污泥糞大腸菌群酶底物法替代多管發(fā)酵法的可行性研究

包亮亮

(甘肅省地質(zhì)礦產(chǎn)勘查開發(fā)局第三地質(zhì)礦產(chǎn)勘查院，甘肅 蘭州 730050)

污泥是污水處理構(gòu)筑物的沉淀物，含有大量的微生物，其中的糞大腸菌群數(shù)的高低表明了底泥的污染程度，也反映了對人體健康危害性的大小?！冻擎?zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB18918-2002)明確規(guī)定了污泥中糞大腸菌群的排放標(biāo)準(zhǔn)、檢測方法，以及控制標(biāo)準(zhǔn)[1]；《城市污水處理廠污泥檢驗方法》(CJ/T221-2005)為檢測城鎮(zhèn)污水處理廠污泥中糞大腸菌群提供了檢測技術(shù)規(guī)范[2]。測定污泥中的糞大腸菌群至今仍采用多管發(fā)酵法和濾膜法，標(biāo)準(zhǔn)方法至今沒有改進。我國雖然在2006年《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法》[3]中采用酶底物方法，但其推廣速度慢，一直沒有得到發(fā)展。直到2018年生態(tài)環(huán)境部發(fā)布HJ1001-2018《水質(zhì)總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定酶底物法》后[4]，水質(zhì)檢測糞大腸菌群的酶底物法才得到推廣和應(yīng)用，但污泥中的糞大腸菌群檢測工作還停留在多管發(fā)酵法、濾膜法階段。目前，酶底物法已經(jīng)在50多個發(fā)達國家得到廣泛應(yīng)用，美國90%以上的實驗室使用酶底物法，因此對污泥糞大腸菌群酶底物法的推廣以及可行性研究具有重要意義。

1 多管發(fā)酵法

1.1 方法原理

多管發(fā)酵法又稱多管發(fā)酵二步法[5]。(參照水質(zhì)糞大腸菌群多管發(fā)酵檢測方法[6])將污泥稀釋樣品加入到乳糖蛋白胨培養(yǎng)基試管中，經(jīng) 37 ℃ 初發(fā)酵富集培養(yǎng)，大腸菌群分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，產(chǎn)氣的酸使溴甲酚紫指示劑由紫色變?yōu)辄S色，再經(jīng) 44.5 ℃ 復(fù)發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)基中的膽鹽三號可抑制干擾菌的生長，最后產(chǎn)氣的細菌確定為糞大腸菌群。

1.2 儀器和試劑

1)儀器。高壓蒸汽滅菌器；電熱恒溫培養(yǎng)箱：37 ℃，44.5 ℃ 可調(diào)；天平；試管等。

2)試劑。乳糖蛋白胨培養(yǎng)液、EC 培養(yǎng)基、無菌水等。

1.3 樣品的預(yù)處理和制備

稱取污泥樣品 10 g 于三角瓶，加 90 mL 滅菌生理鹽水，混勻5～10 min，制成1∶10(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)均勻稀釋液。按此方法依次制成1∶100、1∶1000等不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的混勻菌液，推薦多管發(fā)酵法稀釋度范圍為質(zhì)量分?jǐn)?shù)：10-2～10-8，選擇3個連續(xù)稀釋度的混勻樣品進行檢測。

1.4 檢測流程

1)初發(fā)酵試驗。在5個裝有 5 mL 的三倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)基試管中(內(nèi)有導(dǎo)管)，加入 10 mL 混勻稀釋的污泥菌液；于各裝有 10 mL 的單倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的5個試管中加入 1 mL 混勻稀釋的污泥菌液；于剩余5個試管中加入 0.1 mL 混勻稀釋的污泥菌液。均置于(37±0.5)℃條件下，培養(yǎng) 24 h 觀察。發(fā)酵試管顏色變黃為產(chǎn)酸，玻璃倒管內(nèi)有氣泡為產(chǎn)氣。產(chǎn)酸和產(chǎn)氣的試管表明試驗呈陽性。如在倒管內(nèi)產(chǎn)氣不明顯，可輕拍試管，有小氣泡升起的也為陽性。

2)復(fù)發(fā)酵試驗。將初發(fā)酵試驗呈陽性或疑似陽性的培養(yǎng)物接種到有EC培養(yǎng)基的試管中。在(44.5±0.5)℃ 下培養(yǎng) 24 h 后觀察，產(chǎn)氣證實為糞大腸菌群陽性，即證實有糞大腸菌群存在。查閱HJ347.2-2018中的MPN表，用公式MPN值=MPN指數(shù)×(10 mL/接種量最大值)[7]，換算得出 1 g(mL)污泥中糞大腸菌群數(shù)。

2 酶底物法

2.1 方法原理

方法原理采用水質(zhì)糞大腸菌群酶底物法[4]。在(44.5 ±0.5)℃下培養(yǎng) 24 h，大腸菌群細菌能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶和大腸桿菌的β-葡糖醛酸酶分解代謝。選擇培養(yǎng)基中的色原底物鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)分解為黃色的鄰硝基苯盼(ONP)腸桿菌科細菌，培養(yǎng)基呈現(xiàn)黃色反應(yīng)。定量分析水中糞大腸菌群的最大可能數(shù)。

2.2 儀器和試劑

1)儀器。程控定量封口機，97孔定量盤，100 mL 無菌采樣瓶，恒溫培養(yǎng)箱，手提式壓力蒸汽滅菌鍋，稀釋瓶，移液管等。

2)試劑。MMO-MUG培養(yǎng)基(IDEXX科立得Colilert試劑)，無菌水。

2.3 樣品預(yù)處理

樣品的預(yù)處理同1.3。選擇合適稀釋度的樣品，對于準(zhǔn)確測定污泥中糞大腸菌群的最大可能數(shù)具有重要意義，推薦污泥樣品酶底物法稀釋度范圍為(質(zhì)量分?jǐn)?shù))：10-3～10-8。

2.4 檢測流程

量取 100 mL 稀釋混勻的樣品于無菌采樣瓶中，加入MMO-MUG 培養(yǎng)基粉末，充分混勻，使培養(yǎng)基完全溶解；全部倒入定量盤內(nèi)，釋放氣泡，用程控定量封口機封口。于(44.5±0.5)℃培養(yǎng) 24 h 后對照標(biāo)準(zhǔn)陽性板判讀結(jié)果。查閱MPN表對應(yīng)的 100 mL 水中糞大腸菌群的最可能數(shù)，換算得出 1 g(mL)污泥中糞大腸菌群的最可能數(shù)。

3 結(jié)果分析與對比

采集污水處理廠、醫(yī)療機構(gòu)、城市排水溝3大類污泥樣品共30組，分別采用多管發(fā)酵法和酶底物法檢測，并對檢測結(jié)果進行分析對比。

本文原始數(shù)據(jù)都以10為底，對數(shù)轉(zhuǎn)化后使用EXCEL和SPSS.25統(tǒng)計軟件進行計算和統(tǒng)計分析。

3.1 兩種檢測結(jié)果比較

對檢測結(jié)果進行對比分析得出(圖1)，多管發(fā)酵法個別檢測結(jié)果略大于酶底物法，這是由于樣品在初發(fā)酵試驗之后，還需復(fù)發(fā)酵試驗，在此過程中容易受到到外界因素的干擾和不確定因素的影響，以及污泥樣品的不均性，造成檢測結(jié)果出現(xiàn)較大差異的情形，而酶底物法采用先進的密封培養(yǎng)技術(shù)，沒有二次污染[8]，且由于科立得試劑獨有的抑菌功能，能抑制200萬個異養(yǎng)菌生長，從而使出現(xiàn)假陽性和假陰性的概率大大降低[9]。

圖1 30組污泥樣品檢測結(jié)果比較

3.2 試驗結(jié)果分析

對30組檢測結(jié)果的t-檢驗分析得出，相關(guān)系數(shù)(r)為：0.925。r≥0.8,說明這兩種方法之間高度相關(guān)。tStat=0.447,t0.05(30)=2.045,tStat﹤t0.05(30),P=0.658。P>0.05，即兩種分析方法檢測結(jié)果無顯著差異。結(jié)果分析見圖2。

圖2 檢測結(jié)果的線性回歸分析

3.3 兩種方法精密度試驗對比與分析

在該批樣品中選取低濃度、中濃度、高濃度污泥樣品各1份，按不同方法各進行了6次重復(fù)測定，并對精密度測試結(jié)果作分析比較。結(jié)果見表1。

從表1表明，無論是對于低濃度、中濃度，還是高濃度的樣品，酶底物法的RSD%﹥多管發(fā)酵法RSD%，酶底物法重復(fù)性r明顯小于多管發(fā)酵法，說明酶底物法檢測數(shù)據(jù)波動較小。經(jīng)F檢驗，低濃度、中濃度、高濃度F計算值分別為6.57、14.30、39.22。F計算值﹥F0.05，(5,5)=5.05，說明兩種檢測方法的精密度有顯著差異，酶底物法精密度明顯大于多管發(fā)酵法。

表1 多管發(fā)酵法與酶底物法精密度的比較

4 酶底物法替代多管發(fā)酵法的可行性探討

4.1 兩種檢測方法的優(yōu)點與缺點對比

酶底物法主要是采用先進的酶技術(shù)密封培養(yǎng)，易操作，檢測流程短，無需確認(rèn)實驗，假陽性概率較低，精密度高，但材料成本相對較高，其檢測費用比較昂貴，人工成本較低，可以彌補傳統(tǒng)多管發(fā)酵法的不足。

多管發(fā)酵法，其操作步驟繁瑣，整個操作過程容易受到外界環(huán)境的干擾，控制成本方面具有優(yōu)勢，技術(shù)操作簡單，檢測時間較長，需進行確認(rèn)試驗，準(zhǔn)確度相對酶底物法略低，人工成本較高，大批量樣品檢測難度較大。兩種方法的優(yōu)點與缺點對比見表2。

表2 多管發(fā)酵法與酶底物法優(yōu)點與缺點的對比

4.2 實驗結(jié)果比較分析

對檢測結(jié)果的t檢驗分析，兩種檢測方法無統(tǒng)計學(xué)意義上的差異，兩種分析方法之間高度相關(guān)，其檢測效果相同，兩種方法檢測結(jié)果無顯著差異。

4.3 兩種方法精密度檢驗

通過對精密度的分析，兩種檢測方法的精密度之間存在顯著性差異，酶底物法精密度高于多管發(fā)酵法，且兩種檢測方法的精密度均在受控范圍之內(nèi)。

5 結(jié)論

隨著微生物檢測技術(shù)的不斷提高，高效、準(zhǔn)確、環(huán)保、低廉的微生物檢測技術(shù)將是未來發(fā)展的主要方向。污泥糞大腸菌群采用酶底物法檢測效果顯著，與傳統(tǒng)的多管發(fā)酵法比較檢測結(jié)果基本一致，兩種方法之間高度相關(guān)，無顯著性差異，檢測結(jié)果無系統(tǒng)誤差。污泥糞大腸菌群酶底物法檢測精密度高，操作流程簡單，檢測時間短，工作效率高，其檢測效果高于多管發(fā)酵法，適用于各種固體類型的污泥、堆肥、肥料、土壤中的糞大腸菌群檢測。酶底物法是現(xiàn)階段代替?zhèn)鹘y(tǒng)多管發(fā)酵法最可行有效的替代方法之一。