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    Hsf1通過HSP70-TLR4-MyD88信號通路調(diào)控腎臟AA淀粉變

    2022-01-19 08:29:54夏順杰李釗希王琨璐張彩妮董愛彤王宇彬錢金澤
    關(guān)鍵詞:淀粉樣變淀粉腎臟

    夏順杰,李釗希,王琨璐,張彩妮,董愛彤,王宇彬,劉 巍,錢金澤

    淀粉樣變是一組由遺傳變性和感染等不同因素引起的,因蛋白質(zhì)分子錯(cuò)誤折疊/異常聚集所致的淀粉樣物質(zhì)沉積的綜合征[1]。AA淀粉樣變的形成主要與長期炎癥刺激所致的持續(xù)性高濃度的淀粉樣前體蛋白,即血清淀粉樣蛋白A(serum amyloid A, SAA)有關(guān)。大量的SAA可以通過酶解作用分解,或以錯(cuò)誤折疊的方式形成具有β折疊(β-pleated sheets)的淀粉樣纖維。臨床上AA淀粉樣變的腎臟累及率高達(dá)75%~90%,預(yù)后較差,患者多死于腎功能衰竭,其發(fā)病及防治機(jī)制尚未完全清楚。

    具有分子伴侶功能的熱休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)通過誘發(fā)熱休克反應(yīng)激活熱休克轉(zhuǎn)錄因子1(heat shock factor 1, Hsf1),參與蛋白質(zhì)的正確折疊、聚合、轉(zhuǎn)運(yùn)和信號傳遞等生理過程[2]。在急性腎損傷模型中,腎臟上皮細(xì)胞的Toll-like受體(toll-like receptor, TLR),特別是TLR2和TLR4表達(dá)量明顯增加,而這兩種受體的激活是依賴于HSP70來完成的,并且在整個(gè)免疫過程中對細(xì)胞因子的介導(dǎo)和吞噬細(xì)胞的活化也發(fā)揮了關(guān)鍵作用[3]。TLR4是一種模式識別受體,與相應(yīng)的配體結(jié)合后,TLR4被活化。其活化后可誘導(dǎo)多種促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放,發(fā)揮抗炎、自身免疫等效應(yīng)。

    前期的基因芯片篩選結(jié)果顯示,HSP70誘導(dǎo)促炎因子的產(chǎn)生與TLR4信號通路有關(guān),而目前對于該通路在AA淀粉樣變中的作用機(jī)制尚未見詳細(xì)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用Hsf1基因敲除小鼠構(gòu)建腎臟AA淀粉樣變模型,探討HSP70-TLR4-MyD88通路相關(guān)因子在腎臟AA淀粉樣變中的作用機(jī)制以及Hsf1基因?qū)ζ渫返恼{(diào)節(jié),有助于該病在臨床上的預(yù)防與治療策略的合理選擇。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組本實(shí)驗(yàn)選用ICR背景的Hsf1基因敲除鼠,由日本山口大學(xué)大學(xué)院醫(yī)學(xué)系研究科醫(yī)化學(xué)系中井彰教授贈予。所用小鼠均為2個(gè)月齡雄鼠,實(shí)驗(yàn)分5組:Hsf1+/+生理鹽水組、Hsf1+/+淀粉樣變誘導(dǎo)組、Hsf1-/-生理鹽水組、Hsf1-/-淀粉樣變誘導(dǎo)組、Hsf1-/-淀粉樣變誘導(dǎo)同時(shí)給予替普瑞酮(GGA)治療組(Hsf1-/-淀粉樣變誘導(dǎo)+GCA組),每組各6只。

    1.2 模型制備根據(jù)Pras法,從AA淀粉樣變誘導(dǎo)的野生型小鼠腎臟組織中提取出AA淀粉樣纖維種子,各淀粉樣變誘導(dǎo)組采用尾靜脈注射AA淀粉樣纖維(1 μg/100 μL),并給予皮下注射0.5 mL 1%AgNO3的方法制備AA淀粉樣變模型,然后每隔1天皮下注射0.5 mL 1%AgNO3持續(xù)誘導(dǎo)炎癥刺激。此外,GGA治療組每日灌胃(500 mg/kg GGA,GGA溶于4.0 mL 0.9%NaCl溶液中使用[4-5])。誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行1周后完成造模。實(shí)驗(yàn)中每天同一時(shí)間點(diǎn)對各組小鼠進(jìn)行尾靜脈取血,并低速離心收集血清以測量SAA。

    1.3 組織取材淀粉樣變誘導(dǎo)1周后進(jìn)行取材,再使用乙醚麻醉后處死小鼠,取小鼠腎臟部分置入液氮,部分置于10%中性福爾馬林與4%多聚甲醛配置成的固定液中,室溫固定進(jìn)行形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)。其余部分直接冷凍于-80 ℃進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

    1.4 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)(1)應(yīng)用RT-PCR法檢測各組中HSP70、TLR4、MyD88、Tnf-α及IL-6 mRNA檢測:從腎臟組織提取RNA合成cDNA,使用Taq DNA Polymerase進(jìn)行擴(kuò)增。采用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測,操作系統(tǒng)選擇Mx 3005 RT-PCR SYSTEM。(2)應(yīng)用Western blot法檢測各組小鼠腎臟中HSP70以及血清中SAA蛋白表達(dá):使用SDS-PAGE電泳分離,轉(zhuǎn)膜后檢測蛋白表達(dá),所用抗體HSP70和小鼠淀粉樣蛋白A(mouse amyloid A, mAA)稀釋比均為1 ∶3 000。

    1.5 HE及免疫組化用10%中性福爾馬林固定取材的腎臟組織,再將其進(jìn)行包埋封蠟至成型,對腎臟組織進(jìn)行石蠟切片,4 ℃保存。對切片進(jìn)行剛果紅染色,偏光鏡下觀察染色情況,確定淀粉樣物質(zhì)的沉積程度;同時(shí)對相同部位連續(xù)切片進(jìn)行免疫組化SP法染色,mAA抗體稀釋比為1 ∶3 000,在顯微鏡下觀察切片并判斷mAA沉積情況。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)使用Stat View software package(Abacus Concepts, Berkeley, CA, USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,并應(yīng)用Mann-WhitneyU進(jìn)行數(shù)據(jù)的組間比較,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 AA淀粉樣變中Hsf1對HSP70與TLR4的影響RT-PCR檢測各組腎臟中mRNA的結(jié)果顯示:淀粉樣變誘導(dǎo)試驗(yàn)后,Hsf1+/+小鼠腎臟HSP70 mRNA表達(dá)量顯著升高,而Hsf1-/-小鼠腎臟組織HSP70 mRNA表達(dá)量無明顯改變(圖1A),提示Hsf1表達(dá)缺失不能有效激活HSP70。此外,Hsf1-/-淀粉樣變誘導(dǎo)組小鼠腎臟組織中TLR4及其下游因子MyD88的mRNA表達(dá)量顯著高于Hsf1+/+淀粉樣變誘導(dǎo)組小鼠,并且前者的細(xì)胞因子Tnf-α和IL-6的mRNA表達(dá)量同樣顯著高于后者(圖1B~E)。結(jié)果提示,Hsf1表達(dá)缺失對HSP70-TLR4通路有直接調(diào)控作用,并影響AA淀粉樣變。

    圖1 各組小鼠腎臟組織中HSP70(A)、TLR4(B)、MyD88(C)、Tnf-α(D)和IL-6(E) mRNA的表達(dá)情況

    2.2 Hsf1表達(dá)缺失對炎癥刺激后SAA表達(dá)的影響通過Western blot法對各實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中SAA蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn),未進(jìn)行炎癥刺激時(shí),無論是Hsf1+/+型小鼠還是Hsf1-/-型小鼠,均未檢測到血清中SAA表達(dá);而進(jìn)行炎癥刺激后,Hsf1+/+型小鼠和Hsf1-/-型小鼠血清中SAA表達(dá)均急劇升高,Hsf1-/-型小鼠血清中SAA表達(dá)量顯著高于Hsf1+/+型小鼠(P<0.05),且在炎癥刺激后第一天達(dá)到峰值后迅速下降(圖2)。由此可見,Hsf1的缺失顯著增強(qiáng)了炎癥刺激后SAA的表達(dá),為AA淀粉樣物質(zhì)的形成提供了必要條件。

    圖2 各實(shí)驗(yàn)組小鼠每天同一時(shí)間點(diǎn)血清中SAA蛋白表達(dá)情況:Hsf1-/-淀粉樣變誘導(dǎo)組與Hsf1+/+淀粉樣變誘導(dǎo)組相比,*P<0.05

    2.3 Hsf1敲除對AA淀粉樣物質(zhì)沉積程度的影響對各組小鼠腎臟切片進(jìn)行剛果紅染色結(jié)果顯示:Hsf1-/-淀粉樣變誘導(dǎo)組淀粉樣物質(zhì)沉積顯著多于Hsf1+/+淀粉樣變誘導(dǎo)組,且淀粉樣物質(zhì)沉積部位主要集中在集合管的間質(zhì)組織中,再對相同部位連續(xù)切片進(jìn)行mAA免疫組化染色,可見在熒光位置出現(xiàn)等量的淀粉樣沉積,證明剛果紅染色所見淀粉樣物質(zhì)即為AA淀粉樣纖維(圖3)。同時(shí)利用淀粉樣蛋白沉積指數(shù)評估將淀粉樣變沉積程度進(jìn)行量化比較,結(jié)果提示:Hsf1的敲除顯著增強(qiáng)了腎臟組織中AA淀粉樣變的沉積程度(圖4)。

    ABCDEFGHHsf1+/+生理鹽水組Hsf1+/+淀粉樣變誘導(dǎo)組Hsf1-/-生理鹽水組Hsf1-/-淀粉樣變誘導(dǎo)組

    圖4 小鼠腎臟組織中淀粉樣蛋白沉積指數(shù)評估:N.D.未檢出

    2.4 GGA通過TLR4通路有效改善了腎臟組織中AA淀粉樣物質(zhì)沉積Hsf1-/-淀粉樣變誘導(dǎo)組同時(shí)給予GGA處理后,結(jié)果顯示在Hsf1缺失情況下,GGA可有效的誘導(dǎo)腎臟組織中HSP70的mRNA和蛋白表達(dá)(圖5A、B),同時(shí)削弱TLR4-MyD88的活化和促炎因子的表達(dá)(圖5C~F);并且在一定程度上抑制了腎臟組織中淀粉樣物質(zhì)沉積(圖6)。

    圖5 GGA處理后腎臟組織中各分子mRNA和蛋白表達(dá)情況:A、B.實(shí)驗(yàn)組小鼠腎臟組織中HSP70 mRNA(A)及蛋白(B)表達(dá)水平;C~F.分別為各實(shí)驗(yàn)組小鼠腎臟組織中TLR4(C)、Myd-88(D)及促炎因子Tnf-α(E)和IL-6(F)的mRNA表達(dá)水平

    圖6 GGA處理后腎臟組織中淀粉樣變沉積程度評估:N.D.未檢出

    3 討論

    AA淀粉樣變又稱繼發(fā)性系統(tǒng)性淀粉樣變或反應(yīng)性淀粉樣變,是常見的系統(tǒng)性淀粉樣變性之一,由SAA形成的淀粉樣纖維(amyloid fibrils)沉積于機(jī)體組織器官內(nèi),從而引起的系統(tǒng)性淀粉樣變。目前,已有30余種不同的蛋白質(zhì)及其前體可以引起機(jī)體的淀粉樣變疾病,如朊病毒疾病、阿爾茨海默病、Ⅱ型糖尿病、反應(yīng)性淀粉樣變性疾病(reactive amyloidosis)等。簡言之,淀粉樣變是一種淀粉樣蛋白在組織或器官內(nèi)沉積而引發(fā)的一組疾病,可累及全身各組織或器官,腎臟是淀粉樣蛋白常累及的器官之一,是誘發(fā)腎臟纖維化和功能異常的主要因素之一[6]。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,淀粉樣變性每年發(fā)病率約為0.7/10萬人,其中腎臟淀粉樣變的年發(fā)病率高達(dá)(0.21~0.33)/10萬人,占繼發(fā)性腎臟疾病的3.6%,以中老年患者為主。目前普遍認(rèn)為,血清中SAA的含量和炎癥反應(yīng)均與AA淀粉樣變的形成密切相關(guān),特別是IL-6抑制劑可使患者血清中SAA水平正常化,達(dá)到治療AA淀粉樣變的效果[7]。

    未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)(unfolded protein response, UPR)以及熱休克反應(yīng)(heat shock response, HSR),這兩種通路被認(rèn)為與蛋白質(zhì)折疊的動(dòng)態(tài)平衡或蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)有一定的相關(guān)性。HSR是當(dāng)細(xì)胞或組織暴露在高溫、毒物、自由基、感染、淀粉樣纖維蛋白的異常沉積等應(yīng)激原作用下,導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象改變、聚合等一系列防御適應(yīng)性反應(yīng)。Hsf1作為HSPs的主要轉(zhuǎn)錄因子,隨著年齡的增長其表達(dá)逐漸下降。而各種具有分子伴侶功能的HSPs通過誘發(fā)HSR激活Hsf1而被誘發(fā)出來,作為分子伴侶參與蛋白質(zhì)的正確折疊、聚合、轉(zhuǎn)運(yùn)等生理過程。大量體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),HSP70等HSPs的高表達(dá)不僅可以有效地抑制亨廷頓病和多聚谷氨酰胺病,還可以有效抑制由α-Synuclein引起的帕金森病[8-10]。在阿爾茨海默病的研究中發(fā)現(xiàn),HSP70不僅可以抑制細(xì)胞內(nèi)Aβ42的異常聚集,還與細(xì)胞外淀粉樣物質(zhì)的沉積密切相關(guān)[11]。此外,研究發(fā)現(xiàn)HSP無論在天然免疫還是獲得性免疫反應(yīng)中都發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。其中,HSP70具有免疫保護(hù)功能,可與NF-κB、MMPs、ROS等促炎因子相互作用,發(fā)揮抗炎作用。在巨噬細(xì)胞中,HSP70的上調(diào)有效地阻止了脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)所致的炎癥細(xì)胞因子如Tnf-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)增加;在腦出血模型中,HSP70的上調(diào)降低了Tnf-α的表達(dá),減弱了血腦屏障的破壞、水腫的形成和神經(jīng)功能障礙。TLR4作為一種模式識別受體,其不僅可通過識別LPS等病原相關(guān)分子模式(pathogene-associated molecular patterns, PAMP)而被活化,還可通過高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1, HMGB1)、HSPs等損傷相關(guān)分子模式(damageassociated molecular patterns, DAMP)而被活化,從而誘導(dǎo)IL-1β、Tnf-α、IL-6等促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放,發(fā)揮抗炎、自身免疫等效應(yīng)。根據(jù)動(dòng)物和臨床研究發(fā)現(xiàn),TLR4的下調(diào)顯著削弱了1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydrophridine, MPTP)誘導(dǎo)的帕金森小鼠腦部的神經(jīng)炎癥,減少促炎因子Tnf-α和IL-1β的表達(dá)[12]。通過藥理學(xué)阻斷TLR4受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo),可以顯著削弱阿爾茨海默病中神經(jīng)元胞質(zhì)中的Ca2+濃度,防止細(xì)胞凋亡[13]。此外,細(xì)胞外HSP70通過TLR4與巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞相互作用參與先天免疫應(yīng)答[14]。因此,HSP70不僅參與了腎臟正常生理活動(dòng),而且在急性腎損傷、腎缺血再灌注損傷、慢性腎損傷等過程中發(fā)揮重要的保護(hù)作用。

    本實(shí)驗(yàn)通過采用Hsf1-/-型小鼠構(gòu)建腎臟AA淀粉樣變模型,證實(shí)Hsf1的缺失不能有效誘導(dǎo)腎臟HSP70的表達(dá),加劇了TLR4相關(guān)的炎癥反應(yīng),促進(jìn)了促炎因子的釋放;另一方面,Hsf1的缺失導(dǎo)致了急性炎癥后血清中SAA高表達(dá),從而為AA淀粉樣變沉積程度的加劇增加了可能性。作為HSP70誘導(dǎo)劑使用的GGA,可以有效的增加腎臟HSP70的表達(dá)來削弱TLR4介導(dǎo)的促炎反應(yīng),達(dá)到了一定的治療效果。

    綜上所述,本實(shí)驗(yàn)揭示了Hsf1通過HSP70-TLR4-MyD88信號通路調(diào)控腎臟AA淀粉變的機(jī)制,為探討腎臟AA淀粉樣變的形成機(jī)制提供了新的科學(xué)依據(jù),并為臨床預(yù)防和治療提供了新思路。

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