嫁接于3個(gè)棗園病砧的抗病接穗棗瘋植原體檢測(cè)及分子變異*

張文鑫 于少帥 田國(guó)忠 王 合 任爭(zhēng)光 王圣潔 孔德治 李 永 林彩麗

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所 國(guó)家林業(yè)和草原局森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100091； 2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所 文昌 571339；3.北京市林業(yè)保護(hù)站 北京 100029；4.北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 北京 102206)

由植原體(phytoplasma)引起的棗瘋病(jujube witches’-broom，JWB)是威脅我國(guó)棗樹(Ziziphusjujuba)栽培和紅棗生產(chǎn)的最嚴(yán)重病害之一。該病害傳染性強(qiáng)、分布范圍廣、危害嚴(yán)重；病樹結(jié)棗少、品質(zhì)下降或不結(jié)棗，小樹1～2年、大樹5～6年即全株死亡，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失(田國(guó)忠，2002)。棗瘋病的防治措施主要有選用無(wú)病繁殖材料、推廣抗病或耐病品種、清除病株和野生酸棗毒源、殺滅或趨避傳病媒介、病樹抗生素治療及水肥管理等栽培和生態(tài)控制等(王焯等，1988；田硯亭等，1993；田國(guó)忠等，2009)。

我國(guó)是棗樹原產(chǎn)地，栽培歷史悠久，種質(zhì)資源豐富，其中一些品系表現(xiàn)出對(duì)棗瘋病的高度感病，而另一些品系則表現(xiàn)出不同程度的自然抗病能力(曲澤洲等，1991；田國(guó)忠等，1999)。有學(xué)者通過(guò)人工接種-嫁接手段鑒定和篩選出抗病品系(種)(溫秀軍等，2005；趙錦等，2006；趙京芬等，2011)。任爭(zhēng)光等(2015)采用分子檢測(cè)手段對(duì)抗病與感病品系染病后病原菌濃度的比較研究初步揭示了某些抗病品系對(duì)病原菌生長(zhǎng)與繁殖的抑制作用。病原菌因環(huán)境和寄主的選擇壓力作用存在廣泛的遺傳變異與多樣性，因此，充分了解不同地區(qū)病原菌變異不僅有助于預(yù)測(cè)病害的發(fā)生和流行規(guī)律，而且及時(shí)監(jiān)測(cè)病原菌的致病性變異對(duì)合理利用抗病遺傳資源、預(yù)防病害爆發(fā)性流行、控制棗瘋病等均具有重要意義(馬占鴻，2010；于少帥等，2016)。

植原體難于人工培養(yǎng)，從技術(shù)上很難獲得單克隆菌株，因此病菌變異分析的難度較大。王海妮等(2002)利用16SrDNA和tuf基因比較發(fā)現(xiàn)，陜西、河北、山東的棗瘋病病原一致。Bu等(2016)對(duì)我國(guó)北方4省棗瘋植原體株系16S rDNA進(jìn)行克隆測(cè)序，測(cè)得其同源性超過(guò)99.8%，推測(cè)4省棗瘋植原體廣泛傳播與其高度保守性特征相關(guān)。徐啟聰?shù)?2009)以16S rDNA、16S-23S間區(qū)序列(SR)和secY基因片段為靶標(biāo)研究我國(guó)不同地區(qū)棗瘋病分離物的分子變異，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)、不同品種上的棗瘋植原體間存在較為豐富的遺傳變異。目前，對(duì)于寄主抗病反應(yīng)、癥狀表現(xiàn)、環(huán)境適合度相關(guān)的植原體群體的生長(zhǎng)繁殖規(guī)律、分子變異特性等仍不明確。本研究在對(duì)我國(guó)主要棗產(chǎn)區(qū)抗病資源調(diào)查與鑒定的基礎(chǔ)上，選擇有代表性的抗病品系在3個(gè)不同背景已感染棗瘋病的棗園進(jìn)行嫁接傳病試驗(yàn)，采集三地不同品種、不同抗性和不同病級(jí)棗樹接穗和砧木樣品作為試材，采用直接PCR、巢式PCR和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)對(duì)嫁接接種后的砧木和接穗感染植原體狀況進(jìn)行檢測(cè)；同時(shí)，利用16S rDNA、SR、secA基因、tuf基因、fusA-tuf基因間區(qū)、himA及其下游假定蛋白基因序列等基因片段進(jìn)行分析，揭示病原遺傳變異規(guī)律和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，以期為抗病品系合理利用與病害防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試樣品

嫁接傳病試驗(yàn)地為北京玉泉山棗樹資源圃(YQ)、北京昌平王家園(CP)和河北唐縣軍城鎮(zhèn)(JC)3個(gè)棗園。選取棗園內(nèi)自然發(fā)病IV-V級(jí)的棗樹作為砧木，當(dāng)年3—4月采集不同品種的健康接穗，于當(dāng)年4月底采用插皮接方式嫁接到上述發(fā)病砧木上。昌平王家園嫁接用發(fā)病砧木品種為冬棗(Z.jujuba‘Dongzao’)；河北唐縣軍城鎮(zhèn)棗園發(fā)病砧木品種為當(dāng)?shù)馗胁∑艞?Z.jujuba‘Pozao’)；玉泉山有9株嫁接樹，其中2株棗樹砧木嫁接多接穗，苗圃地T19砧木上嫁接4種接穗，分別為T27(2016和2017年都有成活嫁接枝)、T30、Z18、50號(hào)；中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院(CAF)內(nèi)1株未知品系砧木(2009年嫁接時(shí)砧木無(wú)癥，2016年發(fā)病)嫁接3種接穗，分別為T27、M11、JK。同時(shí)在玉泉山苗圃用健康接穗嫁接到健康砧木上作為對(duì)照處理。接穗及砧木抗性情況見表1。

表1 不同棗樹品種對(duì)棗瘋病抗性情況Tab.1 The resistance information of different jujube cultivars to jujube witches’broom

2017年8—10月，采集北京玉泉山棗樹資源圃、北京昌平王家園和河北唐縣軍城鎮(zhèn)棗園三地棗樹材料樣品57份。同時(shí)選取國(guó)內(nèi)幾個(gè)地區(qū)棗瘋病樣品9份，分別為江蘇泗洪大棗4份(JWB-JSSH-QC1、JWB-JSSH-QC2、JWB-JSSH-QC3、JWB-JSSH-FJT)、山東泰安JWB-SDTA、河北唐縣軍城鎮(zhèn)梁家溝JWB-HBTX-LJG、河北唐縣軍城鎮(zhèn)史家溝JWB-HBTX-SJG、山東泰安長(zhǎng)寧縣葛石鎮(zhèn)東長(zhǎng)紅棗(Z.jujuba‘Changhongzao’)JWB-SDTA-GSZD、北京通州區(qū)瑞正園農(nóng)莊JWB-BJTZ-RZY。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集與DNA提取 采集3個(gè)棗園不同材料中有典型棗瘋病癥的棗樹組織，無(wú)癥樣品選取1年生枝條梢部棗吊葉片,同時(shí)進(jìn)行綜合病級(jí)劃分(I-V級(jí))(任爭(zhēng)光等，2015)，單純黃葉癥狀分級(jí)方法為i～iii，其中葉緣或葉面斑駁輕微發(fā)黃褪綠為黃葉i級(jí)，ii級(jí)為葉面2/3發(fā)黃或僅主葉脈未褪綠，iii級(jí)黃葉為全葉發(fā)黃變脆。將采集的棗樹樣品分別裝袋并標(biāo)記，干燥備用。植物總DNA提取參照艾德萊生物科技有限公司CTAB法植物基因組DNA快速提取試劑盒說(shuō)明書。

1.2.2 植原體分子檢測(cè) 利用通用引物對(duì)P1/P7(Dickinsonetal.,2013)和R16 mF2/R16 mR1(Leeetal.,1993)對(duì)棗樹樣品DNA進(jìn)行PCR和Nested-PCR。LAMP檢測(cè)參考廣州迪澳生物科技有限公司恒溫?cái)U(kuò)增試劑盒的說(shuō)明書。采用顯色法對(duì)提取的總DNA進(jìn)行63 ℃水浴恒溫?cái)U(kuò)增(王圣潔等，2017)。

1.2.3 棗瘋植原體基因與基因間區(qū)的擴(kuò)增測(cè)序與序列分析 將棗樹DNA樣品進(jìn)行16S rDNA、SR(Changetal.,2004)、secA基因(Hodgettsetal.,2008)、tuf基因(Dickinsonetal.,2013)、himA及其下游假定蛋白基因(設(shè)計(jì)引物對(duì)himA-F 5′-TAGAAATACCTGCGAAAACC-3′/himA-R 5′-AAGGA AGATTGTTCATTAATTG-3′擴(kuò)增,退火溫度54 ℃)、fusA-tuf基因間區(qū)(于少帥等，2016)PCR擴(kuò)增。將具有陽(yáng)性結(jié)果的PCR產(chǎn)物送北京博邁德基因技術(shù)有限公司測(cè)序。利用DNAMAN6.0對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析和手工校驗(yàn)，用DNAman6.0和MEGA5.0對(duì)所得序列進(jìn)行校驗(yàn)、拼接、比對(duì)和分子進(jìn)化遺傳分析。

1.2.4 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 將3個(gè)棗園不同樣品各基因的測(cè)序結(jié)果分別與GenBank中已報(bào)道的植原體不同組的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，建樹采用NJ法，Bootstrap 值為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 3個(gè)棗園棗樹嫁接傳毒癥狀表現(xiàn)與樣品的直接PCR、巢式PCR和LAMP檢測(cè)

將抗性程度不同品系的休眠接穗嫁接到發(fā)病嚴(yán)重的感病砧木(一般為IV-V級(jí))上，接穗上的萌芽表現(xiàn)出的癥狀包括小葉、叢枝、花梗延長(zhǎng)、花變?nèi)~、脈間褪綠、葉片黃化、褐化、卷葉等，其中感病的砧木，包括昌平棗園的冬棗、唐縣軍城的婆棗、玉泉山棗資源圃的泗洪大棗、襄汾圓棗、晉棗、酸棗等發(fā)病砧木及感病接穗濮陽(yáng)冬棗主要表現(xiàn)為叢枝、小葉、花變?nèi)~等典型癥狀?？共∑废到铀隩30和T27在嫁接早期常出現(xiàn)花梗延長(zhǎng)現(xiàn)象，但多未進(jìn)一步發(fā)展成花變?nèi)~，而大都能正常開花結(jié)果；在正常光照生長(zhǎng)條件下二者也未產(chǎn)生叢枝癥狀，T27多表現(xiàn)出典型的葉片黃化癥狀，T30則很少產(chǎn)生葉片黃化癥狀；但在遮蔭或光照不足的條件下，這2個(gè)品系皆產(chǎn)生了小葉叢枝癥狀(表2)。

表2 3個(gè)棗園不同品種接穗嫁接后癥狀表現(xiàn)及植原體檢測(cè)結(jié)果①Tab.2 Symptom and phytoplasma detection results of different cultivars after grafting transmission in three jujube orchards

續(xù)表2 Continued

中抗品系蜂蜜罐M11接穗嫁接接種后的表現(xiàn)復(fù)雜多樣，初期表現(xiàn)出葉片脈間褪綠、花梗延長(zhǎng)，進(jìn)一步表現(xiàn)葉片黃化、卷葉(上卷)、部分葉片局部褐化壞死、部分新梢出現(xiàn)小葉、叢枝、花變?nèi)~等癥狀，后期部分變態(tài)葉又能逆轉(zhuǎn)抽出近正常形狀和葉色的葉片。

待鑒定品系Z18接穗嫁接初期也觀察到部分花梗延長(zhǎng)癥狀，但后期開花均正常發(fā)育且當(dāng)年結(jié)果，枝葉生長(zhǎng)正常，表現(xiàn)出對(duì)植原體的高度抗性(HR)；而且其嫁接砧木枝條的叢枝癥狀也明顯減輕、個(gè)別萌條叢枝癥狀消失。

從北京古棗樹篩選的抗病品系50號(hào)在三地的癥狀反應(yīng)有明顯差異。在玉泉山與Z18嫁接同一母株不同分支砧木上的50號(hào)接穗當(dāng)年癥狀嚴(yán)重，其下部砧木也發(fā)病嚴(yán)重(皆為V級(jí))；昌平接穗則表現(xiàn)為無(wú)癥；而在唐縣軍城的50號(hào)是嫁接在無(wú)癥的酸棗砧木上，但當(dāng)年也感染發(fā)病嚴(yán)重。

巢式PCR檢測(cè)結(jié)果表明，來(lái)源于玉泉山苗圃的棗樹抗病品系的采穗樹Z18、T27、T30、M11均未檢測(cè)到植原體；但用LAMP的復(fù)核檢測(cè)驗(yàn)證結(jié)果顯示，除T30外，Z18、M11、T27無(wú)癥采穗母樹皆檢測(cè)陽(yáng)性。而嫁接到發(fā)病砧木上的一直未表現(xiàn)癥狀的T30接穗用直接和巢式PCR及LAMP均檢測(cè)不到植原體的感染，即使在遮蔭條件下表現(xiàn)出小葉叢枝的樣品中也未檢測(cè)到植原體，表現(xiàn)出高度抗感染能力。Z18接穗嫁接到北京玉泉山資源圃和河北唐縣軍城的發(fā)病砧木上皆表現(xiàn)為健康無(wú)癥或個(gè)別黃葉癥狀，其中玉泉山黃葉未檢測(cè)到植原體，而軍城無(wú)癥樣品卻檢測(cè)到植原體?？共〗铀隩27黃葉癥狀部位同樣檢測(cè)到植原體，而對(duì)花變?nèi)~部位的檢測(cè)結(jié)果則是玉泉山資源圃的樣品用直接和巢式PCR皆檢測(cè)到植原體，而昌平棗園嫁接的T27和Z25及感病的L2接穗花變?nèi)~部位未檢測(cè)到植原體，但以上樣品用LAMP卻檢測(cè)到植原體。對(duì)中度抗病的M11接穗不同癥狀樣品的檢測(cè)結(jié)果顯示，脈間褪綠、花梗延長(zhǎng)、叢枝、小葉和花變?nèi)~部位皆易于檢測(cè)到植原體的感染。對(duì)昌平嫁接的50號(hào)無(wú)癥接穗用3種方法都能檢測(cè)到植原體感染。表現(xiàn)花變?nèi)~、小葉叢枝等癥狀乃至無(wú)癥的感病接穗與砧木樣品包括冬棗、泗洪大棗、婆棗等品系、酸棗及不同地區(qū)采集的典型棗瘋病樣品大多用直接PCR即檢測(cè)到植原體，LAMP復(fù)核驗(yàn)證結(jié)果也與PCR結(jié)果完全吻合，表明這些樣品植原體濃度相對(duì)較高(表2)。

2.2 棗瘋植原體株系變異分析

2.2.1 不同靶標(biāo)基因和基因間區(qū)序列的PCR擴(kuò)增和測(cè)序 對(duì)采集樣品進(jìn)行的植原體其他基因與基因間區(qū)的PCR擴(kuò)增和直接測(cè)序，與序列比對(duì)(BLAST)結(jié)果顯示，42條16S rDNA序列、42條SR基因序列、31條secA基因序列和32條tuf基因序列各自同源性為100%，而himA及其下游假定蛋白基因序列以及fusA-tuf基因間區(qū)，序列變異率分別為9.6%和18.9%(表3)。且這些序列擴(kuò)增及比對(duì)結(jié)果也表明棗瘋植原體株系的均一性，即皆屬于16SrV-B亞組的候選種Candidatusphytoplasmaziziphi；也進(jìn)一步驗(yàn)證了直接PCR、巢式PCR和LAMP檢測(cè)植原體的結(jié)果，從而保障測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性。

表3 棗瘋植原體基因擴(kuò)增測(cè)序及各基因序列變異情況Tab.3 Sequences from gene amplification and variations of gene sequences of jujube switches’broom phytoplasma

2.2.2himA及下游假定蛋白(HP)基因序列分析himA基因編碼整合宿主因子亞基，在 DNA 修復(fù)和復(fù)制蛋白方面起作用(王景麗，2016)。Wang等(2018)在JWB全基因組中公布了himA和下游假定蛋白基因序列。通過(guò)序列比對(duì)在OY-M、AYWB基因組中也發(fā)現(xiàn)了同源性序列(圖1)。從38份樣品中擴(kuò)增himA及其下游假定蛋白基因序列并測(cè)序，得到長(zhǎng)度約523 bp的himA及其下游假定蛋白基因序列。分析其中313 bp的假定蛋白基因序列片段，在117 bp位點(diǎn)，有堿基的顛換；在154 bp位點(diǎn)，河北唐縣軍城鎮(zhèn)砧木3(嫁接接穗為Z18)有1個(gè)堿基A的插入；在190 bp位點(diǎn)，有堿基的顛換。根據(jù)3個(gè)位置堿基變化情況，將所測(cè)得38份樣品及洋蔥黃化和翠菊黃化植原體的himA及其下游假定蛋白基因序列，大體分為3種序列型，C-C型、C-A型和T-A型(表4)。

表4 38份樣品棗瘋植原體himA及其下游假定蛋白基因序列變異位點(diǎn)Tab.4 Variations of himA and its downstream hypothetical protein gene from 38 samples in three jujube orchards

圖1 OY-M、AYWB和JWB植原體himA及其下游假定蛋白基因位置和結(jié)構(gòu)Fig.1 Gene structure diagram of himA and its downstream hypothetical protein gene from OY-M，AYWB and JWB

系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析結(jié)果顯示，測(cè)序菌株大致可聚于這3種序列型。其中軍城鎮(zhèn)樣品序列聚于T-A型，玉泉山樣品與河北唐縣梁家溝棗瘋序列聚于C-A型，而昌平樣品和泗洪、泰安、通州棗瘋序列同聚于C-C型。以上結(jié)果顯示出明顯的地域性分化特點(diǎn)(圖2)。

圖2 38份棗瘋病材料基于himA及其下游假定蛋白基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(MEGA 5)Fig.2 Phylogenetic tree based on himA and its downstream hypothetical protein gene from 38 samples in three jujube orchards constructed with MEGA 5

2.2.3fusA-tuf基因間區(qū)的序列分析 經(jīng)擴(kuò)增和測(cè)序，得到長(zhǎng)度為338 bp的片段序列共29份，其中fusA-tuf基因間區(qū)序列長(zhǎng)度為53 bp，在間區(qū)39 bp位置有堿基A插入/缺失。于少帥等(2016)將16SrV組不同植原體株系fusA-tuf基因間區(qū)序列分為2種變異類型，變異類型TJ1(A-)和TJ2(A+)。其中TJ1型包括棗瘋病江蘇南京、江蘇鎮(zhèn)江、北京海淀、遼寧大連3個(gè)株系、遼寧葫蘆島2個(gè)株系、遼寧建昌、河南周口、河南洛陽(yáng)、安徽合肥、陜西渭南3個(gè)株系和重慶武隆2個(gè)株系，以及四川西昌櫻桃致死黃化植原體株系和安徽合肥重陽(yáng)木叢枝植原體株系。TJ2型僅包括河南濮陽(yáng)棗瘋植原體株系和北京海淀2個(gè)黃金槐叢枝植原體株系。

玉泉山和軍城鎮(zhèn)樣品大都屬于TJ2型，國(guó)內(nèi)其他地區(qū)各株系和昌平樣品大都為TJ1型。而YQ-RS-6、CP-SC-6以及CAF-SC-3是各地比較特殊序列株系，即與各地優(yōu)勢(shì)株系的類型不同。這3個(gè)株系在himA及其下游假定蛋白基因序列中也屬于特殊株系，即玉泉山砧木(接穗為T30)屬于軍城為主的T-A型，昌平M11接穗(砧木6)屬于玉泉山為主的C-A型。50號(hào)古樹接穗樣品的昌平株系屬于TJ1型，而玉泉山和軍城鎮(zhèn)株系屬于TJ2型(圖3)。

圖3 29份樣品與不同棗瘋植原體fusA-tuf基因間區(qū)變異位點(diǎn)Fig.3 Variations of fusA-tuf intergenic region from 29 samples in three jujube orchardsTJ1(A-)表示堿基A缺失，TJ1(A+)表示堿基A插入，TJ3-TJ31為已測(cè)定的29個(gè)樣品。TJ1(A-)means the deletion of A base.TJ1(A+)means the insertion of A base.TJ3-TJ31 means fusA-tuf genes of 29 samples.

3 討論

3.1 棗樹品種的抗病性

嫁接接后，抗病棗樹接穗的癥狀多數(shù)輕于對(duì)應(yīng)的感病砧木，甚至有部分抗性品種接穗表現(xiàn)無(wú)癥，如T27、T30、Z18等。同品種接穗在不同棗園有較明顯的癥狀表現(xiàn)差異，如北京古樹50號(hào)接穗在昌平王家園棗園表現(xiàn)抗性較好，而在玉泉山苗圃和唐縣軍城鎮(zhèn)棗園則發(fā)生V級(jí)嚴(yán)重小葉叢枝癥狀。這可能與地域環(huán)境差異有關(guān)，而三地棗瘋植原體株系的致病性分化也是潛在因素。中抗品系T30接穗的抗棗瘋病反應(yīng)較為特殊，較少產(chǎn)生抗病品種T27、Z17、M11等品種接穗的黃葉、卷葉等抗病表征；也無(wú)感病品種接穗的叢枝、花變?nèi)~等典型癥狀；在極端遮蔭條件下的接毒接穗僅產(chǎn)生小葉、矮縮和輕微腋芽萌生；接毒后無(wú)癥接穗與健康對(duì)照接近，能正常開花結(jié)果，且無(wú)畸形病果。

本研究首次對(duì)山西農(nóng)科院園藝所提供的‘駿優(yōu)2號(hào)’優(yōu)良品系進(jìn)行了抗棗瘋病能力測(cè)定。依據(jù)接穗嫁接于IV-V級(jí)病砧木上3個(gè)月后，接穗發(fā)病癥狀、病級(jí)和病情指數(shù)劃分棗樹品種抗病/感病類型(田國(guó)忠等，2013)，對(duì)3個(gè)棗園不同棗樹品種接穗棗瘋病情指數(shù)分析，Z18品種的9枝接穗(嫁接于軍城鎮(zhèn)2株婆棗和玉泉山1株泗洪大棗)均未發(fā)病，病情指數(shù)為0，暫定其為高度抗性品種(HR)。

3.2 棗瘋植原體himA及其下游假定蛋白基因和fusA-tuf基因間區(qū)的序列差異

本研究首次檢測(cè)到在這3個(gè)棗園內(nèi)棗瘋植原體株系的himA及其下游假定蛋白基因序列與fusA-tuf基因間區(qū)存在明顯的變異規(guī)律，即不同變異類型株系與地域差異有關(guān)，而與棗樹抗病性強(qiáng)弱明顯無(wú)相關(guān)性。通過(guò)對(duì)himA及其下游假定蛋白基因序列比對(duì)，可以將所測(cè)序3個(gè)棗園樣品和國(guó)內(nèi)幾個(gè)地區(qū)棗瘋樣品較清晰地分為3個(gè)類型。第1類為昌平棗園和國(guó)內(nèi)幾個(gè)地區(qū)菌株，第2類為玉泉山棗園菌株，第3類為軍城鎮(zhèn)棗園菌株。而fusA-tuf基因間區(qū)序列分析也支持了這個(gè)結(jié)論，尤其在幾個(gè)特殊序列株系玉泉山砧木(接穗為T30)、昌平M11接穗以及玉泉山林科院冀抗接穗的植原體地域變異上，himA及其下游假定蛋白基因序列與fusA-tuf基因間區(qū)序列的分析結(jié)果相吻合。而在tuf基因、secA基因、secY基因序列上并未發(fā)現(xiàn)明顯變異，一方面表明引起棗瘋病的植原體都屬于16SrV-B亞組植原體，并未發(fā)現(xiàn)與該組其他亞組植原體的混合感染，更未發(fā)現(xiàn)其他組植原體引致的棗瘋病(徐啟聰?shù)龋?009)，同時(shí)也表明這些保守持家基因的相對(duì)穩(wěn)定性。

關(guān)于玉泉山棗園棗瘋病的發(fā)生原因，特別是植原體來(lái)源，也是值得探討的問(wèn)題。最早推測(cè)為移栽泗洪大棗過(guò)程中誤傳入病原，2016年對(duì)江蘇泗洪進(jìn)行了棗瘋病調(diào)查采樣，本研究對(duì)該株系himA及其下游假定蛋白基因序列與fusA-tuf基因間區(qū)2個(gè)序列變異分析并未證實(shí)這種推論。江蘇的泗洪大棗棗瘋樣品序列與玉泉山的優(yōu)勢(shì)株系序列明顯不同，反而與昌平棗園優(yōu)勢(shì)株系序列有一定關(guān)聯(lián)，故判斷玉泉山病原可能是當(dāng)?shù)孛浇槔ハx傳播感染或者通過(guò)其他來(lái)源的無(wú)癥帶菌接穗或種苗而傳入該資源圃。因嫁接繁殖接穗來(lái)源多樣，更進(jìn)一步的溯源尚需要對(duì)所有引種地的相應(yīng)樣品的比較分析。而上述himA及其下游假定蛋白基因序列與fusA-tuf基因間區(qū)可以用作首選的靶標(biāo)序列。

3.3 棗樹抗病性鑒定要綜合評(píng)價(jià)，尤其注意抗病穩(wěn)定性

品種的遺傳和抗病特性、病原變異、砧木種類與癥狀嚴(yán)重度、棗樹生長(zhǎng)和環(huán)境條件都會(huì)對(duì)抗病性鑒定的準(zhǔn)確性和客觀性產(chǎn)生影響，在抗病資源評(píng)價(jià)和開發(fā)利用時(shí)應(yīng)統(tǒng)籌考慮。從北京古棗樹篩選的50號(hào)品系為普通抗性類型，在強(qiáng)致病菌株存在或自身生長(zhǎng)勢(shì)較弱的情況下可能抗性表現(xiàn)較弱或喪失抗性；雖然已發(fā)現(xiàn)昌平菌株與玉泉山菌株的明顯的分子差異，但是否昌平菌株致病性低于玉泉山菌株、且與所揭示的分子變異有關(guān)系尚待進(jìn)一步研究證實(shí)(王合等，2018)。

高抗品種T27和中抗品種T30接穗在玉泉山棗園一處林蔭位置表現(xiàn)癥狀為V級(jí)小葉叢枝癥狀，推測(cè)是林蔭位置光照、濕度和通風(fēng)條件較差，影響棗樹有機(jī)物和抗性物質(zhì)積累，從而發(fā)病嚴(yán)重。棗樹是喜光樹種，遮蔭會(huì)嚴(yán)重影響接穗的光合作用、抑制抗病基因的表達(dá)和抗病物質(zhì)的合成(田國(guó)忠等，2013)。Liu等(2016)比較了植原體感染對(duì)高抗品種“星光”和感病婆棗光合色素和活性的變化，認(rèn)為抗性品種的光合響應(yīng)模式有助于其產(chǎn)生對(duì)植原體感染的更強(qiáng)免疫力。而對(duì)同一抗性品種接穗在不同光照條件的反應(yīng)，本研究也做了初步探討。因此，采用適當(dāng)?shù)脑耘喙芾矸绞健⒑侠砻苤?、適時(shí)修剪等可能會(huì)減輕棗瘋病害發(fā)生和流行。

4 結(jié)論

本研究對(duì)嫁接傳毒試驗(yàn)后3個(gè)棗園不同棗樹材料進(jìn)行癥狀觀察、分子檢測(cè)和分子變異分析，首次測(cè)定山西園藝所供試的駿優(yōu)2號(hào)(Z18)為高抗品系；發(fā)現(xiàn)棗瘋植原體株系差異與地域有關(guān)，而與棗樹品種抗性強(qiáng)弱無(wú)關(guān)；初步排除了玉泉山棗園病原來(lái)源于江蘇的泗洪大棗移栽傳病。