不同水平自噬對(duì)替莫唑胺抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響

汪濱 王青霞 虞歡東 于海濤

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是原發(fā)性腦腫瘤中最為常見的惡性腫瘤，占所有原發(fā)性腦腫瘤的54%[1]。近年來雖然臨床上嘗試了不少治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的新方法，但是目前仍以手術(shù)切除為主，術(shù)后輔以放化療[2-3]。由于神經(jīng)膠質(zhì)瘤侵襲性強(qiáng)，腫瘤組織邊界模糊，手術(shù)很難完全切除[4]，因此術(shù)后放化療十分重要。替莫唑胺作為第二代口服烷化劑，可穿過血腦屏障，是目前治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的主流化療藥物[5-7]。有文獻(xiàn)報(bào)道限制替莫唑胺治療效果的主要原因在于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的敏感性會(huì)逐漸降低[8]，故提高神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的敏感性是治療成敗的關(guān)鍵。自噬是指細(xì)胞內(nèi)溶酶體降解自身細(xì)胞器及其他大分子的過程[9]，參與機(jī)體的許多生理及病理過程。研究表明，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的不同階段，自噬均發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[10]。有文獻(xiàn)報(bào)道在腫瘤臨床治療過程中可以通過調(diào)控自噬來提高腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性[11]。然而，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的敏感性與自噬的關(guān)系十分復(fù)雜。Jalota等[12]將2-脫氧葡萄糖與替莫唑胺聯(lián)合作用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制自噬可以提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的敏感性。Stojcheva等[13]研究發(fā)現(xiàn)，通過靶向敲低miR-138增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的自噬，也能提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的敏感性?？梢?，不同水平的自噬會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不同的影響。雷帕霉素（rapamycin，RAPA）是一種自噬的激動(dòng)劑，能夠促進(jìn)自噬。因此，本研究利用RAPA預(yù)處理人膠質(zhì)瘤細(xì)胞，以探討不同水平自噬對(duì)替莫唑胺抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞與試劑 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87購自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心；RPMI 1640培養(yǎng)液（批號(hào)：AD17321266）、FBS（批號(hào)：10270-106）均購自美國Gibco公司，毛地黃皂苷（批號(hào)：D806779）購自杭州諾揚(yáng)生物技術(shù)有限公司，兔抗微管相關(guān)輕鏈蛋白3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）抗體（批號(hào)：14600-1-AP）購自美國Sigma公司，山羊抗兔IgGHRP抗體（批號(hào)：BST12B08A55）購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，RAPA（批號(hào)：53123-88-9）購自上海生工生物工程有限公司，RT-PCR試劑盒（批號(hào)：AB1455A）購自大連寶生物工程有限公司，RNA提取試劑盒（批號(hào)：P4613）購自北京天根生化科技有限公司，MTT染色液（批號(hào)：M2128）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，二甲基亞砜（批號(hào)：R049169）購自杭州邦易化工有限公司。

1.2 細(xì)胞處理與檢測 使用0（對(duì)照）、10、25、50 μg/L的RAPA預(yù)處理U87細(xì)胞0.5 h；再加入200 μmol/L替莫唑胺作用24 h，收集U87細(xì)胞。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ表達(dá)量，RT-PCR法檢測自噬相關(guān)基因Beclin-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量，MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率。

1.2.1 LC3-Ⅱ表達(dá)量檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)。取U87細(xì)胞，PBS清洗2次，加入250 mg/L毛地黃皂苷處理5 min；1 000 r/min離心5 min，棄上清液；預(yù)冷PBS洗滌3次。4%多聚甲醛固定20 min；1 000 r/min離心5 min，棄上清液；預(yù)冷PBS洗滌2次。加入兔抗LC3（1:200稀釋）室溫孵育30 min；1 000 r/min離心 5 min，棄上清液；預(yù)冷PBS洗滌3次。加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記的山羊抗兔IgG-HRP抗體（1∶500稀釋）室溫孵育1 h；1 000 r/min離心5 min，棄上清液；預(yù)冷PBS洗滌3次。流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，參數(shù)設(shè)為激發(fā)波長492 nm，發(fā)射波長520 nm，記錄平均熒光強(qiáng)度，即LC3-Ⅱ表達(dá)量。

1.2.2 Beclin-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測 采用RTPCR法。取U87細(xì)胞，按照RNA提取試劑盒的說明書提取總RNA，使用DNA/RNA分光光度儀測定RNA的濃度，并根據(jù)濃度對(duì)各份標(biāo)本中提取到的總RNA進(jìn)行稀釋，以保證各份標(biāo)本擴(kuò)增前的起始RNA濃度一致。Beclin-1和內(nèi)參基因的引物序列見表1。反應(yīng)體系為2×One Step SYBR RT-PCR Buffer 12.5 μl，Prime Script One Step Enzyme Mix 1 μl，上下游引物（10 μM）各 1 μl，RNA 模板 2 μl，無酶水 7.5 μl。PCR 擴(kuò)增條件為 42 ℃逆轉(zhuǎn)錄 5 min，95 ℃預(yù)變性 10 s；95 ℃ 5 s，55 ℃ 15 s，72℃ 15 s，30個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔct法計(jì)算目的基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.2.3 細(xì)胞增殖抑制率檢測 采用MTT法。取U87細(xì)胞培養(yǎng)孔，每孔加入10 μl MTT染色液（5 g/L）繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄上清液，加入100 μl二甲基亞砜，室溫下振蕩10 min；使用酶標(biāo)儀讀取各孔波長560 nm處的光密度值。細(xì)胞增殖抑制率=1-光密度值實(shí)驗(yàn)組/光密度值空白組×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組細(xì)胞自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ表達(dá)量的比較 對(duì)照組、10 μg/L 組、25 μg/L 組和 50 μg/L 組 U87 細(xì)胞LC3-Ⅱ表達(dá)量分別為 1.53±0.16、2.46±0.21、5.42±0.29和 7.71±0.55，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；經(jīng)兩兩比較發(fā)現(xiàn)，隨著RAPA濃度的增加，LC3-Ⅱ表達(dá)量逐漸升高（均 P＜0.05），見圖1。

圖1 4 組細(xì)胞自噬標(biāo)志物微管相關(guān)輕鏈蛋白 3（LC3）-Ⅱ表達(dá)的流式細(xì)胞圖（a：對(duì)照組；b：10 μg/L 組；c：25 μg/L 組；d：50 μg/L 組）

2.2 4組細(xì)胞自噬相關(guān)基因Beclin-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 4組U87細(xì)胞Beclin-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；經(jīng)兩兩比較發(fā)現(xiàn)，隨著RAPA濃度的增加，Beclin-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量逐漸升高（均 P＜0.05），見表2。

表2 4組細(xì)胞自噬相關(guān)基因Beclin-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.3 4組細(xì)胞增殖抑制率比較 4組U87細(xì)胞增殖抑制率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；經(jīng)兩兩比較發(fā)現(xiàn)，10 μg/L組細(xì)胞增殖抑制率明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），而 25 μg/L 組、50 μg/L 組細(xì)胞增殖抑制率均明顯高于對(duì)照組（均P＜0.05），見表3。

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是發(fā)生于神經(jīng)外胚層的一組腫瘤，其惡性程度和病死率均非常高[14]。手術(shù)切除是目前治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的核心方案，雖然手術(shù)完全切除是神經(jīng)外科醫(yī)生追求的目標(biāo)，但是由于受各種客觀條件的限制，往往只能選擇腫瘤次全切除，因此術(shù)后放化療十分重要。替莫唑胺是目前臨床上膠質(zhì)瘤化療的首選一線藥物，其經(jīng)胃腸道消化吸收，易通過血腦屏障，毒副反應(yīng)較小。但是在化療過程中，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的敏感性逐漸降低甚至出現(xiàn)耐藥等情況嚴(yán)重影響了化療的效果。為了提高神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的敏感性，臨床上也進(jìn)行了積極的探索，如通過調(diào)控自噬來提高神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的敏感性等。然而，不同的研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道的研究結(jié)果不盡相同，這表明神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺敏感性與自噬的關(guān)系十分復(fù)雜，有學(xué)者推測自噬的雙重作用可能與神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的類型、活性及所處的微環(huán)境等有關(guān)[15]。

研究表明，自噬是一把“雙刃劍”，既能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，也能抑制腫瘤細(xì)胞增殖[16]。替莫唑胺是通過對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的DNA進(jìn)行甲基化修飾，進(jìn)而誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，從而起到抑瘤作用的[17]。自噬在DNA損傷修復(fù)中同樣扮演著雙重角色。適度的自噬有利于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)DNA損傷的修復(fù)。一方面，自噬可以通過調(diào)控同源重組修復(fù)通路中的多種蛋白提高同源重組修復(fù)水平，如特異性降解異染色質(zhì)蛋白1α，從而促使DNA修復(fù)酶RAD51招募到損傷位點(diǎn)[18]；另一方面，自噬降解自身細(xì)胞器及其他大分子，為DNA損傷修復(fù)提供能量和原料[19]。過度的自噬則會(huì)大量降解DNA同源共組修復(fù)啟動(dòng)的關(guān)鍵蛋白核酸內(nèi)切酶Sae2，導(dǎo)致DNA損傷修復(fù)能力顯著降低[20]。本研究利用RAPA預(yù)處理人膠質(zhì)瘤細(xì)胞，探討了不同水平自噬對(duì)替莫唑胺抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響。通過檢測自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ表達(dá)量、自噬相關(guān)基因Beclin-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量及細(xì)胞增殖抑制率發(fā)現(xiàn)，隨著自噬水平的提高，替莫唑胺對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制率先下降后逐漸升高，這可能與自噬在DNA損傷修復(fù)中的雙重作用有關(guān)，提示適度的自噬有利于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞修復(fù)替莫唑胺造成的DNA損傷，而過度的自噬會(huì)抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力，即適度的自噬可下調(diào)替莫唑胺的抑瘤作用，而高水平的自噬會(huì)增強(qiáng)替莫唑胺的抑瘤作用。因此，筆者推測不同的研究團(tuán)隊(duì)在自噬與神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺敏感性的關(guān)系研究中得到截然不同的結(jié)果，很可能與所使用的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞類型、活性及所處的微環(huán)境以及神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的基礎(chǔ)自噬水平等不同有關(guān)。

綜上所述，不同水平自噬對(duì)替莫唑胺抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖產(chǎn)生不同的影響，隨著自噬水平的提高，替莫唑胺對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制率先下降后逐漸升高。本研究結(jié)果為臨床上更好地提高神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的敏感性提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。