外源茉莉酸甲酯處理對梨果實青霉病和貯藏品質(zhì)的影響

吳 帆，肖劉華，趙顯陽，李樹成，王印寶，陳金印，2，向妙蓮*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院/江西省果蔬采后處理關鍵技術與質(zhì)量安全協(xié)同創(chuàng)新中心/江西省果蔬保鮮與無損檢測重點實驗室，江西 南昌 330045；2.萍鄉(xiāng)學院，江西 萍鄉(xiāng) 337055）

【研究意義】‘翠冠’梨（Pyrus pyrifoliacv.‘Cuiguan’）屬于呼吸躍變型果實，由于其采收期為七月中上旬，正值盛夏高溫多雨，呼吸代謝旺盛，果實極易發(fā)生軟化腐爛，品質(zhì)下降。其中由擴展青霉（Penicillium expansum）引起的青霉病是造成梨果實腐爛的重要致病因子[1]。目前主要通過化學藥劑控制該病害[2]，但隨著消費者對食品安全的日益關注，尋找一種安全綠色的途徑控制梨果實采后青霉病，延緩貯藏期間‘翠冠’梨貯藏品質(zhì)的下降已成為亟待解決的問題?！厩叭搜芯窟M展】茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）是一種重要內(nèi)源物質(zhì)，廣泛分布于植物體中。MeJA 作為信號物質(zhì)參與植物對外界逆境脅迫的應答反應和信號傳遞，或?qū)Σ≡兄苯右种谱饔肹3]，或誘導寄主產(chǎn)生免疫反應[4]，減緩病害的發(fā)生。前人研究表明，1 μmol/L MeJA 處理顯著降低豇豆低溫貯藏期間冷害的發(fā)生[5]，并調(diào)控相關因子誘導番茄[6]和采后藍莓果實抗灰霉病[7]。此外，MeJA 可有效延緩果蔬貯藏期品質(zhì)的下降，延長貨架期。Liu 等[8]發(fā)現(xiàn)MeJA 處理櫻桃番茄果實可以延緩果實貯藏期間硬度的下降，有效維持果實中類胡蘿卜素和番茄紅素的積累，同時保持可滴定酸和可溶性固形物含量。采前一個月用0.50 mmol/L MeJA 浸果處理對獼猴桃軟腐病防控效果可達77.70%，且可有效改善果實外觀品質(zhì)[9]?！颈狙芯壳腥朦c】本項目組前期研究試驗表明，0.1 mmol/L MeJA 采后處理可有效降低獼猴桃果實的腐爛率、失重率和丙二醛（MDA）含量，提高可溶性固形物含量，延緩可滴定酸的降解速率[10]。目前關于MeJA 處理對梨果實抗采后青霉病及貯藏品質(zhì)影響的報道較少?！緮M解決的關鍵問題】本研究以‘翠冠’梨果實為試驗材料，通過分析不同的MeJA 處理對梨果實抗青霉病的誘導效應，進一步探索MeJA 處理對梨果實品質(zhì)的影響，為MeJA 應用于果實貯藏保鮮提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用果：‘翠冠’梨果實采自江西省峽江縣金坪鄉(xiāng)果園，于當日采摘運抵實驗室，挑選無病蟲害、大小統(tǒng)一的果實，放置24 h 充分散去田間熱，用0.1%次氯酸鈉溶液浸泡果實1～2 min 消毒，自來水沖洗干凈，室溫晾干后保鮮袋單果套袋，入庫備用（冷庫溫度4～5 ℃）。

供試菌株：擴展青霉（P.expansum），由江西農(nóng)業(yè)大學植物病理實驗室提供，-80 ℃保存，試驗前培養(yǎng)5～7 d，用無菌水洗脫孢子，經(jīng)無菌脫脂棉過濾后用血球計數(shù)板計數(shù)，配置濃度為1.0×106spores/mL 孢子懸浮液，備用。

供試試劑：茉莉酸甲酯（Methyl Jasmonate，MeJA）：購自美國Sigma公司，先使用微量0.1%Tween80和少許乙醇混合均勻，后加無菌水配置為濃度1 mmol/L的MeJA溶液，保存于4 ℃冰箱備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同MeJA 處理方法對梨果實抗青霉病的影響 處理1（注入法）：取大小、成熟度一致的試驗用果，用體積分數(shù)75%酒精擦拭梨表面消毒，用無菌接種針在果實表面兩側(cè)各刺一個3.0 mm×5.0 mm 的孔，將20 μL 100 μmol/L 的MeJA 溶液注入孔內(nèi)，對照組CK 用等量含0.1%的Tween80 無菌水代替。將處理好的果實置塑料盒密封后于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱36 h，在果實孔內(nèi)注入20 μL 1.0×106spores/mL 青霉孢子懸浮液。每處理10 個果，3 次重復。

處理2（熏蒸法）：將待處理果實置于熏蒸盒（體積6 L）內(nèi)，中央放置滅菌濾紙（直徑9.0 cm），將適量MeJA 滴在滅菌濾紙上使盒內(nèi)MeJA 濃度達到100 μmol/L，迅速密封，對照組用含0.1% Tween80 無菌水。其它處理同處理1。

以上處理后逐日觀察梨果實發(fā)病情況，采用十字交叉法測量病斑直徑，按以下公式計算誘導效果：

誘導效果=（對照病斑直徑—處理組病斑直徑）/對照病斑直徑×100%。

1.2.2 MeJA處理與接種順序?qū)婀麑嵖骨嗝共〉挠绊?分以下4組處理：處理1，先用100 μmol/L MeJA熏蒸36 h后接種；處理2，用100 μmol/L MeJA 熏蒸同時接種青霉病菌，36 h后停止熏蒸；處理3，梨果實先接種，36 h 后再用100 μmol/L 的MeJA 熏蒸；處理4（對照組CK），接種。接種方法同1.2.1，每組處理10 個果，3次重復。

1.2.3 MeJA 處理對梨果實貯藏品質(zhì)的影響 將1.1 中梨果實置于熏蒸盒（6 L）中，容器內(nèi)MeJA 濃度為100 μmol/L，25 ℃熏蒸處理36 h；對照組置于相同環(huán)境內(nèi)不作任何處理，處理結(jié)束后果實于超凈工作臺通風2 h，置冷藏庫[濕度90%～95%，溫度（3±1）℃]貯藏，每處理3 次重復，每重復50個果實。處理后于第0，7，14，21，35，42，49天測定腐爛率和失重率。并采用混合法取樣，果實去皮后沿赤道部周圍取果肉，切碎液氮凍樣，置-80 ℃超低溫冰箱保存，待用。

1.2.4 腐爛率和失重率的測定 腐爛率：以梨果實發(fā)生軟化、汁液外漏作為腐爛標準。每處理100 個果實，3 次重復。腐爛率=腐爛個數(shù)/總數(shù)×100%。失重率：隨機選取20 個梨果實并編號稱量果實質(zhì)量。失重率=（貯藏前質(zhì)量-貯藏后質(zhì)量）/貯藏前質(zhì)量×100%，每7 d測量一次指標并統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

1.2.5 可溶性固形物含量（TSS）的測定 采用手持數(shù)字糖度計（RA250-WE）測定，均勻取果實赤道部果肉研磨出汁，混勻后取3～4滴用于測定，結(jié)果以%表示。

1.2.6 可滴定酸（TA）、維生素C（Vc）和總糖含量的測定 可滴定酸含量測定參考曹建康等[11]方法，采用酸堿滴定法，結(jié)果以%表示；總糖含量采用蒽酮比色法[11]，結(jié)果以%表示。維生素C（Vc）含量采用2，6-二氯靛酚滴定法測定[10]，結(jié)果以mg/100 g表示。

1.2.7 果實硬度和呼吸速率的測定 使用TA.XT Plus 型質(zhì)構(gòu)儀（英國SMS 公司）測定果實硬度，每個果實隨機均勻取果實赤道部附近去果皮測定5 個點，每組處理測定10 個果實，3 次重復。使用果蔬呼吸測定儀（GHX-3051H）測定梨果實呼吸速率，脫CO2的空氣為載氣，以標準CO2（1 040 μL/L）校準。

1.2.8 總酚含量和MDA 含量測定 MDA 含量測定參考Wang 等[12]的方法并稍微改動。取1.2.2 冷凍待用梨果肉1 g 與8 mL 100 g/L 三氯乙酸（TCA）混勻在研缽中研磨勻漿，以10 000 r/min 離心25 min。將2 mL 上清液與2 mL 0.67%（w/v）硫代巴比妥酸（TBA）混合均勻后加熱煮沸1 h，用自來水沖洗快速冷卻，2 500 r/min 離心20 min。重復離心3 次后，分別在波長450，532，600 nm 處測量上清液的OD 值?？瞻讓φ帐褂肨BA 溶液。根據(jù)以下公式計算MDA 的含量：MDA（mmol/g）=[6.452×（A532-A600）-0.559×A450]×Vt/（Vs×W），Vt：提取物總體積（mL）；Vs：用于測量的提取物的體積（mL）；W：樣品的鮮質(zhì)量（g）；A532，A600和A450分別代表在532，600，450 nm處的吸光度值。

總酚含量根據(jù)Folin-Ciocalteu 法測定參考Singleton 等[13]的方法并稍作改進。使用8 mL 甲醇和1 g梨果實混勻放置在研缽中充分研磨成勻漿轉(zhuǎn)移至10 mL 離心管中，于50 ℃超聲波萃取30 min，然后4 ℃下離心20 min，上清液即為總酚提取液。將反應混合物（0.5 mL 上清液，0.5 mL Folin-Ciocalteu 和5 mL 蒸餾水）在黑暗中放置10 min，然后在室溫下與1 mL 10%Na2CO3混合60 min，測定反應液在波長765 nm 處吸光度值，以沒食子酸作標準曲線計算總酚含量，樣品的總酚含量換算為每100 g 鮮質(zhì)量樣品沒食子酸的含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)利用Excel2003 和SPSS16.0 統(tǒng)計分析，使用Duncan’s 新復極差法分析各處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 MeJA誘導梨果實抗青霉病的效應

如表1 所示，MeJA 通過注入和熏蒸處理均能誘導梨果實抗釆后青霉病，但二者誘導效果不盡相同。熏蒸法處理誘導效果更好，誘導效果最高達15.60%，注入法誘導效果為12.38%，前者為后者的1.26 倍，且在接種后第120 h和第144 h，熏蒸處理誘導效果顯著高于注入處理（P＜0.05）。

表1 MeJA不同處理方法對誘導梨果實抗青霉病的影響Tab.1 Effects of different treaments of MeJA on induced resistance of pear fruit to blue mold

2.2 MeJA處理與接種順序?qū)婀麑嵖骨嗝共〉挠绊?/h3>

不同MeJA 處理均可在一定程度上具有誘導梨果實抗青霉病的作用如表2。處理1（先MeJA 處理后接種）誘導效果最好，為16.14%，處理2（MeJA 與接種同時處理）組次之，誘導效果達14.21%，處理3（先接種后使用MeJA 處理）誘導效果最低為4.87%，處理1 誘導效果為處理3 的3.38 倍，差異達顯著水平（P＜0.05）。

表2 MeJA處理與接種順序?qū)婀麑嵖骨嗝共〉挠绊慣ab.2 Effects of MeJA and inoculation sequence on induced resistance of pear fruit to blue mold

2.3 MeJA處理對貯藏期梨果實腐爛率和失重率的影響

如圖1A所示，低溫冷藏期間梨果實腐爛率隨貯藏時間延長呈不斷增大的趨勢，第35天時MeJA處理組果實腐爛率較對照組降低16.52%，差異達顯著水平，其它時間點MeJA 處理組與對照組之間果實腐爛率均無顯著區(qū)別。失重率如圖1B 所示，隨時間延長呈不斷增大趨勢，但MeJA 處理對梨果實失重率無顯著性影響（P＜0.05）。

圖1 MeJA處理對梨果實低溫貯藏期間腐爛率（A）和失重率（B）的影響Fig.1 Effect of MeJA on the decay rate（A）and weight loss rate（B）of pear fruits during cold storage

2.4 MeJA處理對貯藏期梨果實硬度和呼吸強度的影響

由圖2A可知，在低溫貯藏期間‘翠冠’梨果實硬度隨時間延長呈不斷下降的趨勢，且MeJA處理對‘翠冠’梨果實硬度無顯著性影響。MeJA處理對果實呼吸作用的影響如圖2 B所示，MeJA處理組和對照組果實呼吸強度隨時間的延長均呈先增大后降低的趨勢。第14天前，MeJA處理組呼吸強度高于對照組，差異不顯著，第14天后，對照組呼吸強度逐漸高于MeJA組，兩者在21～35 d差異達顯著水平（P＜0.05）。

圖2 MeJA處理對低溫貯藏期間梨果實硬度（A）和呼吸強度（B）的影響Fig.2 Effect of MeJA on the firmness（A）and respiratory intensity（B）of pear fruits during cold storage

2.5 MeJA處理對梨果實TSS和總糖含量的影響

由圖3 A可知在低溫貯藏期間MeJA 處理組和對照組TSS不斷降低，在貯藏21～42 d期間和對照相比MeJA 處理提高了果實TSS 含量，除42 d 外均有顯著性差異。總糖含量變化如圖3B 所示，在整個貯藏期先上升后下降，與對照相比貯藏14 d內(nèi)MeJA處理可以顯著提高果實總糖含量（P＜0.05）。

圖3 MeJA處理對低溫貯藏期間梨果實TSS（A）和總糖含量（B）的影響Fig.3 Effect of MeJA on the TSS（A）and total sugar（B）content of pear fruits during cold storage

2.6 MeJA處理對梨果實TA和Vc含量的影響

在低溫貯藏期間MeJA 處理對果實TA 含量的影響如圖4A 所示，隨時間的延長MeJA 處理組和對照組果實均呈先上升后降低的趨勢，且均在貯藏第14 天TA 含量達到最高，分別為0.14%和0.12%。在第14 天和28～42 天MeJA 處理顯著提高了果實TA 含量，其中第35 天MeJA 處理組TA 含量為對照組的1.25倍。MeJA 處理對果實Vc 含量影響如圖4B 所示，隨時間延長MeJA 處理組和對照組果實Vc 含量均呈不斷下降的趨勢。與對照相比，MeJA 處理組在第7，14，42 天顯著提高了果實Vc 含量（P＜0.05），分別為4.38、4.21和3.72 mg/100 g，依次為對照組的1.21、1.18和1.19倍。

圖4 MeJA處理對低溫貯藏期間梨果實TA（A）和Vc含量（B）的影響Fig.4 Effect of MeJA on the TA（A）and Vc（B）content of pear fruits during cold storage

2.7 MeJA處理對梨果實MDA和總酚含量的影響

如圖5A所示，低溫貯藏期間，MeJA處理組和對照組梨果實MDA含量不斷增加。和對照組相比，Me-JA 處理在第21天和42天MDA 含量分別降低了22.94%和24.30%，差異達顯著水平。由圖5B可知，對照組梨果實總酚含量變化較為平穩(wěn)，呈略微下降的趨勢，而MeJA 處理組果實總酚含量則呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，在貯藏第28～42 天MeJA 處理可以顯著提高果實總酚含量，其中第35 天出現(xiàn)峰值，最高達191.03 mg/100 g，是對照組的1.27倍（P＜0.05）。

圖5 MeJA處理對低溫貯藏期間梨果實MDA（A）和總酚含量（B）的影響Fig.5 Effect of MeJA on the MDA（A）and total phenol（B）content of pear fruits during cold storage

3 討論

MeJA 作為內(nèi)源信號分子具有提高植物抵御病原菌侵入和抵抗逆境脅迫的能力[3]。本試驗結(jié)果表明，100 μmol/L MeJA 熏蒸處理和注入處理均能在一定程度上誘導‘翠冠’梨抗青霉病，但是兩者作用效果不同，熏蒸法誘導效果更佳。使用MeJA 溶液浸果處理的方法也可以控制香蕉釆后腐爛，提高香蕉對炭疽病抗性[14]，于萌萌等[15]通過MeJA真空滲透的方法提高了番茄果實對灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）、擴展青霉（Penicillium expansum）和鏈格孢霉（Alternaria solani）等病菌的抗性。

果實在釆后貯藏期間由于自身生理代謝的進行，其品質(zhì)會發(fā)生下降，商品價值降低。近年諸多試驗表明MeJA 處理可以有效保持貯藏期間果實營養(yǎng)品質(zhì)，延長果實貨架期。如李天等[16]發(fā)現(xiàn)使用濃度為1 μmol/L 的MeJA 溶液浸泡處理芹菜可以延緩貯藏期鮮切芹菜的可溶性蛋白、纖維素和葉綠素的降低，保持其較好的生理品質(zhì)；本項目組在前期試驗中發(fā)現(xiàn)0.1 mmol/L 的MeJA 熏蒸處理可以顯著降低貯藏期間獼猴桃果實腐爛率和失重率，有效延緩果實可滴定酸和可溶性固形物的下降[17-18]；另有研究表明MeJA 處理組顯著降低豇豆的銹斑指數(shù)，呼吸強度，水溶性果膠含量，細胞膜相對滲透率和丙二醛含量，維持較高的原果膠含量[19]。本試驗發(fā)現(xiàn)梨果實經(jīng)100 μmol/L MeJA處理可以顯著提高低溫貯藏期間果實TSS、可溶性固形物、總糖含量及維生素C 含量。這可能與MeJA 有效抑制了梨果實呼吸作用，降低果實代謝活動有關。這一結(jié)果與前人在馬鈴薯[20]、尖椒[21]和石榴[22]中結(jié)論類似。

呼吸作用作為釆后果實的主要代謝活動，對調(diào)控果實釆后的衰老起至關重要的作用。近年來多項研究指出MeJA 可以調(diào)控多種釆后果實的呼吸作用，且受MeJA 濃度和果實種類影響。魏征等[23]研究認為1～100 μmol/L 的MeJA 霧化熏蒸均能有效抑制冬棗果實貯藏期間的呼吸強度，有效延緩其衰老進程，保持冬棗果實品質(zhì)，上述結(jié)論與本試驗中MeJA 應用于梨果實結(jié)論相同。梨果實含有大量酚類物質(zhì)如總酚類黃酮等具有清除自由基的作用，起到重要的抗氧化效果[24]。本試驗研究表明MeJA處理在低溫貯藏期間可以顯著提高梨果實總酚含量，使其維持在較高水平，提高了貯藏期間梨果實抗氧化能力。

本試驗初步探究了MeJA 處理誘導梨果實抗釆后青霉病的效應及其對梨果實貯藏品質(zhì)的影響，但如何從能量代謝、轉(zhuǎn)錄組學和蛋白組學等角度闡述MeJA 調(diào)控梨果實抗病機制及對果實品質(zhì)和貯藏性能的影響有待后續(xù)試驗進一步研究。