熱休克誘導(dǎo)哲羅鮭三倍體的初步研究

文/馬龍 時曉 鄭偉 陳春山 魏凱

為探索哲羅鮭三倍體育種技術(shù)方法，本文采用熱休克法進行了三倍體誘導(dǎo)試驗。根據(jù)誘導(dǎo)溫度、起始時間和持續(xù)時間的不同，本試驗共分12個試驗組和1個對照組。結(jié)果表明，利用熱休克誘導(dǎo)受精卵制備哲羅鮭三倍體苗種的方法是可行的。結(jié)合各組試驗情況來看，在水溫26℃，卵子受精后15min持續(xù)處理15min的綜合條件下，熱休克誘導(dǎo)哲羅鮭受精卵的發(fā)眼率、孵化率和三倍體率分別為82.27%，76.43%和77.35%，綜合誘導(dǎo)效果最佳。

哲羅鮭（Hucho taimen）又名哲羅魚，屬鮭形目，鮭科，哲羅魚屬，是一種瀕危的大型冷水性魚類，主要分布在亞洲北部地區(qū)和東歐的部分河流，在我國主要分布于黑龍江流域的黑龍江、烏蘇里江、松花江，吉林的圖們江和新疆的額爾齊斯河、喀納斯湖等水域。近年來，由于環(huán)境變化和人類活動的干擾，哲羅鮭野外種群數(shù)量逐漸枯竭，已被列為國家二級重點保護野生動物，具有很高的保護和研究價值。

目前，國內(nèi)學(xué)者對哲羅鮭的研究主要集中在保護生物學(xué)、人工繁育技術(shù)和生長特性、開口飼料的選擇、仔稚魚的營養(yǎng)需求以及不同群體的遺傳多樣性等方面。此外，還有研究者發(fā)現(xiàn)全人工繁育哲羅鮭存在性腺發(fā)育差異較大，部分魚類孵化率較低和產(chǎn)卵后出現(xiàn)親魚死亡等現(xiàn)象，因此開展了雌性親魚的選育和卵子質(zhì)量評估等研究。基于這種情況，本試驗采用在鮭科魚類中廣泛應(yīng)用的三倍體育種技術(shù)，通過培育性腺不發(fā)育的子代個體，以持續(xù)開展不同倍性哲羅鮭的生長特性和營養(yǎng)成分對比等方面的試驗。

一、材料與方法

（一）材料

哲羅鮭

哲羅鮭養(yǎng)殖池

本試驗選取6+齡哲羅鮭，均為延邊馬蘇大麻哈水產(chǎn)良種場培育的親魚，雌魚（4.15±0.21）kg，雄魚（3.47±0.15）kg。

（二）方法

人工催產(chǎn)：檢查親魚性腺發(fā)育程度，挑選發(fā)育良好、體表無傷的親魚進行催產(chǎn)。催產(chǎn)試劑為促黃體素釋放激素A2（LHRH-A2）和馬來酸地歐酮（DOM）。采用胸鰭基部2次注射法，第1次注射時間為產(chǎn)前1個月，水溫7.2℃，雌魚注射LHRH-A2，劑量1μg/kg。第2次注射，雌魚LHRH-A25μg/kg+DOM 5mg/kg，雄魚劑量減半，效應(yīng)期7d～10d。采卵時用0.03%乙二醇苯醚麻醉，減少親魚應(yīng)激反應(yīng)，干法授精獲得受精卵，具體方法可參照陳春山等進行。

熱休克誘導(dǎo)：試驗分組和參數(shù)設(shè)定情況見表1。熱休克處理過程均在不銹鋼水槽（靈敏度0.1℃）中完成，并用CEM高精度數(shù)字溫度計（型號為DT-613）對水溫進行校正。完成誘導(dǎo)后的哲羅鮭受精卵放入與受精水溫相同的容器中，靜置2h，挑出死卵后再放入孵化器中孵化。

表1 熱休克誘導(dǎo)哲羅鮭三倍體試驗參數(shù)

養(yǎng)殖管理：哲羅鮭受精卵孵化期間水溫變化范圍在7.4℃～10.8℃，積溫達到170℃·d～180℃·d開始發(fā)眼，達到258℃·d～266℃·d開始破膜。養(yǎng)殖用水和投喂方法等管理措施參考魏凱等進行。

倍性檢測：哲羅鮭受精卵在養(yǎng)殖150d后，體長平均為9.56cm，每組隨機抽樣50尾，同時取3尾二倍體魚苗作為對照，均采集尾靜脈血進行倍性檢測。具體檢測由中國科學(xué)院動物研究所完成，采用流式細(xì)胞儀（Pacfec CyFIow Cube 8型）檢測DNA相對含量。

（三）數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用平均值表示，用SPSS19.0軟件進行處理分析，P<0.05為顯著性判別標(biāo)準(zhǔn)，并按照Gervai標(biāo)準(zhǔn)計算綜合誘導(dǎo)效果。

采卵授精

受精卵熱休克處理

二、結(jié)果與分析

（一）誘導(dǎo)溫度

受精卵在3個誘導(dǎo)溫度條件下均獲得了三倍體魚，但不同的誘導(dǎo)溫度對4項指標(biāo)均有較大影響（見表2）。

2h死亡率：各試驗組2h死亡率差異較大，都高于對照組。最高的是12組（28℃）24.39%，其次是9組（28℃）21.95%，其余各組均小于20%。

哲羅鮭發(fā)眼卵

發(fā)眼率：除第1和2組發(fā)眼率與對照組（85%）接近，其它各組都不足70%，不同溫度組的平均發(fā)眼率差異明顯，分別為71.25%、55.5%和24.81%。

孵化率：試驗組孵化率最高的是1組（76%），最低的是12組（19%）。3個溫度組平均孵化率分別為66.5%、54.25%和24.45%，明顯低于對照組（82%）。

三倍體率：26℃組的平均三倍體率最高，達到67.75%。而隨著溫度的升高，三倍體率逐漸下降，27℃組和28℃組的平均三倍體率為60.25%和53.25%。

（二）起始時間和誘導(dǎo)時間

從表2可知，不同起始時間和誘導(dǎo)時間的組合都可以得到三倍體，但各個試驗參數(shù)之間存在顯著差異。例如，第1、3組與第2、4組起始時間不同，持續(xù)時間相同。結(jié)果顯示起始時間增加后死亡率顯著上升（除了第9和11組），發(fā)眼率、孵化率和三倍體率則顯著下降，其它各組呈現(xiàn)相同的規(guī)律。

表2 哲羅鮭三倍體誘導(dǎo)結(jié)果

第1、2組與第3、4組起始時間相同，持續(xù)時間不同。結(jié)果顯示持續(xù)誘導(dǎo)時間增加后死亡率顯著上升（除了第5、6組和第9、10組），發(fā)眼率（除了第9和10組）、孵化率（除了第9和10組）和三倍體率則顯著下降，其它各組呈現(xiàn)相同的規(guī)律。

（三）三倍體率

經(jīng)檢測，哲羅鮭二倍體DNA相對含量為39，三倍體DNA相對含量為59（見圖1）。各組三倍體率有一定差異，最高的是1組（26℃）77%，最低的是12組（28℃）42%。平均三倍體率：26℃組67.75%，27℃組60.25%，28℃組53.25%。

圖1 二倍體和三倍體哲羅鮭DNA相對含量

三、討論

（一）魚類的三倍體育種技術(shù)

魚類三倍體育種技術(shù)是在染色體組工程范疇下發(fā)展而來的一種遺傳育種技術(shù)。三倍體不僅具備一定的生長優(yōu)勢，還可以避免因性腺發(fā)育而導(dǎo)致的生長停滯，其不育的特性也在生態(tài)保護方面具有重要意義，目前已成為國內(nèi)外水產(chǎn)領(lǐng)域的研究熱點。在鮭科魚類中，三倍體誘導(dǎo)通常使用熱休克和靜水壓等物理方法或利用6-二甲基氨基嘌呤、細(xì)胞松弛素B、秋水仙素等化學(xué)方法進行，其目的都是為了抑制受精卵第二極體的排放，從而獲得兩套雌核染色體和一套雄核染色體成為三倍體。本文重點開展了熱休克誘導(dǎo)哲羅鮭受精卵發(fā)育的相關(guān)試驗，并對誘導(dǎo)溫度、起始時間和誘導(dǎo)時間等關(guān)鍵指標(biāo)進行了分析。

（二）各個誘導(dǎo)指標(biāo)對試驗的影響

在熱休克誘導(dǎo)魚類受精卵發(fā)育的過程中，誘導(dǎo)溫度是非常關(guān)鍵的因素。在前期開展的鮭科魚類三倍體誘導(dǎo)試驗中，本團隊發(fā)現(xiàn)細(xì)鱗鮭受精卵2h～4h死亡率在24℃和28℃時均明顯高于26℃，26℃的孵化率、發(fā)眼率和三倍體率均顯著優(yōu)于其它溫度組。而馬蘇大麻哈魚受精卵在30℃時雖然三倍體率最高，但孵化率只有1.95%～12.46%，明顯低于其它各組，說明30℃是誘導(dǎo)的極限溫度。國內(nèi)其他學(xué)者也有類似發(fā)現(xiàn)，張艷萍等采用不同溫度均誘導(dǎo)出虹鱒三倍體，結(jié)果顯示在26.5℃時誘導(dǎo)效果較好，30℃處理超過10min后則全部死亡。王炳謙等在對虹鱒進行熱休克誘導(dǎo)過程中發(fā)現(xiàn)，受精卵在26℃進行誘導(dǎo)處理的效果最好。通過對溫度參數(shù)的篩選，本試驗重點對26℃、27℃、28℃時的哲羅鮭受精卵誘導(dǎo)發(fā)育情況進行了比較。結(jié)果顯示，這三個誘導(dǎo)溫度均可獲得三倍體子代個體，但同一溫度下平均三倍體率差異顯著（26℃時最高）。結(jié)合其它幾個試驗參數(shù)進行比較，發(fā)現(xiàn)溫度對死亡率變化有顯著影響，發(fā)眼率和孵化率也呈逐步下降的趨勢。因此，誘導(dǎo)溫度是影響本試驗結(jié)果的關(guān)鍵因素。

除了誘導(dǎo)溫度，起始時間和誘導(dǎo)時間也對誘導(dǎo)效果起著重要作用。由于鮭科魚類第二極體排放時間較溫水性魚類會延遲很多，通常起始時間處于15min～35min。國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，虹鱒和美洲紅點鮭熱休克敏感期在受精開始后15min，此時受精卵第二極體的排放受到抑制，是獲得三倍體的最佳時期。本試驗在溫度和持續(xù)時間相同的條件下，起始時間越晚，發(fā)眼率等指標(biāo)越低。說明哲羅鮭受精后15min已進入減數(shù)分裂晚期，此時段是獲得三倍體的最佳時期。

本試驗中，在相同誘導(dǎo)溫度和起始時間條件下，持續(xù)時間越短，發(fā)眼率等指標(biāo)越高，這與樓允東的研究結(jié)果不同，也說明不同鮭科魚類在三倍體誘導(dǎo)持續(xù)時間上存在較大差異。根據(jù)本次試驗，我們認(rèn)為15min～20min屬于正常的刺激時間范圍，都能成功誘導(dǎo)出哲羅鮭三倍體，結(jié)合發(fā)眼率等指標(biāo)與持續(xù)時間呈負(fù)相關(guān)的結(jié)論，持續(xù)時間15min的誘導(dǎo)效果更好。下一步，我們將著重探討影響哲羅鮭受精卵存活和三倍體誘導(dǎo)效果的持續(xù)時間上限閾值。

（三）最佳誘導(dǎo)條件

本試驗按照Gervai等的評分標(biāo)準(zhǔn)，熱休克誘導(dǎo)哲羅鮭三倍體的最佳條件是水溫26℃，起始時間15min持續(xù)處理15min，評分結(jié)果為76.79%（見表3）。最佳誘導(dǎo)溫度與虹鱒、金鱒、細(xì)鱗鮭相同，與美洲紅點鮭和大西洋鮭有所差異，起始時間和處理時間則與馬蘇大麻哈魚、細(xì)鱗鮭、虹鱒等其它鮭科魚類接近。

表3 綜合評分結(jié)果