核酸適配體-金納米粒子比色法快速檢測鹽酸克倫特羅*

肖淑艷，孫良，盧繼平，董忠平

(1.內(nèi)蒙古科技大學 材料與冶金學院，內(nèi)蒙古 包頭 014010；2.內(nèi)蒙古科技大學 內(nèi)蒙古自治區(qū)先進陶瓷材料與器件重點實驗室，內(nèi)蒙古 包頭 014010))

鹽酸克倫特羅(CLB)俗稱瘦肉精，屬苯乙醇胺類化合物，它通過改變豬的代謝途徑提高胴體瘦肉率，減少脂肪沉積[1].瘦肉精是我國明令禁止的食品添加劑，人們食用含有一定劑量克倫特羅的產(chǎn)品后將產(chǎn)生不同的中毒癥狀，如頭暈、嘔吐、發(fā)熱等[2].酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜法、毛細管電泳法等是檢測克倫特羅常用的方法[3].Du等[4]將固相微萃取和高效液相色譜法相結(jié)合同時檢測樣品中的克倫特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺，線性范圍為0.5～50 g/L，檢測限為0.1 g/L，具有較高的靈敏度. Fan等[5]利用毛細管電泳對豬尿樣中的克倫特羅進行檢測，檢測限為0.26 ng/mL.這些方法雖然有很高的靈敏度，但操作復(fù)雜、實驗過程需要昂貴儀器和專業(yè)技術(shù)人員，因此，開發(fā)新型高效、簡便的鹽酸克倫特羅檢測方法具有重要意義.

核酸適配體是經(jīng)過體外篩選得到的DNA或RNA片段，對靶標分子具有很強的識別能力[6].利用適配體與傳感器元件結(jié)合，將適配體與靶標的作用轉(zhuǎn)化為可測量的電化學、熒光、比色等信號即可實現(xiàn)對靶標的檢測[7].其中，適配體比色傳感器具有操作簡單、檢測迅速、成本低等特點，已廣泛應(yīng)用于食品安全、環(huán)境監(jiān)測、醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域[8].

金納米粒子(AuNPs)具有比表面積大、吸附能力強、消光系數(shù)高、生物相容性好等特點，在比色分析法中受到越來越多的關(guān)注.金溶液的顏色和表面等離子共振峰的位置與金納米粒子的尺寸、形狀、表面修飾、介質(zhì)折射率、聚集狀態(tài)等因素密切相關(guān)，利用這種性質(zhì)可建立多種金納米粒子比色生物傳感器，實現(xiàn)對靶標的檢測[9].

將適配體與金納米粒子相結(jié)合，通過適配體與鹽酸克倫特羅作用改變氯化鈉誘導的金納米粒子的聚集-分散狀態(tài)，建立一種快速檢測鹽酸克倫特羅的方法，對支持實際食品檢測具有重要意義.

1 實驗部分

1.1 儀器設(shè)備

SQP電子天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；Tecnai G2 F20場發(fā)射透射電子顯微鏡，F(xiàn)EI公司，美國；TGL-20M臺式高速冷凍離心機，湘潭湘儀儀器有限公司；SPJ2100-2，重慶盛普超純水設(shè)備制造商；TU-1810紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司.

1.2 試劑與材料

核酸適配體購自生工生物工程股份有限公司，實驗中所用適配體序列為：5’-TCA TGC CAA GCT GTA CAC CGT CCT GGC CTG GTT GGG ATG T-3’；鹽酸克倫特羅、六水氯化鎂、葡萄糖、檸檬酸鈉購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甘氨酸購自生工生物工程股份有限公司；氯化鈉、氯化鈣、L-半胱氨酸購自天津市永大化學試劑有限公司；氯金酸購自國藥集團化學試劑有限公司.

1.3 金納米粒子的制備

金納米粒子的制備采用Liu等[10]報道的方法：(1)用王水浸泡實驗用到的全部玻璃器皿及轉(zhuǎn)子，并用超純水洗凈，放入烘箱烘干.(2)在三頸燒瓶中加入98 mL超純水和2 mL 50 mmol·L-1氯金酸溶液，氯金酸最終濃度為1 mmol·L-1. (3)加熱回流.(4)溶液出現(xiàn)回流時快速向燒瓶中加入10 mL 38.8 mmol·L-1檸檬酸鈉，1 min之內(nèi)溶液顏色由黃色變成酒紅色，繼續(xù)回流20 min.(5)關(guān)閉加熱，在攪拌下使裝置冷卻到室溫，存放于棕色瓶中置于4 ℃保存，一個月內(nèi)保持穩(wěn)定.

1.4 金納米粒子比色法檢測鹽酸克倫特羅方法的建立

將10 μL不同濃度的鹽酸克倫特羅分別與10 μL 0.8 μmol·L-1適配體在酶標板中混勻，放置6 min，加入30 μL 11.5 nmol·L-1金納米粒子，靜置12 min；加入141 μL超純水和9 μL 1 mol·L-1氯化鈉溶液，混勻靜置16 min，觀察溶液顏色變化，記錄400～700 nm的吸收光譜.以加入鹽酸克倫特羅前后522 nm處吸光度的差為縱坐標、鹽酸克倫特羅濃度為橫坐標，繪制標準曲線.測定未知樣品吸光度值，由標準曲線方程即可求出未知樣品中鹽酸克倫特羅的濃度.

2 結(jié)果與討論

2.1 AuNPs的表征

粒徑在1～100 nm間的金納米粒子具有良好的光學性質(zhì)及生物相容性，是構(gòu)建生物傳感器的常用物質(zhì).如圖1所示，制備的金納米粒子在400～700 nm的范圍內(nèi)有紫外吸收，最大吸收波長是522 nm.根據(jù)朗伯比爾定律計算出金納米粒子的濃度為11.5 nmol·L-1.透射電子顯微鏡的結(jié)果表明合成的金納米粒子呈現(xiàn)良好的分散狀態(tài)，能夠滿足后續(xù)實驗要求.

圖1 金納米粒子吸收光譜和透射電子顯微鏡圖(a)金納米粒子吸收光譜；(b)金納米粒子透射電子顯微鏡圖

2.2 金納米粒子比色法檢測鹽酸克倫特羅實驗原理

金納米粒子比色法檢測鹽酸克倫特羅的原理如圖2所示，制備的金納米粒子在分散狀態(tài)下呈紅色，加入一定濃度氯化鈉后，其表面的負電荷被屏蔽，納米顆粒間的排斥力減弱，金納米粒子聚集，溶液顏色由紅色變成藍色(圖2(a)).當有鹽酸克倫特羅適配體存在時，適配體吸附在金納米粒子的表面，阻止鹽誘導引起的聚集，溶液仍為紅色(圖2(b)).加入靶標鹽酸克倫特羅后，適配體與靶標特異性結(jié)合，失去保護的金納米粒子在氯化鈉中聚集，溶液變成藍色(圖2(c)).

圖2 基于適配體的金納米粒子比色生物傳感器用于快速檢測鹽酸克倫特羅示意圖

上述實驗原理可通過金納米粒子的紫外可見光譜圖得到進一步驗證.如圖3所示，分散的金納米粒子在522 nm處具有強的紫外吸收.加入氯化鈉后，氯化鈉引起金納米粒子聚集，吸收峰顯著降低.有適配體存在時，適配體吸附在金納米粒子的表面，有效阻止鹽誘導金納米粒子聚集，吸收峰值回升.加入鹽酸克倫特羅后，適配體與鹽酸克倫特羅特異性結(jié)合，金納米粒子失去表面核酸鏈的保護，在氯化鈉中聚集，吸收峰降低.因此可通過氯化鈉誘導金納米粒子聚集引起紫外吸收光譜的變化和溶液顏色的變化實現(xiàn)對鹽酸克倫特羅的檢測.

圖3 不同體系中金納米粒子的紫外吸收光譜

2.3 實驗條件優(yōu)化

2.3.1氯化鈉濃度的優(yōu)化

氯化鈉濃度是影響金納米粒子聚集的重要因素，氯化鈉濃度過低不能引起金納米粒子聚集，氯化鈉濃度過高則適配體不能完全保護金納米粒子，導致背景偏高.因此，首先優(yōu)化氯化鈉濃度.分別在30 L金納米粒子中加入超純水和氯化鈉溶液，各管最終總體積為200 L，氯化鈉最終濃度分別是0，25，30，35，40，45，50 mmol·L-1，靜置16 min，測定其吸收光譜.

結(jié)果如圖4所示，在25 mmol·L-1至45 mmol·L-1范圍內(nèi)，隨著氯化鈉濃度的升高，金納米粒子在522 nm處的吸光度值逐漸降低，溶液顏色由紅色逐漸變?yōu)樗{紫色，當氯化鈉濃度為50 mmol·L-1時，522 nm處的紫外吸收峰幾乎消失，說明此時氯化鈉聚集嚴重.因此，選用45 mmol·L-1氯化鈉用于后續(xù)實驗.

圖4 氯化鈉濃度對金納米粒子吸收光譜和溶液顏色的影響

2.3.2金納米粒子-氯化鈉反應(yīng)時間的優(yōu)化

將30 L金納米粒子與161 L超純水和9 L 1 mol·L-1氯化鈉混合均勻，分別在0，2，4，6，8，10，12，14，16，18 min時測定其紫外可見吸收光譜.結(jié)果顯示：隨著時間的增加，522 nm處的吸收值逐漸下降，16 min后，吸收值基本不再變化，故最優(yōu)金納米粒子-氯化鈉反應(yīng)時間為16 min,如圖5所示.

圖5 金納米粒子和氯化鈉反應(yīng)時間對金納米粒子吸光度的影響

2.3.3核酸適配體濃度的優(yōu)化

將10 L不同濃度的核酸適配體分別與30 L金納米粒子混合均勻，孵育12 min；加入151 L超純水與9 L 1 mol·L-1氯化鈉，核酸適配體的最終濃度分別為5，10，15，20，25，30，35，40，45 nmol·L-1，孵育16 min，測定其吸收光譜.結(jié)果顯示隨著核酸適配體濃度的增加，金納米粒子在522 nm處的吸光度值逐漸升高；核酸適配體濃度達到40 nmol·L-1后，金納米粒子吸光度值不再發(fā)生變化，故最優(yōu)核酸適配體濃度選為40 nmol·L-1，如圖6所示.

圖6 適配體濃度對金納米粒子吸光度的影響

2.3.4金納米粒子-核酸適配體反應(yīng)時間的優(yōu)化

將30 L金納米粒子與10 L 0.8 mol·L-1核酸適配體混合均勻，分別靜置0，3，6，9，12，15 min，然后各加入151 L超純水和9 L 1 mol·L-1氯化鈉，靜置16 min，測其吸收光譜.如圖7所示，隨著核酸適配體與金納米粒子反應(yīng)時間的增加，522 nm處的吸光度值增加；12 min后，吸光度值不再變化，故最優(yōu)金納米粒子-核酸適配體反應(yīng)時間選為12 min.

圖7 金納米粒子和適配體反應(yīng)時間對金納米粒子吸光度的影響

2.3.5鹽酸克倫特羅-核酸適配體反應(yīng)時間的優(yōu)化

將10 L 6 mol·L-1鹽酸克倫特羅與10 L 0.8 mol·L-1適配體混勻，靜置0，2，4，6，8 min后，各加入30 L金納米粒子，孵育12 min；加入141 L超純水和9 L 1 mol·L-1氯化鈉，靜置16 min，測定吸收光譜.如圖8所示，隨著核酸適配體與鹽酸克倫特羅反應(yīng)時間的增加，522 nm處的吸光度值逐漸降低；6 min后，吸光度值不再變化，故最優(yōu)鹽酸克倫特羅-核酸適配體反應(yīng)時間選為6 min.

圖8 鹽酸克倫特羅和適配體反應(yīng)時間對金納米粒子吸光度的影響

2.4 線性范圍與檢出限

在最佳實驗條件下，向體系中加入濃度為50～400 nmol·L-1的鹽酸克倫特羅，記錄紫外光譜，結(jié)果如圖9所示，靶標濃度在50～350 nmol·L-1范圍內(nèi)，加入鹽酸克倫特羅前后522 nm處吸光度的差值和鹽酸克倫特羅濃度間呈線性關(guān)系，線性方程是y=0.000 29X+0.005 86，R2=0.997 5，檢出限為18.7 nmol·L-1.

圖9 ΔA522與克倫特羅濃度的線性標準曲線

2.5 干擾實驗

為了考察肉類及動物尿液中其它物質(zhì)對檢測鹽酸克倫特羅的影響，本文分別選用甘氨酸、L-半胱氨酸、Mg2+、葡萄糖、Ca2+作為干擾物質(zhì)，測定加入鹽酸克倫特羅或干擾物質(zhì)對522 nm處吸光度值的影響.

如圖10所示，加入鹽酸克倫特羅前后引起522 nm處吸光度值的變化遠遠大于其它物質(zhì)，說明本方法對鹽酸克倫特羅具有選擇性，其它物對鹽酸克倫特羅檢測的干擾較小.

圖10 加入克倫特羅或其他干擾物質(zhì)前后金納米粒子ΔA522的變化值

2.6 回收實驗

向水樣中加入鹽酸克倫特羅進行加標回收實驗，3組水樣中分別加入最終濃度為100，150，200 nmol·L-1的鹽酸克倫特羅，在最優(yōu)實驗條件下進行回收率測定.結(jié)果表明:加標回收率在92.2%～109.9%之間.中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準中采用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法對克倫特羅殘留量測定的回收率在83.7%～114.5%之間[11].本方法的回收率范圍與上述標準及其它方法的回收率范圍類似，見表1所示，本方法具有可行性.

表1 水樣中克倫特羅的加標回收率

目前檢測鹽酸克倫特羅的方法有高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法、電化學法、免疫法等[12-16].本方法的檢出限小于或接近其它方法的檢出限(表2).但與這些方法相比，本方法不需要昂貴的儀器，實驗過程耗時短，結(jié)合便攜式紫外可見光譜儀可實現(xiàn)現(xiàn)場檢測.

表2 克倫特羅檢測方法比較

3 結(jié)論

以克倫特羅適配體作為識別探針，金納米粒子作為比色探針，通過比較加入鹽酸克倫特羅前后紫外光譜的變化，實現(xiàn)了對鹽酸克倫特羅的快速檢測.與其它傳統(tǒng)方法相比，所使用的儀器設(shè)備簡單，耗時短.