繡球染色體制片技術(shù)優(yōu)化及rDNA物理定位*

郭瑞紅 邱 帥 劉光欣 高 凱 魏建芬 席夢利

(1.南京林業(yè)大學(xué) 林木遺傳與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南京 210037； 2.杭州市園林綠化股份有限公司 杭州 310020)

繡球(Hydrangeamacrophylla)隸屬于虎耳草科(Saxifragaceae)繡球?qū)?Hydrangea)。繡球?qū)僦参镌a(chǎn)于日本和我國長江流域，共約73種，我國是世界繡球?qū)僦参锏姆植贾行模瑩碛?7個種和11個變種(海風(fēng)等，2014；喬謙等，2020)。該屬植物具有碩大飽滿的聚傘花序、豐富多變的花色、適應(yīng)性強(qiáng)、易扦插繁殖等特征，現(xiàn)已廣泛用于鮮切花生產(chǎn)、園林造景和盆花栽培(吳可鵬等，2019)。目前，國內(nèi)市場的主導(dǎo)商品栽培種多引自歐洲、美國及日本等國，我國雖然有豐富的繡球?qū)俜N質(zhì)資源，但這些資源尚未被充分開發(fā)利用，市場上仍缺乏具有自主產(chǎn)權(quán)的優(yōu)良品種(喬謙等，2020)。繡球?qū)傩缕贩N選育的主要方法仍然是傳統(tǒng)的雜交育種，但其雜交技術(shù)復(fù)雜，種子微小，種子的收獲及播種比較困難(曾奕等，2018)，加之對繡球?qū)僦参锏姆诸?、系統(tǒng)進(jìn)化和遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)等基礎(chǔ)研究工作開展較少，現(xiàn)有成果難以對育種實(shí)踐起到輔助作用，導(dǎo)致我國的繡球?qū)儆N嚴(yán)重落后于歐美等發(fā)達(dá)國家。繡球?qū)僦参锓肿蛹?xì)胞遺傳學(xué)研究可以揭示其染色體組成及特征，探究其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，為繡球?qū)匐s交育種的親本選配提供依據(jù)，從而指導(dǎo)繡球?qū)僦参锏碾s交育種。

熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一項(xiàng)分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，該技術(shù)利用特異的DNA序列為探針，通過原位雜交方式將其雜交到特定染色體上，從而達(dá)到標(biāo)定并識別不同染色體的目的。染色體特異序列探針FISH技術(shù)為染色體圖譜的構(gòu)建提供了高效方法(辛昊陽等，2016；Xinetal.，2020)，已廣泛應(yīng)用于多種植物的分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究(Jiangetal.,2006；Lanetal.,2018)，但繡球?qū)傥锓N的細(xì)胞學(xué)研究報道較少。已有研究結(jié)果顯示，繡球?qū)傥锓N染色體較小，中期染色體平均長度1～2 μm，基因組2C值1.95～5.00 pg(Cerbahetal.,2001)，部分物種中存在B染色體(Mortreauetal.,2010)，二倍體及多倍體均有報道(Laereetal.,2010；Mortreauetal.,2010)。而基于FISH技術(shù)的研究僅查閱到1篇以45S rDNA為探針及1篇以45S rDNA和5S rDNA為探針的報道，上述研究揭示了繡球?qū)傥锓N間45S rDNA和5S rDNA在染色體上的分布具有多態(tài)性(Laereetal.,2010；Mortreauetal.,2010)。本研究以繡球水培根尖為材料，探討不同預(yù)處理試劑、預(yù)處理時間和酶解時間對染色體形態(tài)及制片效果的影響，比較用45S rDNA和5S rDNA質(zhì)粒間接標(biāo)記的長探針與直接合成的45S rDNA和5S rDNA短探針FISH的信號差異，以期為繡球?qū)僦参锓肿蛹?xì)胞遺傳學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

植物材料來源于南京林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)種植的繡球‘無盡夏’(Hydrangeamacrophylla‘Endless Summer’)，2020年9—10月間，選取當(dāng)年生半木質(zhì)化枝條，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)水培，培養(yǎng)條件為每天光照10 h、黑暗14 h，溫度26 ℃，每天換水1次。

1.2 根尖取材及預(yù)處理

選擇晴天上午9:00—10:00，收集水培繡球枝條上長0.5～1 cm的根尖。將根尖分別采用以下3種方法進(jìn)行不同時間梯度預(yù)處理：1)根尖用1 MPa一氧化二氮(N2O)室溫處理0.5、1、2 h；2)根尖置于0.7 mmol·L-1環(huán)己酰胺水溶液中室溫處理1、3、5 h；3)根尖置于2 mmol·L-18-羥基喹啉水溶液中避光室溫處理2、4、6 h。根尖經(jīng)過預(yù)處理后，立刻用去離子水洗凈，然后轉(zhuǎn)入新鮮配制的卡諾固定液中(V無水乙醇︰V冰乙酸=3∶1)保存，次日重新?lián)Q1次卡諾固定液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 染色體制片及熒光原位雜交

1.3.1 染色體制片 染色體制片參照蘭月(2018)的方法，并進(jìn)行部分調(diào)整。根尖從固定液中取出后放入去離子水中，洗去卡諾固定液。切取根尖分生區(qū)組織，置于4%纖維素酶和2%果膠酶混合酶液中，在37 ℃恒溫箱內(nèi)分別酶解0.5、1、2 h。酶解后的分生組織用移液槍轉(zhuǎn)移到水中終止酶解，再從水中轉(zhuǎn)移至載玻片上。用鑷子輕輕擠壓出分生組織細(xì)胞，除去多余雜質(zhì)，滴加20 μL 60%的乙酸，用解剖針混合攪勻組織。將載玻片置于溫度為55 ℃的烘片機(jī)(Leica HI 1220)上，用解剖針涂抹細(xì)胞懸液，制片干燥前用新鮮配制的卡諾固定液沖洗后氣干。相差顯微鏡下初步檢片，選擇染色體形態(tài)較好且分散的制片，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 染色體制片固定 為了改善DAPI染色效果，制片用4%多聚甲醛固定10 min，然后用2×SSC室溫洗3次，每次5 min，再用70%、90%、100%乙醇進(jìn)行逐級脫水各5 min。

1.3.3 探針制備 本研究用rDNA探針分為2類：一類為美國密西根州立大學(xué)蔣繼明教授實(shí)驗(yàn)室惠贈的水稻(Oryzasativa)5S rDNA質(zhì)粒和45S rDNA質(zhì)粒，采用缺刻平移法分別用地高辛和生物素對其進(jìn)行標(biāo)記，為了描述方便，這類探針本文稱為長探針；另一類為本團(tuán)隊(duì)依據(jù)擬南芥(Arabidopsisthaliana)5S rDNA和45S rDNA編碼區(qū)序列合成的寡核苷酸(Oligo)探針，5S rDNA用FAM(6-carboxyfluorescein)修飾，45S rDNA用TAMRA(rhodamine)修飾，這類探針本文稱為短探針(席夢利等，2018；Lanetal.,2018)。

1.3.4 雜交液制備及變性 每張染色體制片配制20 μL雜交液，雜交液成分包括約40 ng的探針DNA、50%去離子甲酰胺、2×SSC和10%硫酸葡聚糖。包含長探針的雜交液于98 ℃變性10 min后立即放入冰中冷卻5 min以上；短探針是合成的單鏈DNA，故包含短探針的雜交液不需要變性。

1.3.5 染色體制片變性與雜交 染色體制片在85 ℃、70%去離子甲酰胺中變性2 min后，立即轉(zhuǎn)移到70%、90%、100%冰乙醇中進(jìn)行逐級脫水各5 min，制片氣干。每張染色體制片滴加20 μL雜交液，用Rubber Cement封片。制片放置于濕盒中，37 ℃恒溫箱內(nèi)雜交過夜。

1.3.6 制片漂洗及抗體檢測 長探針制片從濕盒中取出后，揭掉Rubber Cement，2×SSC室溫洗5 min，42 ℃熱洗20 min，1×TNT洗5 min。地高辛和生物素標(biāo)記的探針分別用anti-digoxigenin rhodamine (Anti-Digoxigenin-Rhodamine Fab fragments,Roche,11207750910)和anti-biotin FITC(Fluorescein Anti-Biotin,Vector Laboratories,SP-3040)進(jìn)行抗體檢測。每張制片加約100 μL抗體孵育液(取anti-digoxigenin rhodamine和anti-biotin FITC各1 μL加入到100 μL的1×TNT中混勻)，37 ℃恒溫箱內(nèi)孵育1 h。然后進(jìn)行第2次洗脫，1×TNT洗3次，每次5 min，1×PBS洗5 min，晾干制片。每張制片用20 μL含有DAPI的封片膠(Vector Laboratories,H-1200)封片。制片在Olympus BX51型熒光顯微鏡下觀察拍照，所有拍攝圖片用Photoshop CS6與Image J軟件進(jìn)行后期處理與圖片合成。

短探針帶有熒光基團(tuán)，雜交完成后可直接在熒光顯微鏡下檢測拍照。短探針雜交完成后，揭掉Rubber Cement，用2×SSC室溫洗5 min，洗掉蓋玻片，然后用1×TNT漂洗3次，每次5 min，用1×PBS洗5 min，晾干制片。每張制片用20 μL含有DAPI的封片膠封片。制片在Olympus BX51型熒光顯微鏡下觀察拍照，所有拍攝圖片用Photoshop CS6與Image J軟件進(jìn)行后期處理與圖片合成。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

在研究不同預(yù)處理對染色體形態(tài)的影響時，為了避免根尖生理狀態(tài)對試驗(yàn)的影響，每種處理制備10張染色體制片，每張制片用2個根尖，選擇其中3張分裂相較多的制片進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，不同處理統(tǒng)計(jì)的分裂相數(shù)有30～64個。為了減少誤差，每張染色體制片在顯微鏡下進(jìn)行3次重復(fù)觀察，分別統(tǒng)計(jì)出分裂相總數(shù)和染色體形態(tài)良好的分裂相數(shù)，采用Excel軟件進(jìn)行計(jì)算分析，得出平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。形態(tài)良好的中期分裂相占比(%)=形態(tài)良好的中期分裂相數(shù)/總分裂相數(shù)×100%，形態(tài)良好的中期分裂相是染色體數(shù)目足夠且染色體濃縮適當(dāng)?shù)姆至严?。平均值±?biāo)準(zhǔn)偏差(%)是3張染色體制片中形態(tài)良好的中期分裂相占比的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同預(yù)處理對染色體形態(tài)的影響

采用1 MPa N2O、0.7 mmol·L-1環(huán)己酰胺和2 mmol·L-18-羥基喹啉3種方法對繡球根尖進(jìn)行不同時間梯度預(yù)處理，觀察統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)：1 MPa N2O預(yù)處理0.5 h，大部分中期分裂相染色體較長，濃縮不充分(圖1A)，形態(tài)良好的中期分裂相比例為46.67%(表1)；預(yù)處理1 h，染色體濃縮適當(dāng)，大部分染色體的著絲粒位置可辨(圖1B)，形態(tài)良好的中期分裂相比例達(dá)58.8%(表1)；預(yù)處理2 h，染色體濃縮過度，呈點(diǎn)狀(圖1C)，形態(tài)良好的中期分裂相比例為50%(表1)。0.7 mmol·L-1環(huán)己酰胺預(yù)處理1 h和3 h，大部分中期分裂相染色體較長，濃縮不充分(圖1 D、E)，形態(tài)良好的中期分裂相比例分別為31.25%和52.39%(表1)；預(yù)處理5 h，染色體濃縮適當(dāng)，但大部分染色體的著絲粒位置不可辨(圖1F)，形態(tài)良好的中期分裂相比例為26.37%(表1)。2 mmol·L-18-羥基喹啉預(yù)處理2、4、6 h，形態(tài)良好的中期分裂相比例分別為32.5%、45.24%和34.92%，3個預(yù)處理時間染色體濃縮適當(dāng)，但大部分染色體的著絲粒位置不可辨(圖1G、H、I)，處理2 h的染色體可以觀察到異染色質(zhì)(圖1G)。綜合考慮染色體長度、著絲粒位置及形態(tài)良好的中期分裂相比例，認(rèn)為1 MPa N2O處理1 h是繡球根尖預(yù)處理的最適條件。

圖1 不同預(yù)處理對染色體形態(tài)的影響Fig.1 Effect of different pretreatment methods on chromosome morphology標(biāo)尺 Scale bars:10 μm.A-C:N2O分別預(yù)處理0.5、1、2 h；D-F:環(huán)己酰胺分別預(yù)處理1、3、5 h；G-I:8-羥基喹啉分別預(yù)處理2、4、6 h。A-C:N2O pretreated for 0.5,1 and 2 h,respectively;D-F:Cycloheximide pretreated for 1,3 and 5 h,respectively;G-I:8-hydroxyquinoline pretreated for 2,4 and 6 h,respectively.

表1 預(yù)處理對根尖細(xì)胞染色體制片效果的影響Tab.1 Effect of pretreatment on chromosome preparation of root tip cells

2.2 不同酶解時間對染色體制片的影響

選用1 MPa N2O預(yù)處理1 h的根尖，將根尖分生組織用4%纖維素酶和2%果膠酶混合酶液于37 ℃分別酶解0.5、1、2 h后涂片，制片用卡寶品紅染色后，在Olympus BX41顯微鏡下觀察拍照。觀察發(fā)現(xiàn)：酶解0.5 h獲得的制片，中期分裂相和細(xì)胞核周圍都可觀察到明顯的細(xì)胞質(zhì)(圖2A、B)，這些細(xì)胞質(zhì)的存在使染色體不能充分外露，在后續(xù)的FISH試驗(yàn)中容易產(chǎn)生背景信號，從而影響FISH信號的捕獲；酶解1 h獲得的制片，中期分裂相背景干凈、染色體分散程度好(圖2C)；酶解2 h獲得的制片，染色體容易丟失，觀察到很多不完整分裂相(圖2D)。對比后發(fā)現(xiàn)，酶解1 h所獲得的染色體制片質(zhì)量明顯高于酶解0.5 h和2 h，因此，繡球根尖分生組織在4%纖維素酶和2%果膠酶混合酶液中37 ℃酶解1 h比較合適。

圖2 不同酶解時間對染色體制備效果的影響Fig.2 Effect of different enzymatic hydrolysis time on chromosome preparation標(biāo)尺 Scale bars:10 μm.箭頭所指代表細(xì)胞質(zhì)。The arrow points to the cytoplasm.A&B:0.5 h;C:1 h;D:2 h.

2.3 長探針和短探針rDNA對FISH結(jié)果的影響

選用1 MPa N2O處理1 h的根尖，酶解1 h后用涂片法制備的高質(zhì)量中期染色體制片進(jìn)行FISH對比試驗(yàn)。觀察30個中期分裂相后發(fā)現(xiàn)：繡球染色體數(shù)目為36，染色體基數(shù)為18，是二倍體(2n=2x=36)。45S rDNA的長探針和短探針均可產(chǎn)生良好的雜交信號，2種探針產(chǎn)生的雜交信號強(qiáng)度差異不明顯，幾乎每個分裂相都可檢測到2個很強(qiáng)的雜交信號。這說明45S rDNA的長探針和短探針均可用于繡球45S rDNA在染色體上的物理定位研究。多個分裂相對比確定，45S rDNA位于1對近端著絲粒染色體的短臂末端(圖3)。5S rDNA的長探針和短探針產(chǎn)生的雜交信號均很弱，長探針在50%的中期分裂相上可以檢測到2個清晰的信號，而短探針僅在37%的中期分裂相上可以檢測到2個稍弱的信號，且多數(shù)分裂相上都呈現(xiàn)明顯的背景信號。多個分裂相對比確定，5S rDNA位于1對端著絲粒染色體的長臂末端(圖4)。

圖3 長探針FISH結(jié)果Fig.3 The FISH results of long probes標(biāo)尺 Scale bars:10 μm.A:中期染色體灰度圖像；B:5S rDNA信號；C:45S rDNA信號；D:染色體與rDNA信號合成圖。A:Grayscale image of metaphase chromosomes;B:Signals of 5S rDNA;C:Signals of 45S rDNA;D:Merged picture from A,B and C.

圖4 短探針FISH結(jié)果Fig.4 The FISH results of short probes標(biāo)尺 Scale bars:10 μm.A:中期染色體灰度圖像；B:5S rDNA信號；C:45S rDNA信號；D:染色體與rDNA信號合成圖。A:Grayscale image of metaphase chromosomes;B:Signals of 5S rDNA;C:Signals of 45S rDNA;D:Merged picture from A,B and C.

3 討論

獲得高質(zhì)量染色體制片是開展分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究的基礎(chǔ)，高質(zhì)量染色體制片不僅要求染色體濃縮適當(dāng)、形態(tài)良好、著絲粒位置易辨，而且要求分裂相沒有細(xì)胞質(zhì)背景，染色體分散性好，以便進(jìn)行后續(xù)的測量分析或FISH試驗(yàn)。植物材料的預(yù)處理及制片方法對染色體制片質(zhì)量影響顯著，在開展細(xì)胞學(xué)研究時需要針對不同的植物材料，探索預(yù)處理及制片方法對染色體制片質(zhì)量的影響。根尖分生組織比其他分生組織細(xì)胞分裂更活躍、材料獲取更容易，因此，根尖是細(xì)胞學(xué)研究的常用材料(林秀琴等，2011；楊亞飛等，2020)，加之繡球扦插易生根，故本研究選用根尖作為試驗(yàn)材料，探索不同預(yù)處理方式、預(yù)處理時間及酶解時間對染色體形態(tài)及制片效果的影響。細(xì)胞學(xué)研究中富集中期染色體的常用預(yù)處理有物理方法和化學(xué)方法。N2O預(yù)處理屬于物理方法，主要通過高壓使染色體凝縮，該處理方法已在馬鈴薯(Solanumtuberosum)、玉米(Zeamays)、小麥(Triticumaestivum)、柑橘(Citrus)等植物中成功獲得了形態(tài)良好的中期染色體(Brazetal.,2018；Martinsetal.,2019；Songetal.,2020；Heetal.,2020)。本研究采用1 MPa N2O預(yù)處理繡球根尖1 h，也獲得了形態(tài)良好的中期分裂相占比高、著絲粒位置可辨的染色體制片。環(huán)己酰胺和8-羥基喹啉預(yù)處理屬于化學(xué)方法，通過抑制或破壞紡錘絲的形成，使染色體處于中期。本文研究團(tuán)隊(duì)采用環(huán)己酰胺預(yù)處理曾在百合(Lilium)、郁金香(Tulipa)、楊樹(Populus)等植物中取得了很好的效果(Liuetal.,2017；Lanetal.,2018；Xinetal.,2020)，但預(yù)處理繡球根尖后，制片中大部分染色體的著絲粒位置不可辨。盡管已有報道認(rèn)為8-羥基喹啉可使染色體的縊痕和次縊痕清晰可見(劉丹等，2015；官錦燕等，2020；葉天文等，2020)，但8-羥基喹啉預(yù)處理繡球根尖后，其大部分中期染色體的縊痕不可辨，這可能是由于不同植物根尖對不同預(yù)處理方式的敏感程度不同所致。比較分析發(fā)現(xiàn)：1 MPa N2O預(yù)處理1 h的繡球根尖，用4%纖維素酶和2%果膠酶混合酶液于37 ℃酶解1 h后涂片，是獲得高質(zhì)量繡球根尖染色體制片的最佳試驗(yàn)流程。

rDNA(45S rDNA和5S rDNA)為探針的FISH技術(shù)，是進(jìn)行植物染色體識別、植物分類及植物系統(tǒng)進(jìn)化等領(lǐng)域研究的強(qiáng)有力工具。傳統(tǒng)的rDNA-FISH技術(shù)，多將模式植物擬南芥、水稻或小麥的45S rDNA和5S rDNA分別構(gòu)建在質(zhì)粒載體中，通過大腸桿菌(Escherichiacoli)繁殖克隆質(zhì)粒DNA、質(zhì)粒DNA提取、缺刻平移法標(biāo)記探針等步驟獲得可用于FISH的rDNA探針。該方法獲得的rDNA探針為長度100～300 bp的雙鏈DNA(即長探針)。近年來，隨著DNA合成技術(shù)的迅猛發(fā)展，依據(jù)rDNA的序列特征，開發(fā)出了長度20～59 bp的rDNA單鏈寡核苷酸(Oligo)探針(即短探針)，與傳統(tǒng)的長探針構(gòu)建過程相比，短探針具有純度高、合成成本低、探針長度一致、使用簡便、雜交效率高等特點(diǎn)(Tangetal.,2014)。為了對2種探針的雜交效果進(jìn)行比較，本研究采用長、短探針分別在繡球根尖中期染色體上進(jìn)行原位雜交試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)45S rDNA長、短探針的雜交效果相似，5S rDNA長探針的檢出率高于短探針，但短探針也可以達(dá)到試驗(yàn)?zāi)康摹ｈb于短探針具有試驗(yàn)便捷、成本低廉的特點(diǎn)，因此，推薦選用短探針進(jìn)行繡球rDNA在染色體上的物理定位研究。

繡球?qū)僦参锏娜旧w基數(shù)、倍性及rDNA雜交信號在染色體上的分布變化較大。多數(shù)繡球?qū)僦参锶旧w基數(shù)為18，二倍體36條染色體(2n=2x=36)，栽培品種存在大量的三倍體(2n=3x=54)和四倍體(2n=4x=72)，但長葉繡球(Hydrangeainvolucrata)染色體基數(shù)為15(2n=2x=30)，馬桑繡球(H.aspera)染色體基數(shù)為17(2n=2x=34)(Mortreauetal.,2010)。45S rDNA在繡球?qū)僦参锞挥谌旧w的短臂末端，圓錐繡球‘Unique ’(H.paniculata‘Unique’)分布在2對染色體上，櫟葉繡球‘Sikes Dwarf’(H.quercifolia‘Sikes Dwarf’)和馬桑繡球分布在2對染色體上，而繡球‘Fasan’(H.macrophylla‘Fasan’)、長葉繡球及本研究的繡球‘無盡夏’均位于1對染色體上(Laereetal.,2010；Mortreauetal.,2010)。5S rDNA在繡球?qū)僦参锞植荚?對染色體上，長葉繡球和粗枝繡球(H.robusta)位于近著絲粒的位置，紫彩繡球(H.sargentiana)及本研究的繡球‘無盡夏’位于長臂末端(Laereetal.,2010；Mortreauetal.,2010)。這就意味著rDNA在繡球?qū)僦参镏械姆植季哂袕V泛的多態(tài)性，可以對繡球?qū)僦参锏姆诸愄峁﹨⒖肌?/p>

國內(nèi)外學(xué)者在繡球?qū)僦参锏南到y(tǒng)發(fā)育方面已開展了一些研究工作，但繡球?qū)僦参锓N類繁多、形態(tài)變異復(fù)雜，基于形態(tài)學(xué)和不同分子標(biāo)記揭示的種間親緣關(guān)系仍有不少分歧(張梅等，2021)。rDNA在染色體上的分布特征是揭示物種間親緣關(guān)系的有效手段，其在染色體上分布的位點(diǎn)數(shù)量及分布位置越相似，說明其親緣關(guān)系越近(翁天均，2011)。因此，未來應(yīng)在多種繡球?qū)僦参镏虚_展rDNA物理定位研究，通過比較分析rDNA在染色體上的分布特點(diǎn)、染色體基數(shù)及倍性，揭示繡球?qū)傥锓N間的親緣關(guān)系，以輔助繡球?qū)僦参锏碾s交育種實(shí)踐。

4 結(jié)論

繡球根尖用1 MPa N2O預(yù)處理1 h，根尖分生組織置于4%纖維素酶和2%果膠酶混合酶液中在37 ℃酶解1 h后用涂片法制片，獲得的中期分裂相染色體濃縮適當(dāng)，背景干凈，染色體分散程度好，大部分染色體的著絲粒位置可辨，該方法可以獲得高質(zhì)量染色體制片。45S rDNA長、短探針的FISH效果相似，5S rDNA長探針的檢出率高于短探針。但由于短探針具有試驗(yàn)便捷、成本低廉的特點(diǎn)，因此，推薦選用短探針進(jìn)行繡球rDNA在染色體上的物理定位研究。本研究建立的繡球根尖高質(zhì)量中期染色體制備及rDNA物理定位技術(shù)體系可高效分析鑒定繡球?qū)僦参锏娜旧w數(shù)目及rDNA的分布，為繡球?qū)匐s交育種的親本選配提供依據(jù)，從而指導(dǎo)繡球?qū)僦参锏碾s交育種工作。