基于揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的花椒產(chǎn)地溯源技術(shù)研究

李亞南，崔傳堅，陳江琳，運(yùn) 晶，金 龍, ，侯如燕,

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽合肥 230031；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，茶樹生物學(xué)及資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230031；3.洽洽食品股份有限公司，安徽合肥 230601）

花椒屬（Zanthoxylum bungeanumMaxim.）植物屬蕓香科植物青椒或花椒的干燥成熟果皮[1]，按照果實(shí)顏色分為紅花椒和青花椒（本試驗(yàn)材料為紅花椒）?；ń肪哂虚_胃之功效[2]，是一種典型的藥食同源的植物[3]，有治療肝損傷[4]、抑菌[5]、緩解疼痛[6]、殺蟲[7]、抗氧化[8]、抗癌[9?11]、消炎[12]等作用。產(chǎn)地溯源技術(shù)主要是通過物理[13]、化學(xué)[14]和生物[15]方法，建立起能夠區(qū)分產(chǎn)品產(chǎn)地來源的特征指紋圖譜。目前，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析可采用的技術(shù)有感官分析技術(shù)[16]、氣相色譜技術(shù)[17]、氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)[18]、電子鼻[19]、氣相色譜-嗅聞技術(shù)[20]和氣相色譜質(zhì)譜-嗅聞技術(shù)[21]。在花椒香氣成分檢測中，應(yīng)用最為廣泛的是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS）[22]。

對花椒的產(chǎn)地判別有多種方法。例如吳振等[23]采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜對紅花椒和青花椒中21個無機(jī)元素的含量進(jìn)行測定；吳習(xí)宇等[24]采用近紅外漫反射光譜結(jié)合模式識別對不同產(chǎn)地的花椒樣品進(jìn)行研究；王思思等[25]采用快速氣相電子鼻、GC-MS技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計方法從揮發(fā)性成分的物質(zhì)構(gòu)成、模式識別及差異特征方面對不同產(chǎn)地紅花椒進(jìn)行分析，結(jié)果表明4大產(chǎn)區(qū)紅花椒樣品可分為三大類；樊丹青等[26]采用GC-MS對甘肅、四川等6個產(chǎn)地紅花椒的揮發(fā)性成分進(jìn)行了分析；陳光靜等[27]采用GC-MS對3個省的紅花椒揮發(fā)物進(jìn)行了比較，結(jié)果表明不同產(chǎn)地花椒樣品主要成分和含量有所差異。盡管這些報道表明了不同產(chǎn)地花椒的揮發(fā)性香氣組分存在差異，但采用的前處理方法較為繁瑣且未進(jìn)行明確的產(chǎn)地判別，或進(jìn)行大致判別但模型的準(zhǔn)確率不高且未確定關(guān)鍵差異性物質(zhì)。

本文建立了一種無需任何前處理的花椒產(chǎn)地鑒別檢測方法，采用靜態(tài)頂空（Headspace，HS）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)研究陜西、山東、四川、甘肅4個省份45個產(chǎn)地花椒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，進(jìn)而利用主成分分析（Principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘法（Orthogonal partial least squares，OPLS-DA）、偏最小二乘法（Partial least squares method，PLS-DA）、疊加偏最小二乘法（Superposition partial least squares，sPLS-DA）模型以及系統(tǒng)聚類和隨機(jī)森林（Random Forest，RF）模型對不同產(chǎn)地花椒進(jìn)行判別分析并確定關(guān)鍵差異性物質(zhì)，以期為不同產(chǎn)地花椒的香氣組分研究和產(chǎn)品品質(zhì)控制提供理論基礎(chǔ)和快速評判方法，為市場上以劣充優(yōu)、以陳冒新、摻假摻雜的檢測和鑒別提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花椒樣品（干制品）來自陜西、山東、四川和甘肅4個省份，共計45份樣品（如表1所示）。所有樣品在未檢測分析前均密封在?20 ℃避光保存。

7890A-5975C型氣質(zhì)聯(lián)用儀、7697A靜態(tài)頂空進(jìn)樣器 美國安捷倫公司；PL403電子天平（精確度0.1 mg） 梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 揮發(fā)性成分的提取 準(zhǔn)確稱取0.25 g的花椒樣品（無需預(yù)處理）于20 mL頂空瓶中加蓋密封，每個樣品做3個平行，置靜態(tài)頂空進(jìn)樣器中按優(yōu)化后的頂空條件進(jìn)樣。

1.2.2 色譜條件 色譜柱[28]：J&W DB-5MS石英毛細(xì)柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：40 ℃保持1 min，以3 ℃/min升至150 ℃，保持1 min，再以4 ℃/min升至250 ℃，保持7 min；載氣（He）流速1 mL/min，進(jìn)樣量1.0 μL；分流比：10:1；進(jìn)樣口溫度：250 ℃。

1.2.3 質(zhì)譜條件 電子轟擊離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度160 ℃；離子源溫度230 ℃；四級桿150 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 50~600；掃描方式：全掃描；調(diào)諧文件自動調(diào)諧。

1.3 數(shù)據(jù)處理

安捷倫數(shù)據(jù)工作站中NIST17.L標(biāo)準(zhǔn)譜庫自動檢索，通過與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的比對，篩選匹配度達(dá)到80%以上的化合物，同時結(jié)合化合物結(jié)構(gòu)分析，排除雜質(zhì)或柱流失等干擾性化合物，并利用自動質(zhì)譜退卷積定性系統(tǒng)結(jié)合保留指數(shù)分析。采用待測組分的峰面積作為相應(yīng)化合物的相對含量。

采用Excel 2010（美國Microsoft公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析；PCA、OPLS-DA模型采用SIMCA 14.1軟件（瑞典 Umetrics 公司）完成；PLS-DA、sPLSDA模型、聚類分析采用Matlab軟件完成；RF模型采用R語言的Random Forest完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 HS方法的優(yōu)化

HS方法的分離提取效果受色譜柱、取樣量、分流比、加熱溫度、平衡時間等條件的影響，本研究以陜西省韓城花椒為樣品進(jìn)行試驗(yàn)參數(shù)的優(yōu)化，在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，考察不同色譜柱（DB-5MS、DB-WAX）、取樣量與分流比（0.1 g，10:1；0.25 g，10:1；0.5 g，10:1；1.0 g，100:1）、加熱溫度（110、120、130 ℃）、平衡時間（5、10、15 min）的分離提取效果，每個條件重復(fù)3次。

2.1.1 色譜柱對分離效果的影響 在色譜柱的選擇方面，比較了強(qiáng)極性柱DB-WAX與非極性柱DB-5MS在揮發(fā)性香氣物質(zhì)的分離度差異，DB-WAX色譜柱是聚乙二醇（PEG）固定相，是食品、香精和調(diào)味品分析的理想選擇，而DB-5MS在分析應(yīng)用中具有極佳的信噪比，這種性能的改進(jìn)能提供較好的靈敏度和更完整的質(zhì)譜圖信息。DB-5MS柱對活性化合物惰性極好，且DB-5MS柱流失極低，是用于GC-MS分析的理想色譜柱。DB-WAX在響應(yīng)值方面有更高的靈敏度（見圖1a），但出峰時間在10~20 min時，揮發(fā)性香氣物質(zhì)較使用DB-5MS有所損失，綜合考慮選擇非極性色譜柱DB-5MS。

2.1.2 分流比和取樣量對分離提取效果的影響 花椒樣品的取樣質(zhì)量直接決定了色譜圖中揮發(fā)性香氣物質(zhì)的響應(yīng)值高低，而分流比對保留時間沒有很大影響，主要是改善峰型。分流比高，即進(jìn)入色譜柱的氣體少，當(dāng)色譜峰無法分開或拖尾嚴(yán)重時適當(dāng)調(diào)高分流比，可以改善分離。分流比低，即進(jìn)入色譜柱的氣體多，當(dāng)分析物含量低，響應(yīng)值小的時候適當(dāng)調(diào)低分流比，可以增大響應(yīng)值。

比較了（0.1 g，10:1）、（0.25 g，10:1）、（0.5 g，10:1）與（1.0 g，100:1）的譜圖差異（見圖1b），0.1 g，10:1可以較完整地展現(xiàn)樣品的信息，但由于取樣質(zhì)量過小，易致試驗(yàn)重復(fù)性不佳，遂在分流比不變的情況下增大取樣質(zhì)量至0.25 g，兩者比較，總體揮發(fā)性香氣物質(zhì)的響應(yīng)值沒有很明顯的差異。為最大化實(shí)現(xiàn)樣品的代表性，嘗試增大取樣質(zhì)量至0.5 g，此時易導(dǎo)致色譜柱過載，造成分析結(jié)果不準(zhǔn)確。繼續(xù)增加質(zhì)量至1.0 g并提高分流比至100:1，此時豐度較小的揮發(fā)性香氣物質(zhì)損失嚴(yán)重。綜上，確定花椒取樣質(zhì)量為0.25 g，儀器的分流比為10:1。

2.1.3 加熱溫度對提取效果的影響 頂空瓶加熱溫度、定量環(huán)溫度與傳輸線溫度應(yīng)由小到大，且傳輸線溫度小于等于進(jìn)樣口的溫度。隨著頂空瓶加熱溫度的升高，豐度增大（見圖1c），加熱溫度為110 ℃時，定量環(huán)為130 ℃，傳輸線為150 ℃；加熱溫度為120 ℃時，定量環(huán)為140 ℃，傳輸線為160 ℃；加熱溫度為130 ℃時，定量環(huán)為150 ℃，傳輸線為170 ℃。120 ℃時，檢測出揮發(fā)性物質(zhì)的種類較110 ℃增多，且增大溫度至130 ℃時，種類無明顯變化。綜上，加熱溫度選擇120 ℃。

2.1.4 平衡時間對提取效果的影響 化合物的分離效果與儀器各個參數(shù)息息相關(guān)，其之間需要的是平衡與協(xié)調(diào)。峰面積的大小取決于進(jìn)樣的質(zhì)量，進(jìn)樣量取決于樣品的濃度和體積，體積一般相對固定，而濃度和樣品瓶的加熱溫度和平衡時間有關(guān)。隨著頂空瓶平衡時間的延長，色譜響應(yīng)值增加（見圖1d），為了盡可能縮短每個樣品的進(jìn)樣時間，且兼顧色譜峰的分離效果，故確定平衡時間為10 min。

2.2 不同省份花椒香氣成分的組成

對4省份的45個花椒樣品香氣成分進(jìn)行GCMS檢測（結(jié)果見表2），選擇韓城、泰安、茂汶及隴南4地的樣品分別代表陜西、山東、四川、甘肅各省樣品的總離子流圖（如圖2所示）。

表2 不同產(chǎn)地花椒揮發(fā)性物質(zhì)含量Table 2 Volatile content of Zanthoxylum bungeanum from different origins

圖2 不同省份花椒揮發(fā)性成分的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of volatile components of Zanthoxylum bungeanum in different provinces

續(xù)表 2

續(xù)表 2

定性分析結(jié)果表明，4省份花椒共鑒定出99種揮發(fā)性物質(zhì)（表2），可分為醇類、醛類、酮類、酯類、烷類、烯類及其它類化合物。陜西省共鑒定出79種揮發(fā)性物質(zhì)；甘肅省共鑒定出69種揮發(fā)性物質(zhì)；山東省共鑒定出68種揮發(fā)性物質(zhì)；四川省共鑒定出63種揮發(fā)性物質(zhì)。陜西、四川、甘肅3省的花椒樣品揮發(fā)性物質(zhì)含量最高的均是檸檬烯，出峰時間在12.511 min，山東省的泰安市寧陽、孫伯兩地和棗莊市水泉、徐莊兩地?fù)]發(fā)性物質(zhì)含量最高的也是檸檬烯，而泰安市東平、淝城兩地及棗莊市卞橋、城頭兩地?fù)]發(fā)性物質(zhì)含量最高的β-蒎烯，出峰時間在9.858 min。

2.3 不同省份花椒揮發(fā)性物質(zhì)的產(chǎn)地判別分析

基于4個省份45個產(chǎn)地135個花椒樣品香氣成分建立了相應(yīng)的PCA模型（見圖3a）和OPLS-DA模型（見圖3b），數(shù)學(xué)模型質(zhì)量評價指標(biāo)包括R2X、R2Y和Q2，R2X表示模型中隱變量反映自變量X的變異百分比，R2Y表示模型中隱變量反映自變量Y的變異百分比，Q2表示模型的預(yù)測能力，模型所獲得的隱變量能夠預(yù)測X和Y的變異累積百分比。一般來說，R2X、R2Y和Q2的值越大，且R2Y和Q2的比值越接近于1時，表示模型越穩(wěn)定可靠[29]。

圖3 不同產(chǎn)地花椒分類圖Fig.3 Classification map of pepper from different origins

PCA模型表明花椒樣品無法獲得較好聚類效果。推測由于PCA采用無監(jiān)督的降維分析方法，樣品中品種及產(chǎn)地等因素對該模型的干擾較大，所以無法獲得理想效果。而OPLS-DA 是一種用于判別分析的多變量統(tǒng)計分析方法，其原理是對不同處理樣本（如觀測樣本、對照樣本）的特性分別進(jìn)行訓(xùn)練，產(chǎn)生訓(xùn)練集，并檢驗(yàn)訓(xùn)練集的可信度。該方法可以先對所需的觀察變量進(jìn)行分組，后根據(jù)組別性質(zhì)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，從而可以精確獲悉影響分組的關(guān)鍵變量[30]。該P(yáng)CA模型擬合參數(shù)R2X為0.898，R2Y為0.838；OPLS-DA模型擬合參數(shù)R2X為0.83，R2Y為0.878，Q2為0.84。通過OPLS-DA模型可成功區(qū)分陜西、山東、四川、甘肅4省的花椒樣品，且良好的擬合參數(shù)證明了該模型的準(zhǔn)確性。

為了使組間的差異最大化，進(jìn)一步利用GCMS全譜數(shù)據(jù)建立PLS-DA（見圖3c）和sPLS-DA模型（見圖3d），模型最終計算出2個主成分，圖中每一個點(diǎn)代表一個樣品，可見所有的樣品都集中分布在散點(diǎn)圖的橢圓內(nèi)（95%可信區(qū)內(nèi)）。PLS-DA模型中陜西和山東、甘肅和四川的部分產(chǎn)地有交集，而sPLSDA模型中甘肅和四川部分產(chǎn)地有交集，可見此兩種模型不如OPLS-DA模型更適宜于表現(xiàn)不同省份花椒樣品的差異性。

將4省份共45產(chǎn)地的花椒樣品GC-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)聚類（見圖4），以更加簡單、直觀的方式反映各產(chǎn)地的花椒樣品（具體產(chǎn)地名稱見圖4下方樣品編號，每個產(chǎn)地3個平行，分別列為1、2和3）。結(jié)果表明，四川漢源和茂汶的所有樣品分布較為集中，甘肅省有1份樣品與省內(nèi)其他樣品差異較大，推測可能由于其為市場上未經(jīng)初選和處理的毛貨，與其他樣品本身存在較大差異，而陜西韓城的部分花椒樣品和山東棗莊的花椒樣品聚為同類，推測可能由于兩地所處的緯度相近。進(jìn)一步利用花椒樣品GC-MS數(shù)據(jù)建立隨機(jī)森林模型，可以成功區(qū)分4個省份共135份花椒樣品，判別正確率為100%（如表3所示）。

表3 隨機(jī)森林分類判別結(jié)果Table 3 Random forest classification discrimination results

圖4 不同產(chǎn)地花椒聚類圖Fig.4 Dendrogram of pepper from different origins

2.4 花椒香氣成分主要差異性物質(zhì)分析

花椒香氣成分判別分析結(jié)果表明，OPLS-DA模型對于4個省份的花椒樣品具有良好的分離性，通過該模型篩選出62種VIP值大于1.0的化合物（見表4），其中VIP值大于2.0的共有6個，分別為胡椒酮、蒎烯、萜品烯、3-蒈烯、羅勒烯和α-水芹烯，可以作為不同省份花椒判別的關(guān)鍵差異性物質(zhì)。其中胡椒酮是從胡椒油中分離的一種含氧單萜類物質(zhì)，具有薄荷氣味，存在于胡椒科植物中；蒎烯存在于多種天然精油中，有α-蒎烯和β-蒎烯兩種異構(gòu)體；萜品烯為單萜單環(huán)類化合物，具有類似柑橘和檸檬的香氣，主要用于配制人造檸檬和薄荷精油；羅勒烯有草香、花香并伴有橙花油氣息，可用于多種日化香精配方中；α-水芹烯是水芹烯的異構(gòu)體，有柑橘和胡椒的香味。胡椒酮含量最高的為四川省，其次是山東和陜西，而甘肅省的花椒樣品未檢出；3-蒈烯含量最高的也為四川省，其次是甘肅和山東，而陜西省的花椒樣品未檢出；蒎烯含量最高的為陜西??；山東、四川和甘肅分列其次；萜品烯含量最高的為陜西省，明顯高于其他省份；羅勒烯含量較高的是陜西和四川省，而甘肅和四川省的花椒樣品含量相對較低；α-水芹烯含量較高的是山東和陜西省，而四川和甘肅省的花椒樣品含量相對較低。

表4 不同產(chǎn)地花椒主成分分析中關(guān)鍵揮發(fā)性差異物質(zhì)VIP值Table 4 Key volattiles with value of importance of Zanthoxylum bungeanum from different origins based on OPLS-DA

續(xù)表 4

3 結(jié)論

通過考察在不同色譜柱、花椒取樣量與分流比、加熱溫度與平衡時間條件下花椒樣品的分離提取效果，建立了一套適宜于檢測花椒樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的HS/GC-MS方法：使用DB-5MS色譜柱，選取0.25 g的花椒樣品在120 ℃加熱10 min，分流比為10:1。該方法無需對花椒樣品進(jìn)行任何前處理，簡單、快捷、高效且重復(fù)性、穩(wěn)定性好。通過對陜西、山東、四川、甘肅4個省份共45個產(chǎn)地即135個花椒樣本的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，共檢測出99種揮發(fā)性風(fēng)味成分，可分為烯類49種、酯類16種、醇類14種、醛類11種、酮類3種、烷類3種、苯類1種、萜類1種及其它類化合物1種，其中陜西省共鑒定出79種；甘肅省共鑒定出69種；山東省共鑒定出68種；四川省共鑒定出63種?；趽]發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量分別建立PCA和OPLS-DA模型進(jìn)行判別，結(jié)果表明OPLS-DA模型可以成功區(qū)分不同省份的花椒樣品，模型擬合參數(shù)R2X為0.83，R2Y為0.878，Q2為0.84，證明了該模型的準(zhǔn)確性?；诖四Ｐ秃Y選出62種VIP值大于1.0的化合物，其中VIP值大于2.0的揮發(fā)性物質(zhì)有6個，分別為胡椒酮、蒎烯、萜品烯、3-蒈烯、羅勒烯和α-水芹烯，說明這些揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)能夠很好地描述不同省份花椒樣品的香氣差異。進(jìn)一步基于GC-MS全譜數(shù)據(jù)建立PLS-DA、sPLS-DA、系統(tǒng)聚類和RF模型，結(jié)果表明RF模型可以成功將不同省份的花椒區(qū)分開，判別準(zhǔn)確率達(dá)100%，表明花椒的揮發(fā)性物質(zhì)與其產(chǎn)地具有一定的相關(guān)性。