青海干旱地區(qū)蠶豆根瘤菌耐旱性研究

李 萍，滕長才，丁寶軍，劉玉皎，侯萬偉，何 濤

（1.青海大學 農林科學院（青海省農林科學院），青海 西寧 810016；2.青海大學 省部共建三江源生態(tài)與高原農牧業(yè)國家重點實驗室，青海 西寧 810016）

【研究意義】氮素是蠶豆生長必需的營養(yǎng)元素之一，蠶豆氮素的來源主要有根瘤固氮、土壤氮和肥料氮[1]，雖然肥料氮為作物獲得高產提供了可能，但過度的施用和依賴造成土壤板結、肥力下降，給農業(yè)生產和生態(tài)環(huán)境帶來巨大的負面影響而引起關注[2-3]。根瘤菌（Rhizobium）是一類能夠固定大氣中游離態(tài)的氮與豆科植物建立共生關系的α-和β-變形菌[4]，蠶豆-根瘤菌構成的共生固氮體系可為蠶豆提供生長所需80%的氮源，一個生長季節(jié)能夠固定并提供約200 kg/hm2，遠遠高于大豆（100 kg/hm2）[5]，因此，根瘤菌共生固氮的研究成為生命科學的研究熱點。然而根瘤菌與豆科植物之間有很強的選擇性，只有因地制宜的篩選與宿主相匹配的根瘤菌，才能形成有效共生固氮體系，生物固氮作用才得以充分發(fā)揮?！厩叭搜芯窟M展】根瘤菌-豆科作物的相互作用不僅取決于宿主植物自身的結瘤親和性，更與限制結瘤環(huán)境因子有直接的關系[6-7]。干旱是影響作物生長的一個全球性問題，在干旱和半干旱地區(qū)，缺水使根瘤菌的繁殖受到抑制難以與豆科植物共生結瘤，是限制結瘤的重要因子之一。然而在這種干旱環(huán)境中卻能孕育出在逆境中生長繁殖并結瘤、固氮的耐旱根瘤菌[8-9]，表現出與環(huán)境良好的適應性。研究者們發(fā)現，接種與之共生的高效根瘤菌不僅能減少干旱缺水所造成的細胞膜損傷、維持滲透壓、減少氧化脅迫，顯著提高作物的抗旱能力，而且能減少化學氮肥的施用，提高豆科作物的產量和品質。在農業(yè)實際生產中，大豆[10]、豌豆[11]、花生[12]、苜蓿[13]等豆科植物與高效根瘤菌接種提高其抗逆性、結瘤固氮能力和產量的研究報道屢見報端，已成為一項重要的農業(yè)措施。【本研究切入點】蠶豆（Vicia fabaL.）屬蝶形花科野豌豆屬，是青海省重要的糧食、蔬菜、副食、飼料和輪作倒茬、間套種養(yǎng)地作物，在“化肥減量增效”和“全省打造全域綠色有機農畜產品示范省”行動中，蠶豆的生物固氮作用發(fā)揮著非常重要的作用[14]。有關蠶豆根瘤菌的研究報道主要涉及生物地理分布及形成機制[15]、系統(tǒng)發(fā)育及多樣性[16]，生物和非生物脅迫少有研究[17]，而針對青海干旱地區(qū)耐旱根瘤菌篩選與評價尚未見報道。本研究以耐旱菌株接種提高蠶豆抗旱性的題科學問為出發(fā)點，廣泛采集干旱地區(qū)蠶豆根瘤菌并對其耐旱性進行篩選和評價?！緮M解決的關鍵問題】對干旱地區(qū)蠶豆根瘤菌的耐旱性進行研究，試圖從中篩選出具有較強抗逆性的根瘤菌株，為下一步開展蠶豆耐旱根瘤菌的接種應用，充分發(fā)揮根瘤菌與蠶豆共生固氮效率提供前期技術基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2020 年6—7 月，對青海省干旱農業(yè)蠶豆種植區(qū)的海東市1 區(qū)（樂都區(qū)）、4 縣（化隆縣、循化縣、民和縣、互助縣）、西寧市3 縣（湟中縣、大通縣、湟源縣）、海南藏族自治州1 縣（共和縣）、1 鎮(zhèn)（塘格木鎮(zhèn)）進行蠶豆根瘤采樣（表1）。2020 年8 月—2021 年1 月，對72 份根瘤樣品進行分離，經滅菌處理YMA 剛果紅平板上劃線純化至獲得單個典型菌落，革蘭氏染色、鏡檢、初步鑒定后獲得49 份蠶豆根瘤菌，于10%甘油中-80 ℃保存。

表1 蠶豆根瘤菌菌株及其來源Tab.1 Rhizobium strains isolated from faba bean and information of their source

續(xù)表Continued tab.

1.2 試驗設計

對采集分離純化后的蠶豆根瘤菌進行耐旱性評價，在YMA 培養(yǎng)液中加入不同濃度的聚乙二醇（PEG-6000）人工模擬干旱條件，設置4個不同的PEG-6000滲透勢水平：（1）僅使用YMA液體培養(yǎng)液，滲透勢為0 mPa；（2）10%PEG-6000 的YMA 液體培養(yǎng)液，滲透勢為-0.2 mPa；（3）15%PEG-6000 的YMA 液體培養(yǎng)液，滲透勢為-0.4 mPa；（4）20%PEG-6000的YMA液體培養(yǎng)液，滲透勢為-0.6 mPa，以0 mPa PEG-6000為對照（CK），每水平設3次重復。

1.3 研究方法

1.3.1 標準菌懸液制備 將保存于10%甘油中的菌株接入YMA 固體平板培養(yǎng)基活化培養(yǎng)，分別挑取1 環(huán)接種到已滅菌的YMA 液體培養(yǎng)液中，置于28 ℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)72 h，測定根瘤菌懸浮液的光密度值（OD600值約0.8～0.9）。以較低OD600值菌液為基準，將各菌液加無菌水稀釋制成光密度值一致的菌懸液，即為試驗用的標準菌懸液。

1.3.2 耐旱性測定 以菌株在滲透勢下能否增殖為劃分根瘤菌耐旱標準。吸取0.1 mL標準菌懸液接入不同PEG-6000濃度的YMA液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，7 d后混勻取樣，在600 nm下測定其OD值，以OD值的大小評價其生長繁殖狀況，測定前用相應濃度PEG-6000的YMA培養(yǎng)液對儀器進行調零處理。

2 結果與分析

2.1 蠶豆根瘤菌耐旱性的多樣性分析

2.1.1 蠶豆根瘤菌耐旱性分析 以菌株在PEG-6000滲透勢下能否增殖為劃分根瘤菌耐旱標準，供試菌株在模擬干旱脅迫0～-0.6 mPa 下各滲透勢水平下的濁度及相對值（即各菌株在各水平下的OD600值與相應0 mPa的OD600值的比值）進行數據分析（表2）。

表2 供試菌株在干旱模擬條件下的吸光值（OD600）Tab.2 Turbidity of the tested strain under simulated drought conditions

干旱缺水對根瘤菌與豆科植物建立結瘤固氮共生體系具有重要影響。本研究結果顯示，隨著PEG6000 濃度的增加，各菌株OD 值總體上呈下降趨勢，PEG6000 濃度在10%、15%、20%時，與對照菌株的OD 值比較下降幅度分別為3.40%～98.38%、3.74%～72.45%、17.94%～81.49%，平均下降27.50%、39.06%、51.32%。隨著干旱程度的增加，菌株生長受到的抑制作用逐漸增大。同時，筆者也發(fā)現在PEG6000 濃度為10%時，有3 個菌株（HD-13、XN-25、HN-43）的OD 值并沒有下降，反而與對照相比OD值上升，為26.05%、1.52%、0.56%。比較不同菌株OD值下降結果發(fā)現，在同一個滲透水平PEG6000濃度條件下，菌株間OD 值下降率存在較大差異，其中來自于典型干旱農業(yè)區(qū)的海東市樂都區(qū)瞿曇鎮(zhèn)菌株號為HD-21 和來自于西寧市湟中縣李家山鎮(zhèn)菌株號為XN-22 的OD 值下降率明顯低于其它菌株，說明這2 株根瘤菌能夠耐受一定程度的干旱，可以作為下一步耐旱菌株接種蠶豆提高耐旱性的實驗的材料。

2.1.2 干旱脅迫下蠶豆根瘤菌生長分析 對不同PEG6000滲透勢水平下測定的菌懸液濁度值進行方差分析，考察干旱模擬脅迫下供試的49份蠶豆根瘤菌菌株耐旱性的顯著性差異（表3）。方差分析表明，以PEG6000模擬干旱脅迫條件，以不脅迫0%為對照，設定10%、15%、20%的脅迫梯度間在1%水平上差異極顯著，說明本研究設定的脅迫梯度能較好區(qū)分菌株的耐旱能力，結果可靠。同時方差分析還顯示干旱對蠶豆根瘤菌生長存活的影響差異極顯著（P＜0.000 1）。

表3 干旱模擬條件下供試菌株生長的方差分析Tab.3 Variance analysis of rhizobia growth under drought conditions

同時，用平均連鎖法（UPGMA）對參試的49 份蠶豆根瘤菌菌株耐旱能力相似性進行聚類分析，聚類結果表明：來自青海干旱地區(qū)的49 份菌株的耐旱能力可分為3 類群（圖1）。第一類群由8 個菌株組成，均來自海東市干旱地區(qū)，其中6株來自海東市化隆縣和循化縣，2株來自海東市民和縣；第二類群由38個菌株組成，其中3株來自海東市民和縣，2株來自海東市樂都縣，10株來自西寧市湟中縣，4株來自海東市互助縣，1株來自西寧市大通縣，12株來自海南州共和縣，6株來自西寧市湟源縣；第三類群由3個菌株組成，1株來自西寧市湟中縣，2株來自海南州共和縣和海南州塘格爾鎮(zhèn)。

圖1 供試菌株耐旱能力聚類分析結果Fig.1 Dendrogram showing relationship among rhizobia strain of dry-tolerant

綜合方差分析和聚類結果表明：青海干旱地區(qū)蠶豆根瘤菌耐旱能力呈現多樣性，來自青海不同干旱地區(qū)的蠶豆根瘤菌的干旱耐受能力不盡相同，并且來自同一地區(qū)的蠶豆根瘤菌之間的耐旱能力也呈多要性特征。

2.2 干旱條件下菌株生長模式分析

PEG-6000 模擬干旱條件下供試菌株的生長模式也不盡相同，以0%PEG-6000 培養(yǎng)液為對照，不同脅迫條件下供試菌株主要表現為3種生長模式。

第一種模式，在ψ=-0.2 mPa（10%PEG6000）時，菌株的生長不但沒有被抑制，其濁度值反而高于CK（ψ=0 mPa）（圖2），這些菌株是HD-13、XN-25、HN-43，占供試菌株的6.1%。在干旱條件下，這3 種菌株在10% PEG 處理下的生長狀況優(yōu)于對照，說明培養(yǎng)液10%的滲透勢對根瘤菌菌株生長的影響不大，而且適當的脅迫反而對根瘤菌菌株的生長有促進作用，這可能是這些菌株與宿主蠶豆植株長期生長在干旱環(huán)境中對其生存環(huán)境適應的結果。同時發(fā)現，菌株號為HD-13的菌株分離自海東市民和縣西溝鄉(xiāng)，宿主蠶豆為地膜栽培種植。蠶豆地膜覆蓋栽培技術是青海省干旱農業(yè)區(qū)蠶豆生產的一項高產栽培技術，地膜栽培下干旱地區(qū)土壤濕潤，適合類生菌的生長及繁殖；菌株號為HN-43的菌株分離自海南州共和縣鐵蓋村，宿主蠶豆種植在不施肥的青稞茬農田，不同的土壤環(huán)境催生了具有抗性的菌株，使菌株具有較好的耐旱性。第二種模式，菌株HD-1，HD-11，HD-21，XN-22，HN-50，HN-59，這6個菌株一方面存在一個中間致死滲透勢，即菌株在-0.4 mPa滲透勢時存活數量減少或增殖能力減弱，而在-0.6 mPa這一更低滲透勢時存活數量又增高（圖3）。第三種模式，隨著滲透勢的下降，蠶豆根瘤菌培養(yǎng)液的吸光度值也隨之下降（圖4）。這些菌株HD-2，HD-3，HD-13，HD-15，HD-19，XN-24，XN-26，XN-29，XN-30，XN-31，XN-32，XN-33，XN-34，HD-38，HD-40，HD-41，XN-42，HN-45，HN-46，HN-47，HN-49，HN-51，HN-54，HN-55，HN-57，HN-58，XN-88，XN-89，XN-90，XN-92，XN-95，XN-98，共32個菌株，占供試菌株的65.3%。

圖2 第一類生長模式（菌株：HD-13）Fig.2 The first kind of growth model（strain：HD-13）

圖3 第二類生長模式（菌株：HD-11）Fig.3 The second kind of growth model（strain：HD-11）

圖4 第三類生長模式（菌株：HD-41）Fig.4 The third kind of growth model（strain：HD-41）

3 討論與結論

水分是土壤微生物能否正常生長的最重要的限制因素之一，豆科植物-根瘤菌共生關系的形成及其活性對干旱十分敏感，土壤干旱缺水使根瘤菌的存活受到影響。本論文結果表明青海干旱地區(qū)蠶豆根瘤菌資源中存在耐旱性較強的菌株，耐旱能力呈現多樣性，同時從側面反映出利用PEG6000人工模擬干旱環(huán)境篩選耐旱根瘤菌的方法是可行的。以0%PEG6000 的YMA 液體培養(yǎng)液為對照，考察根瘤菌在不同梯度滲透濃度下的生長情況發(fā)現，分離自青海不同干旱地區(qū)的蠶豆根瘤菌在沒有滲透干旱脅迫下其生長繁殖能力存在差異，不同根瘤菌在相同滲透脅迫環(huán)境下和同一根瘤菌在不同脅迫環(huán)境下其生長繁殖能力均存在差異，并且隨著干旱脅迫強度的加深，所有菌株生長繁殖能力均出現不同程度的下降。分析原因筆者認為青海特殊的地理環(huán)境造就了與之長期共生蠶豆根瘤菌的生長多樣性，加之土壤是一個不連續(xù)的高度異質體，這種高度異質環(huán)境使根瘤菌在土壤中所處的微環(huán)境存在差異，這些差異使蠶豆根瘤菌向不同方向進化，從而表現出耐旱能力多樣性特點。同時筆者也認為這種多樣性分布的產生是由于當地種植制度、土地利用狀況、土壤類型等方面差異使蠶豆根瘤菌表現出耐旱能力多樣性特點。與此同時，分離自同一地區(qū)不同蠶豆品種的根瘤菌耐旱能力也呈現多樣性，這可能與根瘤菌結瘤的宿主專一性及品種差異有關。遲玉成[18]研究山東省花生土著根瘤菌耐旱性中指出，山東省花生種植區(qū)存在具有較強耐干旱的菌株，來自同一地區(qū)的花生根瘤菌耐旱能力呈現多樣性，來自同一地區(qū)、不同花生品種的根瘤菌耐旱能力也呈現多樣性。這一結論與本研究得到的結果一致。裴曉峰[19]對耐旱大豆根瘤菌研究中同樣也得到相似結論。

逆境條件下分布的根瘤菌表現出與環(huán)境良好的適應性，根瘤菌株的耐旱性與其分離地點相關，是菌株長期適應生態(tài)環(huán)境的結果，這一觀點在本研究中也得到了證實。本論文中大多數菌株生長的最適PEG 濃度在10%以下，說明10%的滲透勢對根瘤菌菌株生長的影響不大，而且適當的脅迫反而對根瘤菌菌株的生長有促進作用，這可能是這些菌株與宿主蠶豆植株長期生長在干旱環(huán)境中對其生存環(huán)境適應的結果。相似的結論在黃明勇等[20]對花生根瘤菌耐旱性研究和韓梅[21]對蠶豆耐旱性研究中也有過報道。本論文發(fā)現隨著滲透勢濃度的增加，6 個菌株（HD-1，HD-11，HD-21，XN-22，HN-50，HN-59）在-0.4 mPa 滲透勢時存活數量減少或增殖能力減弱，而在-0.6 mPa這一更低滲透勢時存活數量又增高。本研究中存在的這種現象與曾小紅[22]在用PEG6000人工模擬干旱條件研究金沙江河谷地區(qū)豆科樹種根瘤菌耐干熱中得到的結論一致。Van Rensburg[23]在研究中認為這是由于中間滲透勢使細胞部分失水使其功能酶造成損傷，而在-0.6 mPa更低的滲透勢情況下存活率提高是由于酶的正常功能受到保護所致。本研究最終篩選獲得5個比較耐干旱的菌株，分別分離自海東市民和縣的菌株HD-11，海東市樂都區(qū)的菌株HD-21，西寧市湟中縣的菌株XN-22，海南州共和縣的菌株HN-50，海南州塘格爾鎮(zhèn)的菌株HN-59，它們在-0.6 mPa（即20%PEG）的滲透勢水平仍能生長發(fā)育，菌液濁度在68%以上?？梢蚤g接推斷上述菌株在干旱脅迫時對寄主植物具有較強的浸染能力，有利于寄主植物在干旱環(huán)境中獲取更多的養(yǎng)分，從而提高了蠶豆植株的抗旱性。

同時，蠶豆根瘤菌共生體系的固氮過程從根本上是由根瘤菌、蠶豆和所在環(huán)境共同決定的，土壤復雜的理化性和各種生物因素，勢必對根瘤菌耐旱性造成影響，在下一步的研究工作中需要考慮土壤理化性對耐旱菌株的影響。