基于AMPK/SREBP-1c信號通路探討益氣健脾湯對非酒精性脂肪性肝病小鼠糖脂代謝的影響

楊 磊,袁星星,李 瑩,王炳予,劉成祥,戰(zhàn)晶玉,郭雪瑩,劉長發(fā)

(1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150006；2. 黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院南崗分院，黑龍江 哈爾濱 150006；3. 黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院三輔分院，黑龍江 哈爾濱 150036；4. 黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥研究所，黑龍江 哈爾濱 150036)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)作為一種常見的臨床病理綜合征，以肝細(xì)胞脂肪變性、脂質(zhì)蓄積和肝小葉內(nèi)空泡形成為主要特征。根據(jù)超聲表現(xiàn)可將NAFLD分為輕、中、重度，輕度患者可無任何臨床癥狀，部分患者可感到體倦乏力、厭食油膩，中、重度患者可出現(xiàn)食欲不佳、惡心、嘔吐、右上腹隱痛等臨床癥狀[1]。NAFLD包括非酒精性肝脂肪變、非酒精性脂肪性肝炎及其在此基礎(chǔ)上進(jìn)展而成的肝纖維化、肝硬化及肝細(xì)胞癌[2]。一項(xiàng)2016年的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，NAFLD已成為全球最常見的慢性疾病之一，普通成年人的患病率為6.3%～45%[3]，有效治療NAFLD已被當(dāng)代醫(yī)學(xué)列為亟待解決的關(guān)鍵問題。益氣健脾湯是治療NAFLD的臨床經(jīng)驗(yàn)方，前期研究顯示其具有抗炎、保肝、抑制脂質(zhì)蓄積作用[4-5]，但是其改善NAFLD糖脂代謝的具體機(jī)制尚未明確。本實(shí)驗(yàn)擬通過檢測肝臟組織中腺苷單磷酸活化蛋白激酶(AMPK)/固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(SREBP-1c)的表達(dá)情況，進(jìn)一步探索益氣健脾湯對肝臟糖脂代謝的調(diào)控機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只C57BL/6J小鼠，購自黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證編號：SYXK(黑)2016-008。實(shí)驗(yàn)所有操作流程均嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(24±2)℃，相對濕度為50%～70%，光照12 h明暗交替，常規(guī)喂養(yǎng)和自由飲水。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 益氣健脾湯，組方：生黃芪15 g、丹參10 g、三七5 g、女貞子8 g、墨旱蓮8 g、西洋參10 g、澤瀉10 g、生山楂10 g、荷葉10 g、絞股藍(lán)5 g、生甘草3 g，各味藥材購自黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院南崗分院，加5倍量水浸泡，回流提取0.5 h，趁熱過濾，藥渣再加4倍水回流提取0.5 h，趁熱過濾，合并濾液，濃縮至每1 mL含生藥2.34 g的濃縮液備用。二甲雙胍，購于黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，國藥準(zhǔn)字H20023370。三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、游離脂肪酸(FFA)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FINS)、蘇木素-伊紅染液(HE)及油紅O染液試劑盒購于南京建成生物工程研究所，貨號分別為C009-2-1，C010-2-1，A112-1-1，A113-1-1，A042-1-1，A111-1-1，A110-1-1，H203，F(xiàn)006-1-1，D006-1-1，D027-1-1。AMPK抗體、p-AMPK抗體、SREBP-1c抗體、β-actin單抗和辣根酶標(biāo)記的二抗購于Abcam公司，貨號分別為ab79885，ab68206，ab28481，ab8226，ab6721。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 所有C57BL/6J小鼠在實(shí)驗(yàn)開始之前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，之后按照體重隨機(jī)分為空白組、模型組、二甲雙胍組和益氣健脾湯組，每組10只。除空白組繼續(xù)給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)外，其他組均通過高脂飲食喂養(yǎng)構(gòu)建NAFLD模型。常規(guī)飼料組成成分：玉米粉40%、豆餅29%、麩皮26%、骨粉1%、賴氨酸1%、食鹽1%、維生素等，按照100∶12的比例加入蒸餾水；高脂飲食組成成分：84%基礎(chǔ)飼料、10%豬油、5%蛋黃粉、1%膽固醇。造模周期為12周，造模期間小鼠自由飲水。從第9周開始，二甲雙胍組給予二甲雙胍100 mg/(kg·d)灌胃，益氣健脾湯組給予益氣健脾湯0.5 mL/d(生藥濃度2.34 g/mL)灌胃，空白組和模型組給予0.5 mL/d蒸餾水灌胃, 給藥劑量根據(jù)人與動(dòng)物每千克體重劑量折算法計(jì)算[小鼠給藥量(mg/kg)=折算系數(shù)W×人的給藥量(mg/kg)],均灌胃4周。

1.4觀察指標(biāo)及方法

1.4.1血清生化指標(biāo) 末次灌胃結(jié)束后禁食不禁水24 h，采用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后處死小鼠，收集腹主動(dòng)脈血2 mL，離心取上清，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)測定血清TG、TC、FFA、ALT、AST、FPG、FINS水平，并根據(jù)公式計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR=FPG×FINS/22.5)。

1.4.2肝指數(shù) 取血后分離小鼠肝臟組織，稱重并計(jì)算肝指數(shù)，肝指數(shù)=肝臟重量/體重×100%。

1.4.3肝臟組織病理學(xué)觀察 取肝組織，制備石蠟切片，按照說明書進(jìn)行HE染色和油紅O染色，在電子顯微鏡下觀察肝臟的脂質(zhì)聚集情況。肝臟病理組織學(xué)改變參照美國國立衛(wèi)生研究院指南標(biāo)準(zhǔn)[10]評估，其中脂肪變性、肝小葉炎癥均評0～3分，氣球樣變性評0～2分，NAS總分0～8分。同時(shí)采用Image J軟件計(jì)算油紅O染色面積。

1.4.4肝組織中AMPK/SREBP-1c信號通路蛋白表達(dá)情況 采用Western blot法檢測：取各組小鼠適量肝組織，冰上剪成細(xì)小碎片，加入RIPA裂解液后于冰上制備組織勻漿，12 000×g離心10 min收集上清，BCA法測定蛋白濃度，取50 μg蛋白上樣后聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)印，加入脫脂牛奶封閉1 h。按照說明書加入適當(dāng)比例的AMPK、p-AMPK、SREBP-1c和β-actin兔抗鼠單克隆抗體，4 ℃孵育過夜，加入稀釋后的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗后孵育1 h。加入超敏ECL顯影液顯影，室溫下放置2 min，凝膠成像系統(tǒng)掃描并分析，以目標(biāo)蛋白與β-actin條帶的比值計(jì)算目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.4.5肝組織中AMPK/SREBP-1c信號通路相關(guān)mRNA表達(dá)情況 使用RT-qPCR法檢測：用TRIzol試劑盒提取肝組織總RNA，在反轉(zhuǎn)錄酶的催化下合成cDNA，以cDNA為模板在Taq DNA聚合酶催化下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，循環(huán)40次；72 ℃ 10 min。AMPK引物為5’-TAGACAGAAGATTCGCAGTT-3’和5’-CCAGACACATATTCCATTACC-3’；SREBP-1c引物為5’- GTACAGAAAGTTGCA GGGGAAG-3’和5’- ACATAGCACCAACATGGGATTC-3’；β-actin引物為5’-GG AGATTACTGCCCTGGCTCCTA3’和5’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3’。PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像儀采集圖像，PCR儀獲得產(chǎn)物Ct值,采用2-ΔΔCt相對定量計(jì)算公式計(jì)算分析。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠血清生化指標(biāo)水平比較 模型組小鼠血清TG、TC、FFA、ALT、AST、FPG、FINS水平及HOMA-IR均明顯高于空白組(P均<0.05)，二甲雙胍組和益氣健脾湯組各指標(biāo)均明顯低于模型組(P均<0.05)。見表1。

表1 空白組和非酒精性脂肪性肝病各組小鼠血清生化指標(biāo)水平比較

2.2各組肝臟組織病理形態(tài) HE染色及油紅O染色顯示，模型組小鼠肝組織可見肝細(xì)胞明顯腫脹、氣球樣變性，大泡樣脂滴形成并融合；二甲雙胍組和益氣健脾湯組肝細(xì)胞腫脹、氣球樣病變、脂肪變性均較模型組輕，尤其是益氣健脾湯組油紅O染色以小脂滴形式存在。見圖1。

圖1 空白組和非酒精性脂肪性肝病各組小鼠肝臟組織HE染色及油紅O染色表現(xiàn)

2.3各組小鼠肝指數(shù)及肝臟組織病理形態(tài)NAS評分和油紅O染色面積比較 模型組小鼠肝指數(shù)、NAS評分和油紅O染色面積均明顯高于空白組(P均<0.05)，二甲雙胍組和益氣健脾湯組各指標(biāo)均明顯低于模型組(P均<0.05)，并且益氣健脾湯組NAS評分及油紅染色面積均明顯低于二甲雙胍組(P均<0.05)。見表2。

表2 空白組和非酒精性脂肪性肝病各組小鼠肝指數(shù)及肝臟組織病理形態(tài)NAS評分和油紅O染色面積比較

2.4各組小鼠肝組織中AMPK/SREBP-1c蛋白表達(dá)情況比較 各組小鼠肝組織中AMPK蛋白相對表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；與空白組比較，模型組小鼠p-AMPK蛋白相對表達(dá)量明顯降低(P<0.05)，SREBP-1c蛋白相對表達(dá)量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，二甲雙胍組及益氣健脾湯組p-AMPK蛋白相對表達(dá)量明顯升高(P均<0.05)，SREBP-1c蛋白相對表達(dá)量明顯降低(P均<0.05)，并且益氣健脾湯組SREBP-1c蛋白相對表達(dá)量明顯低于二甲雙胍組(P<0.05)。見圖2及表3。

圖2 空白組和非酒精性脂肪性肝病各組小鼠肝組織中AMPK、p-AMPK及SREBP-1c蛋白表達(dá)情況

表3 空白組和非酒精性脂肪性肝病各組小鼠肝組織中AMPK、p-AMPK及SREBP-1c蛋白相對表達(dá)量比較

2.5各組小鼠肝組織中AMPK和SREBP-1c mRNA表達(dá)情況比較 各組小鼠肝組織中AMPK mRNA相對表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；模型組小鼠肝組織中SREBP-1c mRNA相對表達(dá)量明顯高于空白組(P<0.05)，二甲雙胍組和益氣健脾湯組均明顯低于模型組(P均<0.05)，并且益氣健脾湯組明顯低于二甲雙胍組(P<0.05)。見表4。

表4 空白組和非酒精性脂肪性肝病各組小鼠肝組織中AMPK和SREBP-1c mRNA相對表達(dá)量比較

3 討 論

NAFLD的具體發(fā)病機(jī)制目前尚未明確，“多重打擊”學(xué)說近些年來已逐漸被大家認(rèn)可[6]?！岸嘀卮驌簟睂W(xué)說認(rèn)為胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、脂肪組織功能障礙、脂肪酸、腸道菌群、線粒體功能障礙、炎癥激活、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、飲食因素、鐵超載等代謝功能障礙以及遺傳等因素均參與NAFLD的進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)以“多重打擊”中占主導(dǎo)地位的糖脂代謝異常為出發(fā)點(diǎn)進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示NAFLD模型小鼠血脂指標(biāo)、肝功能指標(biāo)、FPG、FINS、HOMA-IR、肝指數(shù)、NAS評分和油紅O染色面積均明顯高于正常小鼠，證實(shí)NAFLD存在明顯糖脂代謝異常。

AMPK是一種異源三聚體，由α、β和γ亞基組成，其中α為催化亞基，β、γ為調(diào)節(jié)亞基。AMPK具有調(diào)節(jié)能量代謝的作用，其作為高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶廣泛存在于真核生物體內(nèi)[7-8]，在體內(nèi)的多個(gè)臟器中均有表達(dá)，能感受到機(jī)體細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP比值的變化，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的能量代謝過程，是機(jī)體的“代謝主控開關(guān)”[9-10]。目前關(guān)于NAFLD的研究顯示， AMPK的活化對脂質(zhì)代謝具有重要調(diào)控作用[11-12]。激活后的AMPK可增強(qiáng)脂肪分解代謝而產(chǎn)生ATP，并同時(shí)降低ATP的消耗來維持細(xì)胞能量的穩(wěn)定狀態(tài)，以此調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝相關(guān)酶的活性，調(diào)控肝內(nèi)脂肪酸的合成與氧化[13]。AMPK 可通過磷酸化以增強(qiáng)下游線粒體的功能，提高能量代謝率；也可抑制脂肪酸合成酶(FAS)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)等脂肪合成酶活性，抑制脂肪合成，減少脂質(zhì)在肝臟中的沉積[14]。

固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBPs)是肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積的重要調(diào)控因子[15]，其由SREBP-1a、SREBP-1c及SREBP-2三種同型異構(gòu)體組成，其中 SREBP-1c構(gòu)成了動(dòng)物體內(nèi)90%的SREBP-1。SREBP-1c主要在肝臟和脂肪細(xì)胞中表達(dá)[16],其通過調(diào)節(jié)脂肪代謝相關(guān)酶來調(diào)控體內(nèi)的脂肪合成,并能抑制線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,促進(jìn)三酰甘油正平衡,減少極低密度脂蛋白膽固醇的合成。同時(shí)高胰島素可促進(jìn)SREBP-1c表達(dá)，SREBP-1c表達(dá)失調(diào)與脂肪肝、血脂異常和2型糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)[17]。AMPK是負(fù)向調(diào)控SREBP-1c的上游因素之一[18]。AMPK/SREBP-1信號軸在脂肪肝發(fā)病機(jī)制中被認(rèn)為是非常重要的分子靶點(diǎn)，AMPK磷酸化可以間接抑制SREBP-1c的表達(dá)[19]。由此可見，AMPK/SREBP-1c信號通路是改善肝臟糖脂代謝的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠p-AMPK蛋白相對表達(dá)量明顯降低，SREBP-1c蛋白和 mRNA相對表達(dá)量均明顯升高，證實(shí)NAFLD模型小鼠存在AMPK/SREBP-1c表達(dá)異常。

益氣健脾湯方中黃芪、丹參、澤瀉、黃連等多味中藥有改善糖脂代謝的作用[20-23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，益氣健脾湯組小鼠血脂指標(biāo)、肝功能指標(biāo)、FPG、FINS、HOMA-IR、肝指數(shù)、NAS評分和油紅O染色面積均明顯低于模型組，提示益氣健脾湯可以顯著改善高脂飲食誘導(dǎo)產(chǎn)生的胰島素抵抗及高血脂癥，改善肝臟組織的脂質(zhì)蓄積。AMPK/SREBP-1c表達(dá)水平檢測結(jié)果顯示，益氣健脾湯組p-AMPK蛋白相對表達(dá)量均明顯高于模型組，SREBP-1c蛋白和 mRNA相對表達(dá)量均明顯低于模型組。提示益氣健脾湯可以上調(diào)小鼠肝臟組織中p-AMPK表達(dá)，下調(diào)SREBP-1c表達(dá)，AMPK/SREBP-1c是益氣健脾湯治療NAFLD的靶點(diǎn)之一，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，益氣健脾湯對NAFLD小鼠的糖脂代謝具有一定調(diào)節(jié)作用，其機(jī)制可能與調(diào)控AMPK/SREBP-1c信號通路有關(guān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。