網(wǎng)狀纖維染色中銀氨離子的解離規(guī)律

蔡育波，曲春華，黃輝，李海成，李榮崗，周偉，陳杰偉，3*

（1廣東省江門市中心醫(yī)院病理科，江門 529000；2中山大學附屬腫瘤醫(yī)院病理科，廣州 510060；3廣東省食管癌研究所，廣州 510060）

網(wǎng)狀纖維源自于網(wǎng)狀細胞，主要由III型膠原蛋白交錯排列成網(wǎng)狀故稱網(wǎng)狀纖維，屬于疏松結(jié)締組織中的一種成分，因其原纖維上包裹一層特殊的嗜銀糖蛋白，而被稱為嗜銀纖維[1-2]。網(wǎng)狀纖維以網(wǎng)狀支架和上皮基膜的形式廣泛存在于組織中，網(wǎng)狀纖維的增減，斷裂，崩解，都預示著疾病的發(fā)生和進展，因此網(wǎng)狀纖維染色在病理診斷中得到廣泛應(yīng)用[1]。由于改良Gordon-Sweets法中對網(wǎng)狀纖維結(jié)合的銀氨離子Ag(NH3)2+在水中解離規(guī)律未見文獻報道，實踐中網(wǎng)狀纖維染色效果穩(wěn)定性及一致性較差，影響病理診斷；為了改善染色質(zhì)量，提高病理診斷準確性，本研究通過實驗對其解離規(guī)律進行揭示及驗證。

材料與方法

1 材料

收集10例來自江門市中心醫(yī)院病理科的肝臟手術(shù)切除組織石蠟標本及中山大學腫瘤防治中心的146例肝癌病例組織石蠟標本。

2 改良Gordon-Sweets法染色

由兩位授權(quán)的中級病理技術(shù)員嚴格按照改良Gordon-Sweets法操作規(guī)程進行染色，銀氨液新鮮配制，銀氨液經(jīng)驗證效果符合診斷要求。將10例肝臟大體切除石蠟標本按照4um連續(xù)切片，在65℃烤箱中30min，二甲苯梯度酒精脫蠟至水，接著按照改良Gordon-Sweets法操作規(guī)程進行染色：①酸化高錳酸鉀液氧化5min后稍水洗。②2%草酸漂白2min后稍水洗，再用蒸餾水水洗。③2%硫酸鐵氨液媒染5min后蒸餾水稍水洗。④Gordon-Sweets銀氨液作用1min。⑤將連續(xù)切片分別用兩缸蒸餾水進行浸洗，兩缸蒸餾水浸洗時間相同，浸洗總時間分別為30s、60s、90s、110s、120s、130s、150s、3min、5min、10min、15min、20min。⑥10%中性甲醛液還原1min后流水沖洗10min。⑦核固紅液染胞核10min后稍水洗。⑧脫水透明，中性樹膠封固。以上實驗均在常溫下進行。

3 評價及驗證

由兩位主治病理醫(yī)師獨立評分，網(wǎng)狀纖維著色強度按強中弱進行評價（強為3分，中等強度為2分，弱為1分）；背景采用信噪比評價，分為優(yōu)、良、差3個等級；根據(jù)病理診斷要求對染色效果從0—10分進行評分，最差為0分，最好為10分；選擇最佳染色方法（最佳的染色強度對應(yīng)的方法）對146例肝癌病例組織進行染色，驗證該方法的有效性。

4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS V16.0 進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差表示，統(tǒng)計資料率比較采用χ2檢驗，以P＜0.05差異為具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

切片在蒸餾水浸洗30s至2min之間，網(wǎng)狀纖維染色強度不變，均染成棕黑色，不同時間點均有9例呈強陽，1例呈中等強度，但1min前的切片殘留銀離子較多，信噪比差；隨著時間增加信噪比逐步改善，在蒸餾水浸洗2min時網(wǎng)狀纖維染色強，定位準確，且背景干凈，信噪比最佳；2min后網(wǎng)狀纖維結(jié)合Ag(NH3)2+開始逐步解離，鏡下網(wǎng)狀纖維由棕黑色漸變紫色，15min以后Ag(NH3)2+多完全解離，網(wǎng)狀纖維變成紫紅色，不能滿足病理診斷（圖1、2，表1）。根據(jù)兩位主治病理醫(yī)師盲評結(jié)果進行統(tǒng)計分析顯示：切片在蒸餾水中浸洗2min，評分均值最高，為9.9±0.31，能夠滿足病理診斷需求（表2）。

圖1 銀氨溶液反應(yīng)后不同蒸餾水浸泡時間對網(wǎng)狀纖維染色效果的影響。比例尺，20μmFig. 1 The effect of different distilled water immersion time after silver ammonia solution reaction on the reticular fiber staining. Scale bar, 20μm

表1 Gordon-Sweets網(wǎng)狀纖維染色后蒸餾水浸洗時間對染色效果的影響Tab. 1 Effect of distilled water immersion time after Gordon-Sweets reticular fiber staining on the staining result

圖2 銀氨溶液反應(yīng)后銀氨離子在蒸餾水中解離曲線Fig. 2 Dissociation curve of silver ammonium ions in distilled water after reaction in silver ammonia solution

表2 Gordon-sweets網(wǎng)狀纖維染色后蒸餾水浸洗時間對病理診斷評分的影響Tab. 2 Influence of distilled water immersion time on the pathological diagnosis score

在146例的肝癌病例組織切片中采用Gordon-sweets網(wǎng)狀纖維染色后蒸餾水浸洗120s的最佳方法進行網(wǎng)狀纖維染色，穩(wěn)定性及一致性好，優(yōu)片率達到98.6%(144/146)，不但滿足臨床病理診斷，也改善了診斷醫(yī)生閱片的體驗。

討 論

網(wǎng)狀纖維有多種染色方法，最常應(yīng)用的是改良Gordon-Sweets法，該方法主要利用酸化高錳酸鉀把網(wǎng)狀纖維表面嗜銀糖蛋白的羥基氧化成醛基，然后在媒染劑的作用下與Ag(NH3)2+結(jié)合，經(jīng)甲醛還原后變成黑色的金屬銀，把網(wǎng)狀纖維染成黑色[1]。有研究顯示：銀氨液配制有效與否是網(wǎng)狀纖維染色的成功的關(guān)鍵，因此銀氨液需新鮮配制，并及時使用，才能保證網(wǎng)狀纖維染色質(zhì)量[3]。同時由于自來水中含有氯離子可以與Ag(NH3)2+反應(yīng)生成氯化銀沉淀，影響染色質(zhì)量，因此在銀氨液反應(yīng)后應(yīng)用蒸餾水進行沖洗[4,5]?，F(xiàn)有理論上并沒有明確蒸餾水水洗時間，導致病理技術(shù)從業(yè)者在行網(wǎng)狀纖維染色時，個體化差異明顯，染色質(zhì)量不穩(wěn)定，批間差明顯，影響病理的鑒別診斷。

本研究嚴格按照改良Gordon-Sweets法的要求進行配制銀氨液，并驗證其有效性，及時運用于本實驗中，試劑的有效性保證了本實驗的質(zhì)量。研究顯示氫氧化二氨合銀是一種絡(luò)合物，能夠溶解于水，可完全電離[6]。根據(jù)氫氧化二氨合銀能在水中可完全電離的特性，本實驗在銀氨液反應(yīng)完后設(shè)置了不同的水洗時間并多次重復實驗，發(fā)現(xiàn)了網(wǎng)狀纖維結(jié)合的

Ag(NH3)2+在蒸餾水中的解離規(guī)律，切片經(jīng)銀氨液反應(yīng)完后在蒸餾水中浸洗2min時不但能獲得最佳的染色效果，強度合適，信噪比佳，可以滿足臨床病理診斷，也提高了病理診斷醫(yī)生的閱片的體驗；而在蒸餾水中浸洗2min后，網(wǎng)狀纖維結(jié)合的Ag(NH3)2+開始逐步解離，網(wǎng)狀纖維由棕黑色漸變成紫紅色，直到15min至20min時銀氨離子完全解離，網(wǎng)狀纖維變成深紫紅色，不能滿足病理診斷。本研究初步揭示了網(wǎng)狀纖維結(jié)合的Ag(NH3)2+在蒸餾水中的解離規(guī)律，為網(wǎng)狀纖維染色實踐操作提供了規(guī)范化的參考。

本實驗經(jīng)反復驗證發(fā)現(xiàn)了改良Gordon-Sweets法中對網(wǎng)狀纖維結(jié)合的Ag(NH3)2+在水中解離規(guī)律，有效地指導了網(wǎng)狀纖維的染色，解決了實踐中由于銀氨液反應(yīng)后水洗時間的不確定導致網(wǎng)狀纖維染色效果穩(wěn)定性較差，個體化差異明顯的問題，提高網(wǎng)狀纖維染色的穩(wěn)定性及一致性，值得在臨床實踐中進一步推廣應(yīng)用。