覆盆子飲片標準湯劑制備及質(zhì)量評價方法研究

吳遠波 劉宇政 吳 靚 吳克勤 冷紅文 焦 濤 張 鴻*

1.江西省醫(yī)學科學院，江西 南昌 330006；2.遼寧省丹東市市場監(jiān)管事務服務中心藥檢部，遼寧 丹東 118002

中藥配方顆粒既繼承了傳統(tǒng)湯劑的優(yōu)點，又具有服用方便、易于貯藏、質(zhì)量穩(wěn)定、便于調(diào)劑等優(yōu)勢[1]，被廣泛關注，也越來越多地被醫(yī)生和患者接受。然而，中藥配方顆粒與傳統(tǒng)中藥飲片湯劑在臨床應用中是否等效備受爭議[2-3]，且尚無統(tǒng)一的制備工藝和質(zhì)量標準[4-5]，仍需進一步規(guī)范和完善。為解決中藥配方顆粒發(fā)展面臨的問題，2021年1月，國家藥品監(jiān)督管理局在征求意見稿的基礎上正式發(fā)布《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標準制定技術要求》 (以下簡稱《技術要求》)，提出標準湯劑為衡量單味中藥配方顆粒是否與其相對應的單味中藥飲片臨床湯劑基本一致的物質(zhì)基準，并提出中藥配方顆粒的所有藥學研究均須與標準湯劑進行對比[6-7]。

覆盆子為薔薇科植物華東覆盆子RubuschingiiHu的干燥果實，夏初果實由綠變綠黃時采收，為常用中藥，具有益腎固精縮尿、養(yǎng)肝明目的功效，用于遺精滑精，遺尿尿頻，陽痿早泄，目暗昏花[8]。覆盆子含有萜類、黃酮、甾體類、香豆素和酚酸等活性化合物[9-14]，具有抗腫瘤、降血糖血脂、抗氧化、抗衰老等作用[15-20]。研究選用主產(chǎn)區(qū)、且符合藥典要求的12批覆盆子飲片制備標準湯劑，以鞣花酸為指標成分，對其進行含量測定，計算出膏率和鞣花酸轉(zhuǎn)移率范圍，并對標準湯劑進行HPLC指紋圖譜研究，為覆盆子飲片標準湯劑的作為物質(zhì)基準的應用奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Thermo Scientific UltiMate 3000高效液相色譜儀(包括四元梯度泵，WPS-3000SL自動進樣器，TCC-3000RS柱溫箱，DAD-3000檢測器，ThermoFisher公司)；LGJ-10冷凍干燥機(四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展有限公司)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)； EX125ZH電子天平(奧豪斯儀器有限公司，感量0.01mg)；FR124CN電子天平(奧豪斯儀器有限公司，感量0.1mg)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；KQ-500E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DKM610C干燥箱(重慶雅馬拓科技有限公司)；DK-98-ⅡA電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 試藥 鞣花酸對照品(批號：wkq19010702，含量以99.8%計)、椴樹苷(批號：wkq18122702，含量以98.0%計)均購自四川省維克奇生物科技有限公司。山柰酚-3-O-蕓香糖苷對照品(批號：S-065-180314，含量以99.3%計)購自成都瑞芬思生物科技有限公司。乙腈、甲醇為色譜純，水為娃哈哈純凈水，甲醇、乙醇、磷酸等其他試劑均為分析純。

12批不同來源覆盆子藥材，經(jīng)丹東市市場監(jiān)管事務服務中心藥檢部焦?jié)鞴苤兴帋熻b定為薔薇科植物華東覆盆子Rubus chingii Hu的干燥果實，覆盆子信息見表1。

表1 12批覆盆子來源信息表

2 方法與結果

2.1 覆盆子飲片的檢測 取覆盆子飲片按《中國藥典》2015年版一部“覆盆子”飲片項下[21]標準進行檢測，結果符合藥典規(guī)定。

2.2 覆盆子飲片標準湯劑的制備 取覆盆子飲片，敲破，稱取100.0 g，加水煎煮二次，第一次加800 mL水，浸泡30 min，煎煮30 min，趁熱用200 目不銹鋼篩網(wǎng)濾過，濾液應迅速冷卻，第二次加600 mL水，煎煮20 min，趁熱用200 目不銹鋼篩網(wǎng)濾過，濾液迅速冷卻，合并兩次的藥液。將藥液采用減壓濃縮的方法進行低溫濃縮，控制濃縮溫度不超過50 ℃，將水煎濾液體積濃縮至約 200 mL(0.5 g生藥/mL)。將濃縮液放置到冷凍干燥機的干燥盤中，再放置到冷凍干燥機上進行冷凍干燥，得標準湯劑樣品。測定標準湯劑樣品的水分，并計算出膏率。標準湯劑的樣品信息見表2。

表2 覆盆子標準湯劑水分、出膏率的考察

2.3 覆盆子標準湯劑鞣花酸含量測定 《中國藥典》2020年版一部“覆盆子”項下將鞣花酸作為含量測定項的控制指標，規(guī)定覆盆子飲片含量不得少于0.20%[8]，本文選擇鞣花酸為覆盆子標準湯劑含量測定的指標成分。

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Capcell Pak C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.2%磷酸溶液(15∶85)；檢測波長為254 nm；柱溫為 30 ℃；流速為1.0 mL/min；進樣量為10 μL。該色譜條件下，供試品溶液鞣花酸峰分離良好。如圖1所示。

1.鞣花酸圖1 鞣花酸對照品(A)、覆盆子標準湯劑(B)HPLC圖

2.3.2 對照品溶液的制備 取鞣花酸對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并制成含鞣花酸 4.97 μg/mL 的對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取覆盆子標準湯劑凍干粉適量，置碾缽中研細，取約0.15 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，將錐形瓶密塞，稱定重量，超聲處理(功率 500 W，頻率40 KHz)30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3.4 線性關系考察 分別精密吸取鞣花酸對照品溶液(49.68 μg/mL)0.2、0.4、1、1.6、2、4 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度線，搖勻，即得系列濃度的對照品溶液。按“2.3.1”項下的色譜條件測定，分別進樣10 μL，記錄鞣花酸的峰面積。以對照品的進樣量(X，μg)為橫坐標，以峰面積(Y)為縱坐標，進行線性回歸，得線性回歸方程：Y=1.6562X+0.2975(r=0.9994)。結果表明，鞣花酸的進樣量在0.009936～0.1987 μg范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關系。

2.3.5 儀器精密度試驗 精密吸取“2.3.2”項下對照品溶液10 μL，按“2.3.1”項下的色譜條件，連續(xù)進行6 次的進樣測定，記錄鞣花酸的峰面積。按峰面積計算，鞣花酸的RSD為0.9%。結果表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復性 取同一批樣品(批號：1912004)，按“2.3.3”項下的方法制備供試品溶液6 份，按“2.3.1”項下的色譜條件進行測定，記錄鞣花酸的峰面積，計算待測目標成分的含量。結果鞣花酸的平均含量為1.12%，RSD為1.2%，表明該含量測定方法的重復性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗 取覆盆子標準湯劑同一份供試品溶液，分別在制備后0、2、4、8、12、24 h，按“2.3.1”項下的色譜條件進樣10 μL，記錄鞣花酸的峰面積，考察樣品溶液的穩(wěn)定性。計算得鞣花酸峰面積的RSD為1.0%，結果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8 加樣回收率試驗 取已知含量的樣品(批號：1912004)適量，研細，取6份，每份約0.075 g，精密稱定，根據(jù)標準湯劑中鞣花酸的含量按1∶1的比例添加鞣花酸對照品，按“2.3.3”項下的方法制備，按“2.3.1”項下的色譜條件測定，計算得鞣花酸平均回收率為97.9%，RSD為1.5%。結果表明本法具有良好的回收率。

2.3.9 樣品測定 取覆盆子標準湯劑12批樣品，置碾缽中研細，取約0.15 g，精密稱定，按“2.3.3”項下的方法制備，按“2.3.1”項下的色譜條件測定，記錄鞣花酸峰面積，計算12批覆盆子飲片標準湯劑中鞣花酸的含量，并計算含量轉(zhuǎn)移率，結果見表3。

表3 覆盆子標準湯劑鞣花酸含量及轉(zhuǎn)移率

2.4 覆盆子標準湯劑HPLC指紋圖譜測定

2.4.1 色譜條件 色譜柱為Capcell Pak C18(4.6mm×250 mm，5 μm)；流動相為乙腈(A)-0.2%磷酸(B)，梯度洗脫(0～10 min，10%A；10～25 min，10%～15%A；25～40 min，15～20% A；40～55 min，20%～45% A；55～60 min，45% A；60～61 min，45%～10% A；61～73 min，10% A)；檢測波長為340 nm；柱溫為35 ℃；流速為1.0 mL/min；進樣量為5 μL?；旌蠈φ掌放c標準湯劑色譜圖見圖2。

5.鞣花酸；6.山柰酚-3-O-蕓香糖苷；8.椴樹苷圖2 混合對照品(A)、覆盆子標準湯劑(B)HPLC圖

經(jīng)查閱文獻[8,22]，并對比對照品色譜圖，判別5、6、8號峰分別為鞣花酸、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、椴樹苷。其中鞣花酸峰含量高、穩(wěn)定性較好、分離度較好，且《中國藥典》2020年版一部“覆盆子”項下鞣花酸為其含量測定項的控制指標，故選擇鞣花酸峰為參照峰(S)[23]，計算覆盆子標準湯劑中主要共有峰的相對保留時間、相對峰面積。

2.4.2 對照品溶液的制備 取鞣花酸對照品、山柰酚-3-O-蕓香糖苷對照品、椴樹苷對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并制成含鞣花酸84.79 μg/mL、山柰酚-3-O-蕓香糖苷32.58 μg/mL、椴樹苷7.74 μg/mL的混合對照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備 取覆盆子標準湯劑凍干粉適量，置碾缽中研細，取約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇25 mL，將錐形瓶密塞，稱定重量，超聲處理(功率500 W，頻率40 KHz)30 min，放冷，再稱定重量，用50%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4.4 儀器精密度試驗 精密吸取覆盆子標準湯劑同一份供試品溶液5 μL，按“2.4.1”項下的色譜條件，連續(xù)進行6 次的進樣測定，記錄液相色譜圖，以鞣花酸峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD。結果顯示相對保留時間RSD<0.5%，相對峰面積RSD<3%，表明儀器精密度良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 取覆盆子標準湯劑同一份供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h，按“2.4.1”項下的色譜條件進樣5 μL，以鞣花酸峰為參照峰，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD。結果顯示相對保留時間RSD<0.5%，相對峰面積RSD<3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.6 重復性試驗 取同一批覆盆子標準湯劑樣品，按“2.4.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，以鞣花酸峰為參照峰，計算各共有峰相對相對保留時間和相對峰面積的RSD。結果顯示相對保留時間RSD<0.5%，相對峰面積RSD<3%，表明該方法重復性良好。

2.4.7 樣品測定與分析 取12 批覆盆子飲片標準湯劑，按“2.4.3”項下方法分別制備供試品液，按“2.4.1”項下色譜條件進行測定，記錄12批液相色譜圖，用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012.130723版)”進行分析[24]，生成對照指紋圖譜，見圖3，圖4，相似度結果見表4。覆盆子標準湯劑指紋圖譜中確定了9 個共有峰，12 批覆盆子標準湯劑與對照圖譜之間的相似度均>0.9。

圖3 12批覆盆子飲片標準湯劑( S1～S12)的HPLC指紋圖譜及對照指紋圖譜(R)

圖4 覆盆子標準湯劑對照指紋圖譜

表4 12批覆盆子標準湯劑相似度評價結果

3 討論

3.1 標準湯劑樣品制備 本實驗所采用的覆盆子飲片標準湯劑制備工藝是參照國家藥品監(jiān)督管理局公布的《技術要求》和衛(wèi)生部、國家中醫(yī)藥管理局共同下發(fā)的《醫(yī)療機構中藥煎藥室管理規(guī)范》[25]，選取合格的覆盆子飲片，以水為提取溶劑，按照臨床湯劑煎煮方法規(guī)范化煎煮[6-7]，過濾，低溫減壓濃縮，冷凍干燥，制得樣品。為抑制熱敏性成分的分解，減少成分損失，確保與飲片臨床湯劑基本一致，嚴格按《技術要求》，煎煮結束后趁熱進行過濾，濾液迅速冷卻，控制濃縮溫度不超過50 ℃，采用冷凍干燥的方法對浸膏進行干燥。冷凍干燥方法不僅可使標準湯劑有效成分的分解和損失最小，而且可以改進湯劑懸濁液狀態(tài)難以保證均勻取樣和不易貯藏的缺點。

3.2 鞣花酸含量測定方法的建立 供試品制備方法通過對提取溶劑(50%甲醇、70%甲醇、甲醇)、提取方式(超聲處理和加熱回流)和超聲處理時間(20、30和40 min)的考察，最后選擇正文的提取方法。比較了不同的色譜柱(Capcell Pak C18、Agilent ZORBAX SB C18、Thermo Scientific Syncronis C18)，結果供試品液在3種色譜柱上均能得到較好的分離。

3.3 指紋圖譜分析方法的建立 供試品制備方法通過對提取溶劑(50%甲醇、50%乙醇、70%甲醇、甲醇)，提取方式(超聲處理和加熱回流)的考察，最后選擇正文的提取方法。研究比較了甲醇和乙腈作為有機相，0.2%磷酸、0.5%醋酸作為無機相，經(jīng)過優(yōu)化流動相洗脫條件，最終選擇乙腈-0.2%磷酸的梯度洗脫系統(tǒng)，各色譜峰分離效果好，色譜峰數(shù)量多、基線較平穩(wěn)。本研究使用DAD檢測器在190～400 nm全紫外波長掃描樣品光譜圖，提取254、280、310、340 nm處的色譜圖進行比對，并參考相關文獻[22]，綜合考慮色譜峰數(shù)、色譜信號、分離情況、基線平穩(wěn)情況等方面因素，最終確定340 nm作為測定波長。同時考察 25 ℃、30 ℃、35 ℃柱溫對色譜分離的影響，結果顯示柱溫對色譜分離效果有較大影響，35 ℃時所得指紋圖譜的分離效果較好，故建議柱溫設定為35 ℃。

本研究選取合格的12 批覆盆子飲片作為研究用樣品，建立了質(zhì)量評價方法，得出鞣花酸的轉(zhuǎn)移率范圍為49.9%～82.8%，出膏率范圍13.2%～15.5%，均符合《技術要求》的范圍要求；建立了HPLC指紋圖譜，標定了9 個共有峰，指認了鞣花酸、山柰酚-3-O-蕓香糖苷和椴樹苷峰，各標準湯劑圖譜與對照指紋圖譜的相似度均大于0.9。本文研究的標準湯劑出膏率、指標成分轉(zhuǎn)移率和指紋圖譜三個參數(shù)是其作為物質(zhì)基準的重要依據(jù)。本文的研究結果可為覆盆子配方顆粒后續(xù)的工藝研究、質(zhì)量控制方法制定等提供標準參考。