二維液相色譜同時檢測特醫(yī)食品中維生素A、E、D3含量

李 貽,賀 君,王曉潔,張德殿,孫 萌,王偉宇

(1.煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東 煙臺 264005;2.魯東大學(xué)特醫(yī)食品研究院,山東 煙臺 264025;3.威海魯東特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品研究院有限公司,山東 威海 264309)

特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品(Food for Special Medical Purposes),簡稱特醫(yī)食品,是為了滿足特殊人群營養(yǎng)需求的醫(yī)用食品,一般分為全營養(yǎng)、特定全營養(yǎng)和非全營養(yǎng)三大類[1-2]。特醫(yī)食品主要以蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、礦物質(zhì)和碳水化合物為營養(yǎng)指標(biāo)[3],其中維生素A、E、D3是重要的營養(yǎng)素。各類特殊病人生理特點(diǎn)及對維生素的需求不同,產(chǎn)品中相應(yīng)的維生素含量也有一定的差異[4-5],因此需要對特醫(yī)食品中維生素A、E、D3進(jìn)行準(zhǔn)確測定。

目前維生素A、E、D3常用的檢測方法有氣相色譜法[6-7]、液相色譜法[8-9]、分光光度法[10-11]、毛細(xì)管電泳法[12-13]以及微生物試劑盒等[14-15]。國標(biāo)法中維生素A、E、D3含量不能同時被檢測出;高效液相色譜可同時檢測維生素A、E,但樣品前處理繁瑣;反向高效液相色譜可單獨(dú)檢測維生素D2、D3,但方法步驟復(fù)雜[16]。在線二維液相色譜法是一種新的檢測方法[17],能同時檢測出維生素A、E、D3含量[18-19],且具有靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確、同時檢測等優(yōu)點(diǎn),適用于同時檢測特醫(yī)食品中維生素A、E、D3含量。本研究對該方法進(jìn)行了優(yōu)化,以達(dá)到更為高效、快速、方便的效果。

1 材料與方法

1.1 主要材料

維生素A標(biāo)準(zhǔn)品(純度98.4%)、維生素α-E標(biāo)準(zhǔn)品(純度98.6%)、維生素D3標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.6%) 德國Dr.E公司;特醫(yī)食品 市售;甲醇、乙腈 色譜純;抗壞血酸、BHT、無水硫酸鈉、氫氧化鉀、石油醚、乙醚、無水乙醇 分析純。

1.2 儀器設(shè)備

1260 II 二維液相色譜(包括四元泵、自動進(jìn)樣器、在線過濾器、二元泵、六通閥、柱溫箱、VWD紫外檢測器、DAD紫外檢測器), 美國安捷倫科技公司;HH數(shù)顯恒溫水浴鍋,常州國宇儀器制造有限公司;MG-2200氮吹儀,上海愛朗儀器有限公司;ME-204分析天平,梅特勒-托利多公司;N-1300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海愛朗儀器有限公司;N-1500高速離心機(jī),湖南湘儀儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 溶液的配制 氫氧化鉀溶液(50 g/100 g):稱取50 g氫氧化鉀,加入50 mL水溶解,混勻備用。

維生素A標(biāo)準(zhǔn)儲備液(0.5 mg/mL):準(zhǔn)確稱取維生素A標(biāo)準(zhǔn)品25.0 mg,用甲醇溶解后定容到50 mL容量瓶,得到維生素A標(biāo)準(zhǔn)儲備液。維生素E標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1.0 mg/mL):準(zhǔn)確稱取α-維生素E標(biāo)準(zhǔn)品25.0 mg,用甲醇溶解后定容到25 mL 容量瓶,得到維生素E標(biāo)準(zhǔn)儲備液。維生素D3標(biāo)準(zhǔn)儲備液(0.1 mg/mL):準(zhǔn)確稱取維生素D3標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg,用甲醇溶解后定容到100 mL容量瓶,得到維生素D3標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

維生素A、E、D3混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:分別移取維生素A儲備液2 mL,維生素E儲備液10 mL,維生素D3儲備液1 mL于100 mL容量瓶中,用甲醇定容,得到維生素A、E、D3混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。準(zhǔn)確移取10 mL維生素A、E、D3混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液到于100 mL容量瓶中,用甲醇定容,此時得到維生素A、E、D3混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(VA:1 μg/mL,VE:10 μg/mL,VD3:0.1 μg/mL)。

維生素A、E、D3混合工作溶液的配制:分別移取不同體積的維生素A、E、D3混合工作溶液于100 mL容量瓶中,用甲醇定容,配制成不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。該系列中維生素A質(zhì)量濃度為10、50、100、200、500 ng/mL,維生素E質(zhì)量濃度為100、500、1000、2000、5000 ng/mL,維生素D3質(zhì)量濃度為1、5、10、20、50 ng/mL。

1.3.2 樣品前處理優(yōu)化 稱取5.0 g特醫(yī)營養(yǎng)粉置于圓底燒瓶中,加入20 mL水將營養(yǎng)粉溶解并混勻,再加入1.0 g抗壞血酸和0.1 g BHT,混勻,加入30 mL的甲醇和10 mL的氫氧化鉀溶液,混勻后于75 ℃恒溫水浴鍋中皂化35 min。將皂化后的溶液轉(zhuǎn)移到100 mL具塞量筒中,加入15 mL乙醚和15 mL石油醚混合提取,然后吸取上層醚層溶液至蒸發(fā)瓶中,重復(fù)提取三次,合并醚層溶液,用水洗至中性,過5 g無水硫酸鈉脫水后,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā),待溶液蒸發(fā)只剩2 mL左右時,立即用氮吹儀吹干,然后用10 mL甲醇溶液溶解殘留物,混勻,取上清液并經(jīng)過0.22 μm有機(jī)濾膜過濾,放入棕色小瓶,上機(jī)測試。由于前處理后的樣品溶液中含有一定的雜質(zhì),因此在樣品進(jìn)入色譜柱之前加裝一個在線過濾器,樣品溶液經(jīng)過在線過濾器能有效過濾雜質(zhì),然后進(jìn)入色譜柱分析檢測,以提高色譜柱使用期限,使樣品檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確。

1.3.3 二維液相色譜條件 一維條件:Agilent Poroshell 120 C18(2.6×100 mm,2.7 μm)色譜柱,流動相為水+甲醇,流速1 mL/min,梯度洗脫,VWD檢測器進(jìn)行檢測(維生素A、維生素E),波長325 nm、296 nm,柱溫35 ℃。

二維條件:Agilent Eclipse PAH(2.1×100 mm,3.5 μm)色譜柱,流動相為乙腈+甲醇,流速0.3 mL/min,梯度洗脫,DAD檢測器進(jìn)行檢測(維生素D3),波長264 nm,柱溫35 ℃。

梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系

通過對相應(yīng)濃度范圍內(nèi)的維生素A、E、D3混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行測定分析,結(jié)果如表2所示,維生素A、E、D3對應(yīng)的線性方程相關(guān)系數(shù)r均在0.999 6以上,表明維生素A、E、D3在其對應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。圖1為維生素A、E標(biāo)準(zhǔn)色譜圖,圖2為維生素D3標(biāo)準(zhǔn)色譜圖。

表2 維生素A、E、D3線性方程與相關(guān)系數(shù)rTab.2 Vitamin A,E,D3 linear equation and correlation coefficient r

圖1 維生素A、E標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig.1 Standard chromatogram of vitamin A and E

圖2 維生素D3標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig.2 Standard chromatogram of vitamin D3

2.2 六通閥切換時間的確定

當(dāng)做不切閥實(shí)驗(yàn)時,維生素A、E、D3標(biāo)準(zhǔn)溶液只經(jīng)過一維色譜柱分離,六通閥一直處于位置1,如圖3(a)所示,維生素A標(biāo)準(zhǔn)色譜峰出峰時間為5.003 min,維生素E標(biāo)準(zhǔn)色譜峰出峰時間為8.906 min,維生素D3標(biāo)準(zhǔn)色譜峰出峰時間在維生素A和維生素E之間,因此確定六通閥切換位置時間為5.95 min,VWD檢測波長切換時間為7.02 min。

二維液相色譜儀通過六通閥控制所測溶液進(jìn)入色譜柱的方式,一維色譜柱分離維生素A、E,二維色譜柱分離維生素D3,當(dāng)六通閥處于位置1時,樣品溶液先經(jīng)過在線過濾器過濾,隨后樣品溶液中維生素A、E、D3經(jīng)過一維色譜柱(Poroshell 120 C18)進(jìn)行分離,VWD檢測器進(jìn)行檢測,波長為325 nm,維生素A色譜峰在5.003 min時出現(xiàn),由于維生素D3含量較低,一維色譜柱不易分離,在5.95 min時六通閥由位置1切換成位置2(圖3(b)),維生素D3則轉(zhuǎn)入二維色譜柱(Eclipse PAH)進(jìn)行分離,DAD檢測器對維生素D3進(jìn)行檢測,波長為264 nm,7.02 min時VWD檢測波長從325 nm切換為296 nm,接著檢測維生素E,最終儀器同時檢測出維生素A、E、D3。

圖3 六通閥位置Fig.3 Six-way valve position

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

選擇維生素A、E、D3混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,使用“1.3.3”項(xiàng)下色譜條件,然后用二維液相色譜自動進(jìn)樣器進(jìn)樣4針,體積為20 μL,進(jìn)行重復(fù)性分析實(shí)驗(yàn),結(jié)果如表3所示,重復(fù)進(jìn)樣4針后,得到維生素A、E、D3實(shí)際濃度值,計(jì)算平均值與RSD,RSD在0.29%～0.52%之間,證明該儀器方法精密度高,色譜柱分離效果穩(wěn)定。

表3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Repeatable experiment results

2.4 檢出限與定量限

二維液相色譜檢出限按照3倍基線噪音計(jì)算,當(dāng)信噪比(S/N=3)時,基線噪音為0.005 mAU,樣品峰高為0.015 mAU,對應(yīng)樣品質(zhì)量濃度為0.001 μg/mL,因此檢出限為1.5 μg/100g。當(dāng)信噪比(S/N=10)時為定量限,定量限為5 μg/100g。

2.5 樣品檢測結(jié)果及加標(biāo)回收率

選擇所購買的特殊醫(yī)學(xué)用途食品進(jìn)行檢測,樣品取4個平行樣進(jìn)行試驗(yàn),檢測后計(jì)算維生素A、E、D3含量、加標(biāo)回收率以及相對平均偏差,具體數(shù)值見表4。圖4為特醫(yī)食品中維生素維生素A、E色譜圖,圖5為特醫(yī)食品中維生素D3色譜圖,由圖4、5可得,樣品中維生素A、E、D3色譜峰與標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜峰出峰時間基本一致,檢測結(jié)果與樣品實(shí)際值較為接近,平均加標(biāo)回收率在87.62%以上,因此該檢測方法能有效測定特醫(yī)食品中維生素A、E、D3含量。

表4 樣品檢測與加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Sample detection and spike recovery experiment results

圖4 特醫(yī)食品中維生素A、E色譜圖Fig.4 Chromatograms of Vitamin A and E in Special Medical Food

圖5 特醫(yī)食品中維生素D3色譜圖Fig.5 Chromatograms of Vitamin D3 in Special Medical Food

3 討 論

GB 5009.82—2016[16]標(biāo)準(zhǔn)方法中維生素A、E可通過反向高效液相色譜法同時測定,維生素D則需要液相色譜或液質(zhì)聯(lián)用單獨(dú)測定,本研究則建立了二維液相色譜同時測定特醫(yī)食品中維生素A、E、D3方法,與國標(biāo)方法相比,本方法不僅同時檢測出食品中維生素A、E、D3含量,也減少了繁瑣復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)步驟,提高了檢測效率。張艷海等[17]建立了在線二維液相色譜法同時檢測維生素A、E、D3方法,實(shí)驗(yàn)中維生素D3在一維色譜柱的出現(xiàn)時間沒有固定,每次實(shí)驗(yàn)前需要先確定維生素D3出現(xiàn)時間再確定切換閥時間,且切閥后三元泵壓力會升高,而本方法通過重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明色譜柱分離效果和重復(fù)性較好,二元泵壓力穩(wěn)定,維生素D3在一維色譜柱的出現(xiàn)時間和六通閥切換時間固定。在趙玉富等[19]建立的二維液相色譜同時檢測維生素A、E、D3方法中,使用石油醚對皂化后的樣品溶液萃取2次以達(dá)到萃取目的,與之相比,本方法采用了石油醚+乙醚混合液對皂化后的樣品溶液重復(fù)萃取3次,更能有效提取樣品溶液中維生素A、E、D3。此外，上述幾種方法中儀器都未安裝在線過濾器,樣品溶液中雜質(zhì)容易造成色譜柱堵塞,使泵壓力升高,而本實(shí)驗(yàn)加裝的在線過濾器能有效去除樣品溶液中雜質(zhì),可提高色譜柱穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度。

4 結(jié) 論

本研究以特醫(yī)食品為樣品,對樣品前處理過程進(jìn)行優(yōu)化,經(jīng)過前處理的樣品溶液通過二維液相色譜法同時檢測維生素A、E、D3含量,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示維生素A、E、D3在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性良好,平均加標(biāo)回收率在87.62%～103.10%之間,RSD在2.62%～8.26%之間,樣品檢測結(jié)果與實(shí)際值接近。該方法具有高效、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高以及同時檢測等特點(diǎn),不僅為同時檢測特醫(yī)食品中維生素A、E、D3提供方法參考,也為二維液相色譜同時檢測多種維生素提供一定的技術(shù)借鑒。