基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究八味獐牙菜丸治療膽囊炎的作用機制

馬騰飛，武慧超，陳 蔚，劉媛媛，仁青東主，張金魁，任小巧

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.青海大學(xué)，青海 西寧 810016；3.青海藏醫(yī)藥研究院，青海 西寧 810000）

膽囊炎（Cholecystitis）是臨床常見病，根據(jù)發(fā)病的緩急分為急性膽囊炎和慢性膽囊炎，近幾年發(fā)病率逐漸升高。急性膽囊炎是膽囊的急性炎癥性病變，主要由膽囊管梗阻、細(xì)菌感染、化學(xué)性刺激等引起；慢性膽囊炎可因膽囊結(jié)石、高脂飲食等引起，也可由急性膽囊炎反復(fù)發(fā)作、失治導(dǎo)致［1］。藏醫(yī)認(rèn)為膽囊炎主要是由于體內(nèi)三根與七因素之間平衡失調(diào)，熱邪上攻膽囊所引起。該病在牧區(qū)的發(fā)病率很高，常因牧民生活飲食不規(guī)律、好食辛辣刺激食物、飲酒、勞累、精神刺激、感染等因素引起。初次發(fā)病時癥狀不太明顯，長期發(fā)展則會變成慢性疾病［2］。

藏藥復(fù)方八味獐牙菜丸出自于《四部醫(yī)典》，為藏醫(yī)傳統(tǒng)方藥，藏文名“蒂達(dá)杰巴”，由獐牙菜、兔耳草、木香、榜嘎、小檗皮、波棱瓜子、角茴香、巖參等8味藏藥組成［3］，主要用于治療膽囊炎、初期黃疸型肝炎，具有清熱解毒、消炎止痛的功效［4］。臨床報道八味獐牙菜丸治療膽囊炎療效顯著［5-8］，但其作用機制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是通過構(gòu)建和分析“藥物-成分-靶點-疾病-通路”的網(wǎng)絡(luò)來預(yù)測中藥及其復(fù)方活性成分的方法，具有耗時短、成本低、效率高且有定向性等特點，已逐漸成為中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用分子機制的研究趨勢［9-11］。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)來預(yù)測治療的關(guān)鍵靶點與通路，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)“多成分-多靶點-多通路”［12］的特點，研究和分析八味獐牙菜丸治療膽囊炎潛在的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要活性化合物的獲取與篩選通過查詢CNKI、萬方、維普文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫結(jié)合TCMSP、BAT?MAN-TCM、化學(xué)專業(yè)等數(shù)據(jù)庫收集八味獐牙菜丸各藥味活性化合物，再利用PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載候選化合物的SDF格式文件，并轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)的Canonical SMILES 格式保存。由于藏藥使用和研究人群小，數(shù)據(jù)庫收錄藥味數(shù)量有限，為保障數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性，本研究主要通過查詢文獻(xiàn)獲得藥味的活性成分。將獲取的活性化合物的SDF 格式文件上傳至SwissADME（http://www.swissadme.ch/）平臺［13］進(jìn)行篩選，條件為：①腸胃吸收（gatrointestinalabsortion;GIabsortion）為“High”。此為藥物可以被胃腸吸收的條件，用于篩選具有較好口服生物利用度的活性化合物；②5種類藥性（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge）結(jié)果中有2 個以上為“Yes”的化合物，即可作為活性化合物。同時滿足上述兩項條件的活性化合物均可納入研究。

1.2 活性化合物靶點預(yù)測由于SwissTargetPridic?tion 預(yù)測的靶點直接為規(guī)范后靶點，且統(tǒng)一用一個平臺預(yù)測可保持平臺計算方式一致，減小誤差，將所有經(jīng)過SwissADME 篩選后符合條件的分子結(jié)構(gòu)式的SDF 文件，拖入SwissTargetPrediction 繪畫區(qū)域中打開可預(yù)測靶點［14］；設(shè)置屬性為“Homo sapi?ens”，最后選取所有得分＞0 的靶點，去重后整理為靶點集。

1.3 疾病靶點獲取在Genecards（https://www.gen?ecards.org）、Omim（https://omim.org）數(shù)據(jù)庫檢索關(guān)鍵詞“cholecystitis”“chronic cholecystitis”“acute chole?cystitis”以收集膽囊炎、慢性膽囊炎、急性膽囊炎相關(guān)靶點，納入所有靶點后刪去重復(fù)值建立cholecysti?tis相關(guān)靶點集。

1.4 建立藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)將八味獐牙菜丸和膽囊炎靶點取交集并作韋恩圖（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），得到八味獐牙菜丸治療膽囊炎的關(guān)鍵潛在靶點。以納入的成分、治療疾病以及作用靶點為基礎(chǔ)，構(gòu)建成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，導(dǎo)入Cytoscape3.8.0中進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)圖的繪制。

1.5 建立蛋白質(zhì)相互作用PPI 網(wǎng)絡(luò)，篩選關(guān)鍵靶點將藥物疾病共有靶點輸入String 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/cgi/input.pl），將生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”，默認(rèn)置信度蛋白質(zhì)參數(shù)＞0.4，去除散在靶點后得到蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein inter?action network，PPI）。然后將獲得的PPI 網(wǎng)絡(luò)代入Cytoscape3.8.0 中進(jìn)行可視化處理，將節(jié)點顏色和大小根據(jù)度值調(diào)整。

1.6 GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析使用R3.6.3軟件對八味獐牙菜丸治療膽囊炎的預(yù)測靶點進(jìn)行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析，獲得主要功能富集信息和信號通路，繪制柱狀圖和氣泡圖。

2 結(jié) 果

2.1 八味獐牙菜丸的有效成分和作用靶點由于未在數(shù)據(jù)庫中查詢到巖參（Piper pubicatulumC.DC.）的成分及靶點，且目前關(guān)于巖參活性成分的相關(guān)研究報道極少，故舍去。最后從八味獐牙菜丸中納入7味研究藥物：獐牙菜Swertiaracemosa（Griseb.）Wall.ex C.B.Clarke、兔耳草LagotisbrevitubaMaxim.、木香AucklandiaRadix、榜嘎Aconitumtanguticum（Maxim.）Stapf/Aconitum naviculare（Bruhl.）Stapf、小 檗 皮Ber?beriskansuensisSchneid、波棱瓜子Herpetospermumcau?digerumWall、角茴香HypecoumerectumLinn.。查詢到滿足條件的共88 個活性成分，見表1。篩選得出942 個藥物基因靶點（僅在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中查詢到方劑中木香的有效成分，其余均在文獻(xiàn)中查詢獲?。?/p>

表1 八味獐牙菜丸的有效化學(xué)成分

2.2 膽囊炎靶點在Genecards、OMIM 數(shù)據(jù)庫中檢索去重后共得到膽囊炎相關(guān)靶點854個。

2.3 八味獐牙菜丸治療膽囊炎預(yù)測靶基因的PPI網(wǎng)絡(luò)將八味獐牙菜丸靶點與膽囊炎靶點取交集，作藥物-疾病靶點韋恩圖，得交集靶點120 個，見圖1。120 個靶點基因基于String 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，將生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”，根據(jù)默認(rèn)值置信度蛋白質(zhì)參數(shù)＞0.4，去除散在靶點，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)中有120個節(jié)點，1 182條邊，平均度值為19.7，見圖2。將PPI 網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape3.8.0 進(jìn)行可視化處理，見圖3。節(jié)點顏色和大小根據(jù)度值調(diào)整，節(jié)點越大，顏色越深，度值越大；線的粗細(xì)，從粗到細(xì)表示從大到小。結(jié)果顯示，篩選出度值大于2 倍平均度值、介數(shù)中心性（betweenness centrality，BC）大于平均值的15 個蛋白靶點，分別為甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、蛋白激酶B（AKT1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、表皮生長因子受體（EGFR）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、細(xì)胞周期素D1（CCND1）、HRAS蛋白、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2）、白細(xì)胞介素2（IL-2）、酪氨酸激酶受體2（ERBB2）、TLR4 蛋白、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（MTOR），這提示以上靶點在PPI 網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮了重要的關(guān)聯(lián)作用，可能是八味獐牙菜丸治療膽囊炎的關(guān)鍵作用靶點。如表2所示。

圖1 八味獐牙菜丸與膽囊炎靶點韋恩圖

圖2 預(yù)測靶基因構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心基因

表2 關(guān)鍵靶點拓?fù)鋮?shù)

（續(xù)表1）

2.4 GO 功能富集分析基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析主要包括生物學(xué)過程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cell component，CC）和分子功能（molecular functions，MF）。利用String 數(shù)據(jù)庫，將校正P值≤0.05的項目進(jìn)行篩選，總共富集到1 998條生物過程條目，其中168 條與分子功能相關(guān)，85 條與細(xì)胞組成相關(guān)。排名前10見圖4、圖5。

圖4 GO功能富集分析柱狀圖

圖5 GO功能富集氣泡圖

八味獐牙菜丸治療膽囊炎的預(yù)測靶點基因生物學(xué)過程（BP）主要涉及肌肉細(xì)胞增殖、細(xì)胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對酒精的反應(yīng)等。細(xì)胞組分（CC）包括膜筏、膜區(qū)、質(zhì)膜筏、神經(jīng)細(xì)胞體、突觸后膜的組成和固有部分、液泡腔等，分子功能（MF）涉及到跨膜受體蛋白激酶活性、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性、生長因子結(jié)合、轉(zhuǎn)化生長因子β 激活的受體活性、絲氨酸肽酶活性、跨膜受體蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶等。

2.5 KEGG 通路富集分析京都基因和基因組百科全 書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號通路分析，將藥物疾病共有靶點進(jìn)行KEGG 通路富集分析，引用String 數(shù)據(jù)庫，將校正P值≤0.05 的項目進(jìn)行篩選，總共富集到139 條信號通路，排名前20 見圖6、圖7。主要涉及PI3K-Akt 信號通路、低氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia-induceibal factor-1，HIF-1）信號通路、FoxO 信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路等。

圖6 KEGG信號通路分析柱狀圖

圖7 KEGG信號通路分析氣泡圖

2.6 成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)為了更好地理解成分、疾病以及相應(yīng)靶點之間的復(fù)雜相互作用關(guān)系，以納入的成分、治療疾病以及作用靶點為基礎(chǔ)，構(gòu)建了成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，導(dǎo)入cytoscape 3.8.0 中進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)圖的繪制，見圖8。與GAPDH 靶向的化學(xué)成分為1-羥基-3，7，8-三甲氧基口山酮、N-methylcorydal?dine、大麥芽堿（hordenine）。

圖8 成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

3 討 論

八味獐牙菜丸是經(jīng)典的藏藥傳統(tǒng)復(fù)方，其組成的8 種藥材均味苦、性寒，藏醫(yī)臨床用于治療膽囊炎效果顯著。經(jīng)查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，八味獐牙菜丸中的多種成分具有抗菌消炎、抗病毒等藥理活性，但尚未有研究者從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度分析其作用機理，所以本文試圖通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從其藥味成分、靶點、參與生物過程、信號通路等預(yù)測其治療膽囊炎可能的作用機制。

3.1 八味獐牙菜丸主要化學(xué)成分藥理活性與膽囊炎治療的相關(guān)作用八味獐牙菜丸中主要的化合物包括苯甲酰異葉烏頭堿（6-Benzoylheteratisine）、異葉烏頭堿、阿替辛、苦木脂素（Picrasmalignan）、1-羥基-3，7，8-三甲氧基酮（1-hydroxy-3，7，8-trime?thoxyanthone）、小檗堿等。有研究表明，苯甲酰異葉烏頭堿（6-Benzoylheteratisine）、異葉烏頭堿和阿替辛屬于榜嘎中生物堿類成分［15］，對炎癥早期有一定的抑制作用，尤其是對酵母多糖A 和角叉菜膠誘導(dǎo)的炎癥抑制效果良好［16］?？嗄局兀≒icrasmalignan）屬于木脂素類，有研究表明，木脂素具有廣泛的藥理作用，包括抗病毒、抗腫瘤、抗菌等，還可以提高免疫力［17］。獐牙菜中的1-羥基-3，7，8-三甲氧基酮（1-hydroxy-3，7，8-trimethoxyanthone）為抑制膽囊炎致病菌的主要有效成分，對大腸桿菌、綠膿桿菌、糞鏈球菌、變形桿菌及鼠傷寒沙門氏菌都有一定抑菌活性［18］。小檗堿對消化系統(tǒng)疾病，如腸道感染、消化性潰瘍、慢性膽囊炎效果明顯［19］。因此，推測八味獐牙菜丸中的主要化合物具有消炎、抗菌、抗病毒、抗感染作用，與藏醫(yī)理論以清膽熱、消炎為治療膽囊炎的基本治法相符。

3.2 八味獐牙菜丸核心作用靶點與膽囊炎治療相關(guān)作用根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)理論與方法，本研究對八味獐牙菜丸治療膽囊炎作用機制進(jìn)行了預(yù)測，根據(jù)查詢文獻(xiàn)獲得有效成分90 個和對應(yīng)靶點942個。根據(jù)PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示GAPDH、AKT1、IL-6、VEGFA、EGFR 等可能為八味獐牙菜丸治療膽囊炎的關(guān)鍵作用靶點?，F(xiàn)代研究表明，這些靶點與膽囊炎的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。如白細(xì)胞介素-6（in?terleukin-6，IL-6）是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的重要成分之一，反映了機體對炎癥及感染的反應(yīng)狀態(tài)，具有參與免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)及抗腫瘤等作用［20］。而慢性炎癥導(dǎo)致細(xì)胞因子IL-6 過度表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)膽囊黏膜上皮細(xì)胞過度增殖。研究表明，細(xì)胞間黏附因子-1（ICAM-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在參與血管新生重建，調(diào)節(jié)促進(jìn)血管新生再生和維持血管內(nèi)皮完整性的功能，在膽囊炎損傷及修復(fù)愈合過程中起到重要的作用［21］。膽囊疾病患者血清及膽汁中的IL-6 水平升高反映了膽囊炎癥的反應(yīng)程度，膽汁中的IL-6 還可能作為膽囊癌的腫瘤標(biāo)記物應(yīng)用于臨床診斷參考［20］。炎癥- EGFR - 黏蛋白分泌異常間有一定關(guān)系，在MUC5CA 黏蛋白合成中，炎癥介質(zhì)EGFR 活化發(fā)揮著中心調(diào)節(jié)作用。炎癥介質(zhì)EGFR 促進(jìn)MUC5AC 表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)膽囊結(jié)石形成，EGFR 與膽囊結(jié)石形成有密切關(guān)系［22］。此外，EGFR 為Erb B 的重要家族成員，約38.55% 的膽囊癌患者出現(xiàn)過EGFR 過表達(dá)［23］。有研究表明抑制EGFR 過度表達(dá)能夠有效降低膽囊癌細(xì)胞的增殖活性，且靶向EGFR 治療與吉西他濱聯(lián)用可顯著提高化療藥物的抗腫瘤活性［24］。這與本研究預(yù)測的KEGG 結(jié)果中的諸多癌癥相關(guān)通路具有一致性。

3.3 八味獐牙菜丸治療膽囊炎作用機制的相關(guān)信號通路KEGG 信號通路的結(jié)果顯示，八味獐牙菜丸治療膽囊炎的靶點重要涉及PI3K-Akt、HIF-1、FoxO、MAPK 等信號通路，具有多成分、多靶點協(xié)同作用的特點。在《膽囊癌診斷與治療》2019 版中［25］，膽囊炎為膽囊癌發(fā)病相關(guān)危險因素中的確定因素。在PPI 分析中，篩選出最關(guān)鍵靶點為GAPDH。GAP?DH 又名甘油醛-3-磷酸脫氫酶，是糖酵解途徑中的一種關(guān)鍵酶［26］。惡性腫瘤細(xì)胞主要依賴糖酵解供能，PI3K 信號傳導(dǎo)通路參與糖酵解的核心過程。PI3K-Akt 信號通路通過抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)控細(xì)胞周期等在腫瘤形成的全程及治療中發(fā)揮重要作用［27］。HIF-1 在細(xì)胞和生物對缺氧的適應(yīng)過程中起到中樞調(diào)節(jié)作用，且在人類病原體相關(guān)的炎性癌癥中起重要作用，通過使用HIF-1 特異性抑制劑來預(yù)防病原感染是可能的［28］。因此HIF-1 與膽囊炎癥以及膽囊癌關(guān)聯(lián)密切。MAPK 信號通路在許多疾病和惡行腫瘤中起著至關(guān)重要的作用，且在膽囊癌中被過度表達(dá)和激活［29］?？傊?，在KEGG 分析的TOP20通路中，多條通路均與癌癥相關(guān)，因此預(yù)測八味獐牙菜丸具有潛在的抗癌作用，可在后續(xù)進(jìn)一步進(jìn)行實驗分析。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究藏藥復(fù)方八味獐牙菜丸治療膽囊炎的潛在分子作用機制，從而探明了作用靶點及信號通路，明確了八味獐牙菜丸通過多種活性成分對多種靶點發(fā)揮其治療膽囊炎的作用機理，為后續(xù)研究八味獐牙菜丸的應(yīng)用提供了方向與思路，但本研究預(yù)測出的靶點、通路仍需要進(jìn)一步的體內(nèi)外實驗進(jìn)行驗證。