱變性，影響磷脂溶出，同時(shí)磷脂在高溫下易發(fā)生氧化作用而被破壞，且溫度升高加快了有機(jī)試劑的揮發(fā)[29]。因此，最佳提取溫度選擇20 ℃。

圖3 提取溫度對(duì)磷脂含量的影響Fig.3 Effect of the extraction temperature on the extraction quantity of phospholipid contents

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)極性脂質(zhì)提取的影響 由圖4所示，在1～10 min范圍內(nèi)，磷脂含量隨著時(shí)間的增加而升高，此后，磷脂含量隨提取時(shí)間的變化不存在顯著性差異(P＞0.05)。在固液萃取過程中，磷脂向有機(jī)相中擴(kuò)散需要一定的時(shí)間，所以隨著時(shí)間的增加，樣品中磷脂含量會(huì)增加，提取率也會(huì)隨之升高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到10 min時(shí)，磷脂基本已全部擴(kuò)散至有機(jī)相中，此時(shí)提取樣品中磷脂含量達(dá)到最大值（1.474±0.065）mg/g。因此本研究選擇提取時(shí)間10 min為最佳提取時(shí)間。

圖4 提取提取時(shí)間對(duì)磷脂含量的影響Fig.4 Effect of the extraction time on the extraction quantity of phospholipid contents

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平 為了得到牛乳極性脂質(zhì)提取工藝的最適參數(shù)，根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)得到的較優(yōu)提取參數(shù)，采用響應(yīng)面法對(duì)氯仿-甲醇比、料液比、提取溫度、提取時(shí)間四個(gè)因素影響進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。通過單因素實(shí)驗(yàn)確定從酪乳粉中提取極性脂質(zhì)的四個(gè)單因素參數(shù)適宜范圍，選取樣品中磷脂含量為考察指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。結(jié)果見表3。

2.2.2 響應(yīng)面回歸模型的建立與分析 利用軟件Design-Expert 11軟件對(duì)表3試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性多元回歸擬合，得到回歸模型為：

表3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and result of Box-Behnken experient

由表4可知，本實(shí)驗(yàn)選用的二次多項(xiàng)式模型差異極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)差異不顯著（P＞0.05），說明方程可靠，此模型的擬合度好，可通過此響應(yīng)面模型來確定最佳提取工藝條件。A、B、C、D及A2、B2、C2、D2對(duì)Y具有顯著影響（P＜0.05）。同時(shí)顯著性檢驗(yàn)顯示回歸模型的R2為0.9900，調(diào)整后的R2為0.9800，殘差的平方和為0.0821，純誤差的平方和僅為0.0065，進(jìn)一步說明該模型的擬合效果好。

表4 回歸方程模型的方差分析及系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)Table 4 ANOVA for regression equation model and significance test of the coefficient

圖5 為任意兩個(gè)因素的交互作用對(duì)磷脂含量的影響，結(jié)合表4結(jié)果，交互項(xiàng)AB、AC、AD、BC、BD、CD對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的顯著性分析均為P＞0.05，表明氯仿-甲醇比、料液比、提取溫度和提取時(shí)間這4個(gè)因素的兩兩交互作用不顯著。上述回歸模型的最佳值存在響應(yīng)面最高點(diǎn)，等高線圖的圓心，即提取磷脂含量最大時(shí)的穩(wěn)定點(diǎn)，與之對(duì)應(yīng)的因素水平即為最佳工藝條件。

圖5 交互作用對(duì)磷脂含量的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plot of interaction on phospholipid contents

運(yùn)用Design Expert 11軟件分析得最優(yōu)乳極性脂質(zhì)提取工藝條件為：酪乳粉1.5 g，氯仿體積4 mL，甲醇體積2 mL，料液比為1:4，磁力攪拌器提取溫度20 ℃，轉(zhuǎn)速300 r/min，提取時(shí)間10 min。在此條件下進(jìn)行，進(jìn)行3次磷脂提取實(shí)驗(yàn)，測得實(shí)際提取磷脂含量為（1.647±0.010）mg/g。同時(shí)，實(shí)際提取量與模型所預(yù)測的1.707 mg/g理論值誤差在3.64%之內(nèi)，說明所得結(jié)果可靠。

2.3 薄層層析定性分析

通過薄層層析，鑒定出的乳極性脂質(zhì)主要有5種，為磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰絲氨酸（PS）和神經(jīng)鞘磷脂（SM）。從圖6中可以看出，樣品中各組分展開效果好，無拖尾現(xiàn)象，區(qū)分度好。其中PC、SM、PE、PI、PS五種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)僅有一個(gè)斑點(diǎn)，樣品中有四個(gè)斑點(diǎn)，標(biāo)注為A、B、C、D。五種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和樣品的各色斑的Rf值測算結(jié)果如表5所示：樣品中A、B、C、D點(diǎn)的Rf值分別為0.74、0.45、0.30、0.15，標(biāo)準(zhǔn)品PE的Rf值 為0.73，PC的Rf值 為0.44，PI和SM的Rf值均為0.29，未區(qū)分開，PS的Rf值為0.14。因此可初步定性推斷出A點(diǎn)物質(zhì)為PE，B點(diǎn)物質(zhì)為PC，C點(diǎn)物質(zhì)為PI或SM，D點(diǎn)物質(zhì)為PS。由此可得，從酪乳粉中提取的極性脂質(zhì)，至少含有磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰絲氨酸（PS）等。

圖6 樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的薄層層析圖Fig.6 Thin-layer chromatogram of samples and standard phospholipid

表5 薄層層析各色斑的Rf值測算結(jié)果Table 5 The Rf values of each components

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了從酪乳粉中提取乳極性脂質(zhì)的方法，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到了從酪乳粉中提取乳極性脂質(zhì)的最優(yōu)條件：氯仿-甲醇比為2:1，料液比1:4，提取溫度和時(shí)間分別為20 ℃和10 min，磁力攪拌器最佳提取溫度為20 ℃，轉(zhuǎn)速為300 r/min，在此條件下進(jìn)行乳極性脂質(zhì)提取實(shí)驗(yàn)，提取樣品的磷脂含量可達(dá)到（1.647±0.010）mg/g。該提取工藝磷脂提取率較高，提取速度快，工藝流程簡單，易于規(guī)模化生產(chǎn)。此外，通過薄層層析法分析，可以確定提取樣品中有磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、神經(jīng)鞘磷脂等極性脂質(zhì)的存在。該提取工藝安全性高，適用于食品工業(yè)生產(chǎn)，很好地增加了酪乳粉的附加利用值，并為乳極性脂質(zhì)的提取提供了研究基礎(chǔ)。