不同大豆品種根瘤菌AFLP分析

姚玉波 馬春梅 龔振平 柴永山

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后科研工作站, 哈爾濱 150086；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所, 哈爾濱 150086；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院, 哈爾濱 150030；4.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 哈爾濱 150086）

大豆原產(chǎn)于中國,我國種植大豆已有4 700多年的歷史.大豆作為重要的糧食作物和油料作物,是我國重要的戰(zhàn)略物資.黑龍江省是我國最主要的春大豆產(chǎn)區(qū),是我國重要的大豆生產(chǎn)和供給基地,2019年種植面積達到6 419萬畝,占全國種植面積的45.9%,種植面積和產(chǎn)量均居我國首位.

根瘤菌(Rhizobium)是一類棲生于土壤中的革蘭氏陰性細菌,通過侵染大豆根系形成共生結(jié)構(gòu)-根瘤,進而進行生物固氮作用,把空氣中的游離氮固定轉(zhuǎn)化為含氮化合物,為大豆提供氮素營養(yǎng),起到培肥地力,提高產(chǎn)量和改善品質(zhì)的作用[1-2],是重要的農(nóng)業(yè)資源之一.我國復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境孕育了豐富的根瘤菌資源,學(xué)者從20世紀(jì)30年代開始研究大豆根瘤菌,根瘤菌除了與大豆共生發(fā)揮固氮作用,已經(jīng)有越來越多的其他重要功能被逐漸發(fā)現(xiàn)和利用[3-4],如產(chǎn)生B 族維生素[5]、降解環(huán)境中的有機污染物[6]等,根瘤菌被認(rèn)為是重要的資源微生物.

豆科植物與根瘤菌的共生固氮作用是己知固氮量最高的生物固氮體系,能夠提供生物固氮總量的一半以上[7],而且具有效率高、低能耗、綠色、無污染等優(yōu)點.生物固氮作用是僅次于光合作用的重要生物化學(xué)反應(yīng),在自然界氮素循環(huán)中具有極其重要的作用,是生物生存和繁衍不可或缺和可持續(xù)供應(yīng)的還原態(tài)氮化物的源泉[8].

利用傳統(tǒng)方法研究微生物主要是對目標(biāo)樣品進行分離培養(yǎng),獲得單菌株,但由于很多微生物是不能夠被分離和培養(yǎng)的[9-10],因此傳統(tǒng)方法分析微生物的多樣性具有一定的局限性.隨著根瘤菌屬和種數(shù)量的不斷增加,說明與大豆共生的根瘤菌也不例外.而不經(jīng)過傳統(tǒng)方法培養(yǎng),直接從樣品中提取總DNA,以此為研究對象進行目標(biāo)片段的PCR 擴增,分析和鑒定產(chǎn)物組成的多態(tài)性,可以更準(zhǔn)確地反映微生物的原始組成情況和群落特點[11].擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)在檢測DNA 多態(tài)性方面,具有可靠性和高效性的優(yōu)點,成為分類和遺傳多樣性研究中的有力工具[12-15].因此,本研究以根瘤菌總DNA 為研究對象,以4 個大豆品種為試驗材料,利用AFLP 技術(shù)探究不同生育時期與大豆共生根瘤菌的多樣性差異,為進一步開展大豆根瘤菌的研究提供參考.

1 材料與方法

1.1 供試材料

選用4個大豆品種,包括在哈爾濱生育期不同的3個品種:黑河41(HH41)、綏農(nóng)14(SN14)和黑農(nóng)40(HN40),及1個飼料大豆品種:秣食豆(MSD).

1.2 試驗設(shè)置

以適合田間生產(chǎn)為前提,土壤為黑土,采取框栽種植方式,基礎(chǔ)肥力見表1.

表1 土壤基礎(chǔ)肥力

框栽材料和規(guī)格:硬化塑料材質(zhì)的無底圓框,直徑38 cm,深30 cm,每框裝土質(zhì)量約35 kg,埋土深度27 cm,露出地表3 cm.圓框采取兩框并排排列,兩行間無間距,在兩側(cè)各設(shè)兩框做為保護行.

施肥處理:施肥量與哈爾濱地區(qū)生產(chǎn)上采用的施肥量保持一致,氮肥150 kg/hm2,磷肥150 kg/hm2,鉀肥90 kg/hm2.按每框的面積換算施肥量,以種肥的形式施入.氮肥:硫酸銨(N:21%)每框1.70 g,磷肥:重過磷酸鈣(P2O5:46%)每框1.70 g,鉀肥:硫酸鉀(K2O:50%)每框1.02 g.

播種:采用穴播方式,每穴播3粒種子,播后覆土3～4 cm,齊苗后定苗.每框保苗3株.

取樣時間:苗期(V4),盛花期(R2),鼓粒期(R6).

取樣方法:將根系盡量完整取出,用蒸餾水沖凈,摘下根瘤,并保證根瘤完整,用錫紙包裹放入液氮中冷凍,于—80℃冰箱中保存,待提取根瘤菌DNA.

1.3 試驗方法

1.3.1 根瘤菌DNA 的提取

根瘤表面滅菌,用蒸餾水沖洗干凈,放入1.5 m L的離心管中,具體方法參照陳強等方法直接從根瘤中提取根瘤菌DNA[16].

1.3.2 擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)分析

限制性酶切、連接,預(yù)擴增和選擇性擴增等過程所需的限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、接頭、引物等均來自Invitrogen 試劑盒(AFLP Analysis System for Microorganisms AFLP Microorganism Primer Kit Cat.Nos.11352-010 and 11353-018 Invitrogen).具體方法參照試劑盒說明書進行.

6%變性聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳(DYCZ-28D),電泳板厚1.0 mm.將10×TBE 緩沖液稀釋至1×,電壓200 V,預(yù)電泳20 min,上樣量20μL,電泳至2/3處.100 bp DNA Ladder Marker(TaRa Ka).電泳結(jié)束后,采用銀染方法進行染色:取完整膠,在搖床上操作,蒸餾水清洗3次,每次5 min；250 m L 固定液,輕搖15 min,再用蒸餾水清洗2次；250 m L 銀染液,輕搖15 min,再用蒸餾水清洗2次；250 m L 顯色液,直至可見清晰的條帶.染色后,利用Champ Gel 6000凝膠成像分析系統(tǒng)成像,獲得AFLP圖譜照片.

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

根據(jù)圖譜照片,針對每對引物擴增結(jié)果,有條帶的記為“1”,無條帶的記為“0”,構(gòu)建初始數(shù)據(jù)矩陣.利用軟件(NTSYSpc 2.1)計算遺傳相似系數(shù),計算公式為:Cij＝2a/(2a+b+c)(其中a是i個體和j個體所共有的位點數(shù)目,b和c分別為i個體和j個體分別具有的位點數(shù)目),平均連鎖法(UPGMA)聚類分析,獲得聚類圖譜.

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取檢測

瓊脂糖凝膠電泳檢測(0.8%)表明,提取得到的DNA 條帶清晰,沒有出現(xiàn)降解現(xiàn)象,無RNA 污染,OD260/OD280的檢測值1.8左右,可見提取的DNA純度和濃度均較高,符合AFLP 分子標(biāo)記的要求,可用于進一步的酶切和連接試驗(如圖1所示).

圖1 DNA 電泳檢測

2.2 預(yù)擴增和選擇性擴增結(jié)果

預(yù)擴增是起承上啟下作用的一個中間過程,既可檢測酶切和連接反應(yīng)結(jié)果,又會對進一步的選擇性擴增結(jié)果產(chǎn)生影響.因此,對預(yù)擴增結(jié)果的檢測是必不可少的一個步驟,其標(biāo)準(zhǔn)是擴增產(chǎn)物在凝膠中分散并比較均勻地連續(xù)一片(smear).經(jīng)檢測表明,預(yù)擴增產(chǎn)物呈彌散型分布,預(yù)擴增產(chǎn)物片段主要分布在100～2 000 bp,可見獲得的預(yù)擴增產(chǎn)物能否達到下一步試驗的要求,可作為選擇性擴增的模板(如圖2所示).

圖2 預(yù)擴增產(chǎn)物電泳圖

選擇性擴增產(chǎn)物經(jīng)檢測,呈現(xiàn)均勻的彌散型分布,不同引物組合間彌散的范圍略有不同,選擇性擴增產(chǎn)物用于進一步聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測分析(如圖3所示).

圖3 選擇性擴增電泳圖(引物組合E-A/M-C)

2.3 AFLP結(jié)果

通過預(yù)試驗對條帶清晰度和多態(tài)性進行篩選,得到5對符合要求的引物,進一步對不同大豆品種不同生育時期的12個根瘤DNA 樣品進行AFLP 擴增.結(jié)果表明,5對引物組合擴增的位點數(shù)量、多態(tài)性位點數(shù)量和多態(tài)性位點百分率存在明顯差異,分別為79(E-A/M-C)-142(E-A/M-T)個、52(E-T/M-A)-121(E-G/M-T)個和46.43%(E-T/M-A)-90.98%(E-G/M-T)(見表2).

表2 5對引物AFLP擴增結(jié)果

對選擇性擴增獲得的產(chǎn)物,利用6%聚丙烯酰胺凝膠進行檢測,銀染后結(jié)果表明,擴增得到的條帶清晰、易于分辨,表現(xiàn)出較好的多態(tài)性(圖4為引物組合E-A/M-C).

圖4 AFLP擴增圖譜(引物組合E-A/M-C)

2.4 聚類分析

基于遺傳相似系數(shù),利用NTSYSpc 2.1軟件,以平均連鎖法UPGMA 對12份材料進行聚類分析,在相似系數(shù)為0.68處,將不同大豆品種不同生育時期的根瘤菌劃分為4大類,Ia包括黑河41苗期(V4),綏農(nóng)14苗期(V4)和黑河41盛花期(R2),Ib包括黑農(nóng)40苗期(V4),秣食豆苗期(V4)和秣食豆盛花期(R2)；第二類中包含2個部分,IIa包括黑農(nóng)40盛花期(R2),IIb包括黑河41鼓粒期(R6),黑農(nóng)40鼓粒期(R6)和秣食豆鼓粒期(R6)；第三類為綏農(nóng)14盛花期(R2)；第四類為綏農(nóng)14鼓粒期(R6).

圖5 不同品種大豆根瘤菌聚類分析

3 討 論

根瘤菌侵染大豆根系形成共生結(jié)構(gòu)-根瘤,能夠把空氣中游離的氮固定轉(zhuǎn)化為含氮化合物,為大豆植株提供氮素營養(yǎng),是大豆生長發(fā)育和產(chǎn)量形成的重要氮素來源,在大豆的重要發(fā)育階段,根瘤所固定氮素的積累量占全部氮素積累量的比例可以達到60%以上[17].可見,根瘤菌通過與大豆根系的共生,利用固氮作用所產(chǎn)生的氮素在大豆生長發(fā)育和產(chǎn)量形成過程中所發(fā)揮的重要作用.從研究人員發(fā)現(xiàn)豆科植物能夠與根瘤菌共生并能夠結(jié)瘤固氮開始,已經(jīng)有一百多年的時間,在此期間眾多學(xué)者和科研工作者開展了大量與豆科植物根瘤和固氮相關(guān)的研究工作.

龔振平等研究發(fā)現(xiàn),大豆氮素營養(yǎng)的變化隨著生育進程的推進呈現(xiàn)出時期性的特點,來源于土壤氮和肥料氮所占比例逐漸降低,根瘤固氮所占比例逐漸上升,在4片復(fù)葉期(V4)至初花期(R1),是根瘤固氮快速增加的時期；營養(yǎng)生長和生殖生長并行期(R1-R5),氮素營養(yǎng)主要來自土壤氮和根瘤固氮；生殖生長階段(R5-R8),是根瘤固氮營養(yǎng)期[18].陳慧等研究表明,大豆根瘤固氮酶活性和固氮量均存在品種間的差異,生育期短的大豆品種根瘤固氮酶活性高于生育期長的大豆品種,根瘤固氮潛力則隨著大豆品種生育期的延長而增加[19].由以上研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),大豆根瘤固氮作用存在的差異因不同品種和不同生育時期而異,目前研究多是針對根瘤固氮量、根瘤固氮率和固氮酶活性方面的變化,而本研究是以與大豆共生的全部根瘤菌作為研究對象,不進行培養(yǎng),直接從根瘤樣品中提取根瘤菌總DNA,分析與大豆共生的根瘤菌差異,以期為進一步探討大豆與根瘤菌的共生關(guān)系奠定基礎(chǔ).

遺傳多樣性是物種通過長期進化的過程而產(chǎn)生的結(jié)果,是指不同種群之間、以及同一種群內(nèi)的不同個體之間的遺傳變異,反映生物個體中蘊藏的遺傳信息的總和[20],是生物生存、發(fā)展和進化的前提[21].隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷推進和發(fā)展,更加有利于生物遺傳多樣性的研究,為其檢測提供了更加直接和準(zhǔn)確的方法[22],通過分析某些特定基因或核苷酸序列,從而估計整個基因組的變異性[23].AFLP 作為一項高效、可靠的分子標(biāo)記技術(shù),是生物分類和遺傳多樣性研究中使用較多的有力工具[12],能夠準(zhǔn)確地反映物種間的遺傳變異情況及親緣關(guān)系遠近等重要信息[22].國內(nèi)外學(xué)者利用該項技術(shù)在豆類、玉米、水稻、擬南芥、花生等作物中已經(jīng)獲得了大量的研究成果[14-15,24-26].本研究利用AFLP 分析試劑盒,對提取的DNA 進行酶切、連接、預(yù)擴增和選擇性擴增(圖1～3),利用篩選獲得的5個引物組合,在4個大豆品種的3個生育時期的12個根瘤樣本的DNA 樣品獲得了清晰的AFLP指紋圖譜(圖4),共擴增出位點578個,其中多態(tài)性位點398個,平均多態(tài)性位點百分率68.86%,可見AFLP技術(shù)可以應(yīng)用到不同大豆品種不同生育時期根瘤菌差異比較方面的研究.

擴增片段長度多態(tài)性在檢測DNA 多態(tài)性方面,非生物因子和生物因子都可能對根瘤菌的多樣性、群落組成等產(chǎn)生影響[27].Wang等研究表明,環(huán)境因子(濕度、溫度、間作、土壤以及營養(yǎng))與菜豆根瘤菌的多樣性和分布密切相關(guān),此外,土壤的酸堿度、有效氮和有效磷含量也是影響菜豆根瘤菌分布的主要土壤因素[28].Yan等人研究發(fā)現(xiàn),大豆根瘤菌的分布、豐度和固氮效率主要與大豆的基因型和品種、緯度和土壤環(huán)境(如有機酸含量、p H、有效磷和其他因子)有關(guān)[2].本研究在相同的土壤條件下對12份根瘤菌材料研究發(fā)現(xiàn),在相似系數(shù)為0.68處,12份材料可劃分為4大類.其中第一類中包含6份材料,集中了4個大豆品種的苗期、黑河41盛花期和秣食豆的盛花期,由于黑河41在哈爾濱地區(qū)的生育期較短,進入花期的時間要早于中熟和晚熟品種,秣食豆作為飼料大豆,生育進程和與根瘤菌的共生關(guān)系可能與其他品種存在差異；第二類中包含4份材料,集中了黑農(nóng)40盛花期和鼓粒期,黑河41鼓粒期和秣食豆鼓粒期,可以看出,此類中以不同品種鼓粒期與大豆共生的根瘤菌為主,由于黑農(nóng)40的生育期較長,因此盛花期共生的根瘤菌也聚在這一類；第三類和第四類均各包含一份材料,分別為綏農(nóng)14盛花期和綏農(nóng)14鼓粒期,可見與綏農(nóng)14共生的根瘤菌與其他品種存在較大差異,綏農(nóng)14可以作為與根瘤固氮作用相關(guān)研究的候選材料,為后續(xù)研究提供材料基礎(chǔ).本研究結(jié)果與前人的研究結(jié)果有共同之處,即與大豆共生的根瘤菌品種間存在差異,同時發(fā)現(xiàn)根瘤菌的組成與大豆的生育時期存在一定的相關(guān)性,這可能與多種因素相關(guān),有待開展進一步的研究.

隨著測序技術(shù)和基因組學(xué)研究的快速發(fā)展,許多新的分子標(biāo)記技術(shù)用于細菌分類和鑒定,16S r RNA基因序列分析、多位點序列分型(MLSA)等應(yīng)用,結(jié)合根瘤菌類系統(tǒng)的不斷補充和完善,取得的一系列研究結(jié)果有力地推動了根瘤菌基因組學(xué)的發(fā)展[29-30],為本研究結(jié)果基礎(chǔ)上開展差異根瘤菌挖掘、分類、鑒定、共生固氮機制等更深入的研究提供了有力支撐.

4 結(jié) 論

篩選出的5對引物組合從4個大豆品種3個生育時期的12份根瘤菌材料中共擴增出578個位點,每個引物組合平均擴增位點115.6 個,多態(tài)性位點398個,平均多態(tài)性位點百分率68.86%.基于遺傳相似系數(shù),對12份材料的UPGMA 聚類分析共劃分為4大類,與大豆品種類型和生育期相關(guān),第一類為黑河41苗期(V4)、綏農(nóng)14苗期(V4)、黑河41盛花期(R2)、黑農(nóng)40苗期(V4)、秣食豆苗期(V4)和秣食豆盛花期(R2)；第二類為黑農(nóng)40盛花期(R2)、黑河41鼓粒期(R6)、黑農(nóng)40 鼓粒期(R6)和秣食豆鼓粒期(R6)；第三類為綏農(nóng)14盛花期(R2)；第四類為綏農(nóng)14鼓粒期(R6).