磷酸化的mTOR、p70S6K及4EBP1在食管鱗狀上皮癌變中的表達(dá)及其意義

劉小紅，李麗，李雪婷，張振華

（1山西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，太原 030000；2山西醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)院，山西白求恩醫(yī)院病理科，太原 030032）

食管鱗狀細(xì)胞癌是我國(guó)常見的食管癌病理類型，起病隱匿，受內(nèi)外多種因素共同作用，往往經(jīng)歷低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變，從而進(jìn)展為浸潤(rùn)性鱗狀細(xì)胞癌。mTOR（哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白）是一種絲/蘇氨酸激酶，是生理和病理過程中重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子, 在細(xì)胞增殖、分化、自噬、凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1]。磷酸化的mTOR（p-mTOR）可作用于下游效應(yīng)因子4EBP1（真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1）和p70S6K（核糖體40S小亞基S6蛋白激酶），參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究表明，mTOR/p70S6K通路在卵巢癌中被激活，卡鉑可快速抑制mTOR、p70S6K和4EBP1的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞停滯在G0/G1期[2]。大部分乳腺癌患者都可觀察到PI3K/Akt/mTOR 通路的信號(hào)異?，F(xiàn)象，mTOR抑制劑依維莫司已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)可以治療晚期乳腺癌患者[3]。在體外和體內(nèi)對(duì)腎細(xì)胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)，mTOR信號(hào)通路中底物（p70S6K、4EBP1和AKT）的磷酸化可以促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)增殖[4]。mTOR信號(hào)通路通常在腫瘤中被激活，通過調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和免疫細(xì)胞分化，是目前腫瘤研究的熱點(diǎn)[5]。食管鱗癌中PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路被激活[6]，但mTOR及其下游靶點(diǎn)p70S6K和4EBP1在食管癌變過程中的表達(dá)變化尚未見報(bào)道。本研究選取p-mTOR、p-p70S6K及p-4EBP1為研究對(duì)象，探討各因子在食管癌變過程中（正常-低/高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變-鱗癌）的蛋白表達(dá)，并分析與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

材料與方法

1 臨床標(biāo)本與資料收集

收集山西白求恩醫(yī)院病理科2015-2019年明確病理診斷且術(shù)前未進(jìn)行放化療的食管鱗狀細(xì)胞癌樣本（剔除小活檢和會(huì)診病例）89例，癌旁高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織34例，低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織17例，正常食管黏膜上皮組織59例。所有標(biāo)本均具有完整的臨床病理資料及實(shí)驗(yàn)所需蠟塊。

2 主要試劑與設(shè)備

兔抗人p-mTOR單克隆抗體（Ser2448，2976S）及兔抗人p-4EBP1單克隆抗體（2855S）均購(gòu)自德國(guó)Cell Signaling Technology（CST）公司、兔抗人p-p70S6K單克隆抗體（AP0502）購(gòu)自武漢愛博泰克生物科技有限公司（ABclonal），生物素標(biāo)記抗兔IgG和HRP標(biāo)記抗兔IgG購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。免疫組織化學(xué)染色儀（Bench Mark XT）購(gòu)自上海羅氏診斷產(chǎn)品有限公司，石蠟切片機(jī)（S17040828）、烤片機(jī)（Thermo）購(gòu)自英國(guó)賽默飛世爾公司，顯微鏡（BX51）購(gòu)自O(shè)LYMPUS公司。

3 組織芯片制備

收集實(shí)驗(yàn)所需食管鱗狀細(xì)胞癌、上皮內(nèi)瘤變及正常食管上皮組織蠟塊和相應(yīng)的HE切片，顯微鏡觀察HE染色切片，圈標(biāo)代表性病變區(qū)域，對(duì)應(yīng)標(biāo)注石蠟組織塊上相應(yīng)目標(biāo)區(qū)域。制作空白組織芯片石蠟?zāi)＞?，使用空心針從石蠟組織塊目標(biāo)區(qū)域中穿取出直徑為2mm的組織芯，然后將這些組織芯以預(yù)定的排列模式小心地填充入空白組織芯片石蠟?zāi)＞撸M織芯與蠟?zāi)Ｈ诤虾髠溆谩?/p>

4 免疫組織化學(xué)染色

將組織芯片蠟塊4μm厚連續(xù)切片，分置于防脫載玻片上，70℃烤箱中烤片60min。p-mTOR、pp70S6K免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)采用EnVision兩步法：切片置于羅氏Bench Mark XT免疫組織化學(xué)染色儀中,經(jīng)抗原修復(fù)后，先后滴加一抗 (p-mTOR 1:50稀釋,p-p70S6K 1:50稀釋）和HRP標(biāo)記抗兔IgG孵育，DAB呈色后手工蘇木素復(fù)染、分化、酒精脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片。p-4EBP1免疫組化實(shí)驗(yàn)采用SABC法：切片經(jīng)二甲苯脫蠟、酒精水化、抗原修復(fù)、滴加一抗 (p-4EBP1 1:800稀釋)置于4℃冰箱中過夜，隔日依次滴加生物素標(biāo)記抗兔IgG、鏈霉親和素-生物素-酶復(fù)合物孵育，DAB顯色、蘇木素復(fù)染、分化、酒精脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片。用已明確陽性的乳腺癌組織分別作為p-mTOR、p-p70S6K的陽性對(duì)照，用已明確陽性的結(jié)腸癌組織作為p-4EBP1的陽性對(duì)照，以0.01mol/L PBS (pH7.4)代替一抗作為各指標(biāo)的陰性對(duì)照。

5 結(jié)果判讀

全部標(biāo)本均由兩位高年資病理醫(yī)師經(jīng)顯微鏡診斷證實(shí)。采用雙盲法顯微鏡下觀察結(jié)果，如出現(xiàn)判定結(jié)果不一致時(shí)，由第三名研究者做最終結(jié)果認(rèn)定。 pmTOR表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核, p-p70S6K表達(dá)定位在細(xì)胞核，p-4EBP1表達(dá)定位于核膜及胞漿，陽性信號(hào)為可見定位準(zhǔn)確的黃色著色。采用H-score評(píng)分[7]，高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野(每個(gè)視野觀察細(xì)胞數(shù)不少于200個(gè)), 按染色強(qiáng)度及各染色強(qiáng)度細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)進(jìn)行結(jié)果判定：染色強(qiáng)度（I）評(píng)分: 未著色0分，淺黃色1分，黃色2分，黃褐色3分；各染色強(qiáng)度細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)（PC）= (各染色強(qiáng)度細(xì)胞數(shù)/觀察的細(xì)胞總數(shù))×100。最后計(jì)算的H-score分值 = ∑(I×PC)，I代表染色強(qiáng)度(0、1、2、3)，PC代表該染色強(qiáng)度細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)(0-100)，分值范圍0-300，以分值≥30分為陽性標(biāo)準(zhǔn)[8]，分值＜30認(rèn)定為陰性。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 25.0軟件進(jìn)行分析，組間蛋白表達(dá)差異比較采用Kruskal-Wallis H 秩和檢驗(yàn)，與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系分析采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman分析，P＜0.05表示結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 食管鱗狀細(xì)胞癌中p-mTOR和p-4EBP1水平升高，p-p70S6K水平降低

免疫組織化學(xué)染色顯示：p-mTOR在食管鱗狀細(xì)胞癌、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組中高表達(dá)，明顯高于低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組及正常組；p-p70S6K在正常組、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組中蛋白表達(dá)依次增加，在高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組達(dá)到最高，且強(qiáng)度達(dá)到最強(qiáng)，然而在鱗狀細(xì)胞癌中低表達(dá)；p-4EBP1在鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)，在正常組織中低表達(dá)（圖1，表1）。

表1 p-mTOR、p-p70S6K和p-4EBP1在不同組織類型中表達(dá)水平比較（H-score）Tab. 1 Comparison of the expression level of p-mTOR, p-p70S6K and p-4EBP1 in the selected tissues（H-score）

圖1 不同組織類型的組織學(xué)與免疫組織化學(xué)檢測(cè)。HE，HE染色；p-mTOR、p-p70S6K和p-4EBP1，p-mTOR、p-p70S6K和p-4EBP1免疫反應(yīng)性的免疫組織化學(xué)Envision或SABC法染色； Normal：正常食管粘膜；LGIN：低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變；HGIN：高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變；SCC:鱗狀細(xì)胞癌；比例尺，100μmFig. 1 Histological and immunohistochemical examination of the selected tissues. HE, HE staining; p-mTOR, p-p70S6K and p-4EBP1, immunohistochemical EnVision or SABC staining for the immunoreactivity of p-mTOR, p-p70S6K and p-4EBP1; Normal, normal tissue away from cancerous tissue; LGIN, low grade intraepithelial neoplasia; HGIN, high grade intraepithelial neoplasia; SCC: squamous cell carcinoma; scale bar, 100μm

2 食管鱗狀細(xì)胞癌中p-mTOR、p-p70S6K、p-4EBP1蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

非參數(shù)秩和檢驗(yàn)分析表明（表2），食管鱗狀細(xì)胞癌中，p-mTOR水平與腫瘤病理分級(jí)呈正相關(guān)（在I—III級(jí)表達(dá)遞增），在粘膜層及纖維膜層顯著高于肌層； p-p70S6K蛋白表達(dá)與腫瘤臨床分期和浸潤(rùn)深度呈負(fù)相關(guān)，與其余臨床病理參數(shù)無關(guān)；p-4EBP1表達(dá)與腫瘤臨床病理參數(shù)無關(guān)。

表2 食管鱗狀細(xì)胞癌組織中p-mTOR、p-p70S6K和p-4EBP1 水平與臨床病理參數(shù)之間關(guān)系分析Tab.2 Analysis of the correlation between p-mTOR, p-p70S6K and p-4EBP1 level and clinicopathological parameters of esophagus squamous cell carcinoma

3 鱗狀細(xì)胞癌組織中p-mTOR、p-p70S6K和p-4EBP1水平間相關(guān)性

以國(guó)際公認(rèn)的H-score≥30認(rèn)定為陽性，Hscore＜30認(rèn)定為陰性。Spearman分析表明，在鱗狀細(xì)胞癌組織中，p-p70S6K與p-4EBP1水平之間具有弱相關(guān)性（P＜0.01，r=0.285），其余因子之間蛋白表達(dá)均無相關(guān)性（表3）。

表3 鱗狀細(xì)胞癌組織中p-mTOR、p-p70S6K和p-4EBP1水平間的相關(guān)性分析Tab. 3 Relevance analysis of p-mTOR, p-p70S6K and p-4EBP1 level in esophagus squamous cell carcinoma

討 論

mTOR上調(diào)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[9-11]，mTOR及其下游效應(yīng)因子與乳腺癌、胃癌等多種腫瘤的預(yù)后相關(guān)[12,13]。本次研究顯示，p-mTOR在食管鱗癌組、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組中均高表達(dá)，明顯高于低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組及正常組，且食管鱗狀細(xì)胞癌中p-mTOR水平與腫瘤病理分級(jí)及浸潤(rùn)深度相關(guān),這與之前的一項(xiàng)薈萃分析結(jié)果相同[14]。p-mTOR作為基因轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)合成的正性調(diào)控因子，隨腫瘤細(xì)胞惡性程度升高其表達(dá)水平升高，對(duì)于判斷預(yù)后有一定的意義，臨床工作中可根據(jù)表達(dá)水平的波動(dòng)對(duì)治療方案進(jìn)行個(gè)體化的調(diào)整。

本次研究還發(fā)現(xiàn)，p-p70S6K在食管正常組、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組及高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組中水平遞增，在鱗癌組中表達(dá)反而下降。然而，基于肺癌等的研究發(fā)現(xiàn)，p70S6K及p-p70S6K在腫瘤組織中表達(dá)升高[15,16]，由此表明p70S6K參與致瘤性和癌癥進(jìn)展，這與本次實(shí)驗(yàn)結(jié)論不同。在一項(xiàng)胃癌及腺瘤組織的對(duì)比研究中同樣存在類似困惑，Li等人研究發(fā)現(xiàn)p-p706SK在腺瘤細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中均呈高表達(dá)，但在胃癌組織中，胞質(zhì)表達(dá)水平較高，但胞核表達(dá)卻顯著降低，呈現(xiàn)較為復(fù)雜的表達(dá)狀況。進(jìn)一步分析表明，p-p70S6K核表達(dá)可能對(duì)胃癌起一定的抑制作用[17]。p70S6K作為mTOR的下游效應(yīng)因子，通過mTOR磷酸化為p-p70S6K，從而使其翻譯活性大幅度增加（約為p70S6K的100倍），但p70S6K的激活過程非常復(fù)雜，需要至少7個(gè)絲氨酸/蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)。因此，在腫瘤癌變過程中，p-p70S6K蛋白表達(dá)受多種因素影響?；诒狙芯糠治觯覀兛紤]p-p70S6K可能是食管鱗癌發(fā)生過程中的早期事件，雖然在癌組織中表達(dá)低于上皮內(nèi)瘤變組，但其表達(dá)顯示與浸潤(rùn)深度及臨床分期相關(guān)，依然可以提示與腫瘤存在較差的生物學(xué)行為相關(guān)。p-p70S6K復(fù)雜的致瘤機(jī)制需要進(jìn)一步研究加以闡明。因我們目前研究病例數(shù)量少，已有研究仍然存在一些局限性，因此，準(zhǔn)確結(jié)果有待進(jìn)一步深入研究加以確認(rèn)。

4EBP1是翻譯阻遏蛋白家族的成員，是mTOR的下游效應(yīng)因子，其磷酸化可以促進(jìn)翻譯。目前，已經(jīng)在多種癌中發(fā)現(xiàn)了4EBP1的過度磷酸化和過表達(dá)同時(shí)發(fā)生[18,19]。本實(shí)驗(yàn)顯示p-4EBP1在食管正常組、低級(jí)別、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組、鱗癌組中表達(dá)呈遞增趨勢(shì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與之前食管癌已有研究結(jié)果一致[20]，表明p-4EBP1過表達(dá)是食管癌發(fā)生及發(fā)展的原因。在前列腺癌的研究中同樣發(fā)現(xiàn)，高水平的p-4EBP1與前列腺癌患者的死亡率升高顯著相關(guān)，這意味著mTOR通路的下游效應(yīng)可能是前列腺癌進(jìn)展的潛在預(yù)后指標(biāo)[21]。但p-4EBP1與食管癌的預(yù)后及惡性生物學(xué)行為的關(guān)系，尚不明確。

mTOR激活與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展、侵襲和遷移有關(guān)，且在轉(zhuǎn)移性癌中p-mTOR表達(dá)高于原發(fā)灶，pmTOR表達(dá)在腺癌中高于其他類型的癌癥[22]。當(dāng)前，正在開發(fā)多種mTOR抑制劑（雷帕霉素及雷帕霉素類似物）[23]，已有一些mTOR抑制劑用于肺癌[24]、胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤[25]等的靶向治療，且取得了一定的療效。此外，在肺癌中研究發(fā)現(xiàn)，p70S6K抑制劑PF-4708671以濃度依賴性方式顯著抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[16]。在黑色素細(xì)胞瘤的研究中表明，mTOR抑制劑依維莫司降低黑素瘤細(xì)胞的侵襲性[26]?？傊嚓P(guān)抑制劑已經(jīng)在多種腫瘤中展現(xiàn)出其治療潛力，但在食管癌中的研究較少，尚未發(fā)現(xiàn)有效靶向治療藥物，因此亟待研究。

本研究發(fā)現(xiàn)p-mTOR及p-4EBP1水平在食管癌變過程中升高，提示其可能發(fā)揮促癌作用。p-p70S6K在食管癌前病變中促進(jìn)惡性轉(zhuǎn)變，p-p70S6K可能是食管癌變過程中的早期事件。三者在食管癌發(fā)生過程中發(fā)揮協(xié)同促癌作用，聯(lián)合檢測(cè)可對(duì)早期食管癌的發(fā)生具有一定預(yù)警作用。p-mTOR蛋白表達(dá)與腫瘤病理分級(jí)呈正相關(guān)，p-mTOR在粘膜層及纖維膜層顯著高于肌層，p-p70S6K蛋白表達(dá)與腫瘤臨床分期、浸潤(rùn)深度呈負(fù)相關(guān)。因此，檢測(cè)相關(guān)因子可以用于臨床評(píng)估預(yù)后，指導(dǎo)靶向藥物的開發(fā)、研究和應(yīng)用。

p-mTOR表達(dá)在腺癌中高于其他類型的癌癥，mTOR通路相關(guān)蛋白的研究大部分著眼于腺癌。食管鱗癌發(fā)病主要集中于我國(guó)，且具有地域特征，整體研究較少且局限，本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)初步檢測(cè)了食管鱗狀上皮癌變過程中p-mTOR、pp70S6K及p-4EBP1水平變化，分析了其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，得出的相關(guān)結(jié)論仍需進(jìn)行細(xì)胞及分子水平的研究驗(yàn)證，與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性也需要更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持與修正。