苦參堿注射液對小鼠急性酒精性肝損傷的保護作用*

都夢帆，胥冰，向汝，郭東艷，范妤，史曉燕，段麗芳

（陜西中醫(yī)藥大學(xué)1.醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，2.陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點實驗室3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽712046）

酒精性肝?。╝lcoholic liver disease, ALD）指攝入過量酒精引起的廣泛肝損傷，導(dǎo)致酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化及酒精性肝硬化等一系列肝臟損傷的疾病[1]，隨著持續(xù)大量攝入酒精而逐級病變。目前ALD 發(fā)病率在肝臟疾病中排第2 位，僅次于病毒性肝炎，隨著疾病的進展會逐漸發(fā)展為不可逆的肝硬化，甚至肝癌，嚴重威脅患者的健康[2]。酒精性肝損傷目前沒有較好的臨床治療策略，西醫(yī)主要以營養(yǎng)支持和對癥治療為主，療效甚微，不良反應(yīng)較多[3]。我國傳統(tǒng)中藥可保肝護肝、健脾和胃、降低轉(zhuǎn)氨酶、加快乙醇代謝，還能逆轉(zhuǎn)酒精導(dǎo)致的肝細胞損傷，減輕酒精代謝物對臟器的損傷[4]，因此從中草藥中提取有效成分，探尋預(yù)防和治療酒精性肝損傷的新藥物具有重要意義。

苦參堿是一種四環(huán)喹啉嗪生物堿[5]，主要存在于苦參、廣豆根、苦豆子等豆科植物中，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗纖維化等藥理作用[6]，目前臨床上主要用于輔助其他藥物對病毒性肝炎和腫瘤等疾病進行治療[7]。有研究表明苦參堿可調(diào)節(jié)機體的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，協(xié)同保護潰瘍性結(jié)腸炎和肺損傷[8]。苦參堿可明顯改善四氯化碳誘導(dǎo)的藥物性肝損傷，增強抗氧化物酶，減少肝損傷產(chǎn)生高氨血癥引起的氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥，減少四氯化碳誘導(dǎo)細胞凋亡引起的焦慮和抑郁等[9]。但其在酒精性肝損傷中的保護作用還不清楚。因此本文主要針對苦參堿在酒精性肝損傷中的抗氧化作用進行研究，探究苦參堿的肝保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性昆明小鼠30 只，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（陜）2018-001，實驗動物使用許可證號：SYXK（陜）2015-002，體重（20±2）g，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心。小鼠分籠飼養(yǎng)，室溫保持（20±3）℃，模擬正常光照時間，普通飼料喂養(yǎng)。本實驗遵循實驗動物保護和使用指南，并經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 藥品與試劑

苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品購自山東瑞陽制藥股份有限公司，溶解于葡萄糖溶液后參照成人用量折算，按比例分別制成高劑量組（2.8 mg/kg）、低劑量組（1.4 mg/kg）。

丙二醛（Malondialdehyde, MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、還原型谷胱甘肽（Glutathione, GSH）、過氧化氫酶（Catalase, CAT）、甘油三酯（Triglyceride, TG）測定試劑盒，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase, ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase, AST）試劑盒、總膽紅素（total bilirubin, T-BIL）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。BCA 蛋白定量檢測試盒購自武漢博士德生物工程有限公司，油紅O 染色試劑盒購自西安赫特生物科技有限公司，HE 染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

DM4000B 顯微鏡、石蠟切片機購自德國Leica 公司，ELx808 酶標(biāo)儀購自美國Bio Tek 公司，TC-120S 型生物組織自動脫水機、TB-718EL 生物組織包埋機、TK-218II 生物組織攤片、烤片機購自湖北泰維科技實業(yè)有限公司，Centrifuge 5417R 臺式冷凍高速離心機購自德國Eppendorf 公司。

1.4 方法

1.4.1 動物分組與藥物干預(yù) 將30 只小鼠根據(jù)隨機分類法分為空白組、模型組、陽性對照組（聯(lián)苯雙酯滴丸125 mg/kg）、苦參堿高劑量組（苦參堿注射液2.8 mg/kg）、苦參堿低劑量組（苦參堿注射液1.4 mg/kg）。各組按照10 ml/（kg·d）劑量進行尾靜脈注射，空白組和模型組注射同等劑量的葡萄糖溶液。實驗期間不限進食和飲水，連續(xù)給藥14 d，末次給藥12 h 后，除空白組外，其余各組按12 ml/kg一次性灌胃50%乙醇，復(fù)制急性酒精性肝損傷模型，16 h 后取血和肝臟。

1.4.2 一般形態(tài)觀察 在整個實驗過程中，觀察小鼠的體重變化、進食、飲水、毛發(fā)、精神狀態(tài)、行為及死亡情況，有任何異常情況及時記錄。

1.4.3 肝指數(shù)測定 4℃生理鹽水漂洗肝臟，吸干水分后稱重。肝臟指數(shù)（%）=肝臟重量（g）/小鼠體重（g）×100%

1.4.4 血清生化指標(biāo)檢測 血液樣品靜置2 h，冷凍離心機4℃、3 500 r/min 離心10 min，取上清液用于檢測血清ALT、AST 和T-BIL。

1.4.5 肝組織的病理切片觀察 肝左葉最大橫截面取2～3 mm，經(jīng)固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片后，按照蘇木精-伊紅染色試劑盒步驟染色，封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠肝組織的病理變化。

1.4.6 肝組織相關(guān)指標(biāo)檢測 取適量肝組織樣本，加入10 倍預(yù)冷生理鹽水，研磨后制備成10%的組織勻漿，4℃條件下3 500 r/min 離心10 min，吸取上清液，進行蛋白定量后檢測MDA、TG、SOD、CAT、GSH 水平。

1.4.7 肝細胞脂滴沉積分析 取OCT 包埋膠固定的肝組織，用冷凍切片機-20℃切至10 μm，切片用10%的中性甲醛固定，60%異丙醇漂洗，經(jīng)油紅O 滴染、漂洗、復(fù)染后，甘油封片。光學(xué)顯微鏡下觀察各組肝組織脂滴分布。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件半定量測定脂滴的平均光密度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進一步的兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組肝臟指數(shù)的變化

空白組、模型組、陽性對照組、苦參堿高劑量組、苦參堿低劑量組肝指數(shù)分別為（5.01±0.34）% 、（5.91±0.24）% 、（5.29±0.54）% 、（5.41±0.40）%和（5.51±0.25）%，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=8.904，P=0.001），模型組較空白組增加（P＜0.05），苦參堿高劑量組、苦參堿低劑量組、陽性對照組較模型組降低（P＜0.05）。

2.2 各組血清ALT、AST、T-BIL水平的變化

各組血清AST、ALT、T-BIL 相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），模型組較空白組升高（P＜0.05），提示小鼠肝損傷模型復(fù)制成功。陽性對照組、苦參堿高劑量組、苦參堿低劑量組較模型組降低（P＜0.05），提示苦參堿預(yù)處理可改善急性肝損傷小鼠模型的ALT、AST、T-BIL 活性。見表1。

表1 各組血清AST、ALT、T-BIL水平比較（n=6，±s）

表1 各組血清AST、ALT、T-BIL水平比較（n=6，±s）

組別空白組模型組陽性對照組苦參堿高劑量組苦參堿低劑量組F 值P 值A(chǔ)ST/（u/L）54.38±7.58 166.98±20.37 60.43±8.33 88.25±13.31 109.17±15.81 10.017 0.001 ALT/（u/L）27.43±3.06 41.34±5.48 31.71±4.13 32.48±5.35 35.04±4.03 4.307 0.024 T-BIL/（μmol/L）2.92±1.11 38.84±10.14 13.80±8.96 22.77±7.96 25.18±5.48 16.356 0.000

2.3 各組肝組織病理學(xué)變化

空白組肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝索排列清晰整齊，無肝細胞變性、壞死，未見脂肪變性。模型組肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰，肝索雜亂排列，大量炎癥細胞浸潤，肝實質(zhì)間出現(xiàn)大量細胞空洞，核固縮深染，肝細胞水腫，出現(xiàn)嚴重的脂肪變性和氣球樣變性?？鄥A低劑量組和陽性對照組較模型組稍有好轉(zhuǎn)，苦參堿高劑量組肝臟形態(tài)趨于完整，無明顯空洞，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索排列整齊，少量核固縮深染，未見明顯水腫和脂肪變性。見圖1。

圖1 苦參堿對酒精性肝損傷小鼠肝組織形態(tài)學(xué)的影響 （HE染色×100）

2.4 各組肝組織抗氧化能力的變化

各組肝組織勻漿中SOD、MDA、GSH、CAT、TG 水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），模型組SOD、GSH、CAT 較空白組降低（P＜0.05），MDA、TG 較空白組升高（P＜0.05）。陽性對照組、苦參堿高劑量組的GSH、CAT、SOD 較模型組升高（P＜0.05），MDA、TG 較模型組降低（P＜0.05）。低劑量苦參堿預(yù)處理可提高GSH、CAT 水平，抑制肝臟中TG 水平，但模型組與苦參堿低劑量組SOD、MDA 水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組肝組織SOD、MDA、GSH、CAT、TG相對表達量比較 （n=6，±s）

表2 各組肝組織SOD、MDA、GSH、CAT、TG相對表達量比較 （n=6，±s）

組別空白組模型組陽性對照組苦參堿高劑量組苦參堿低劑量組F 值P 值SOD/（u/mg）0.26±0.02 0.16±0.04 0.23±0.05 0.24±0.03 0.20±0.03 6.025 0.007 MDA/（nmol/mg）0.76±0.10 1.13±0.25 0.83±0.18 0.86±0.16 0.93±0.22 4.002 0.025 GSH/（g/L）1.87±0.20 1.30±0.24 1.63±0.26 1.73±0.30 1.65±0.26 4.539 0.021 CAT/（u/mg）1.18±0.06 0.87±0.10 1.04±0.05 1.12±0.04 1.00±0.07 5.212 0.010 TG/（mmol/L）0.13±0.02 0.29±0.05 0.16±0.05 0.19±0.03 0.20±0.04 3.691 0.032

2.5 苦參堿對酒精性肝損傷小鼠肝組織脂滴沉積的影響

油紅O 染色結(jié)果顯示：空白組小鼠肝臟細胞中存在少量、小體積、分布均勻的橘紅色小脂滴。模型組小鼠可見肝細胞內(nèi)出現(xiàn)彌漫性、大小不一的橘紅色脂滴，相鄰肝細胞內(nèi)脂滴融合，且較空白組體積增大。陽性對照組、苦參堿高劑量組、苦參堿低劑量組小鼠肝細胞內(nèi)橘紅色脂滴較模型組數(shù)量減少，體積減小，差異顯著（見圖2）。計算脂滴光密度后結(jié)果顯示：空白組、模型組、陽性對照組、苦參堿高劑量組、苦參堿低劑量組肝臟脂滴光密度分別為（4.08±0.42）、（7.09±1.59）、（5.84±0.47）、（4.15±0.94）、（4.50±0.39），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=9.888，P=0.000）。模型組較空白組增加（P＜0.05），陽性對照組、苦參堿高劑量組、苦參堿低劑量組較模型組減少（P＜0.05）。

圖2 苦參堿對酒精性肝損傷小鼠肝細胞脂質(zhì)沉積的影響 （油紅O染色×200）

3 討論

ALD 的病理機制涉及廣泛，與線粒體功能障礙、脂質(zhì)過氧化、腸源性內(nèi)毒素血癥、Kupffer 細胞活化、免疫系統(tǒng)及肝炎病毒等有關(guān)[10-11]。此外，近年來有研究表明氧化應(yīng)激反應(yīng)在酒精性肝損傷中起到重要的推動作用[12-13]?？鄥A具有多種藥理作用，臨床上主要用于治療病毒性肝炎、慢性肝纖維化以及惡性腫瘤的輔助治療[14]。柴寧莉等[15]發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿可誘導(dǎo)肝星狀細胞凋亡，減輕四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化。此外，有研究發(fā)現(xiàn)苦參堿具有抗癌作用，可下調(diào)肝癌干性基因，抑制肝癌細胞的增殖[16]。此外，苦參堿對APAP 所致的藥物性肝損傷具有保護作用[17]，但其在酒精性肝損傷中的作用仍不清楚，本實驗旨在通過體內(nèi)實驗探討苦參堿在酒精性肝損傷中的抗氧化作用。

肝臟是進行酒精代謝的主要器官，ALT 和AST作為肝細胞漿內(nèi)的兩種可溶性酶，在酒精代謝中起到重要作用。肝細胞受損后，細胞膜的通透性增加，導(dǎo)致大量可溶性酶進入血液，因此ALT 和AST 可作為肝臟損傷的敏感指標(biāo)[18]，能反映肝細胞的損傷程度。本研究中模型組小鼠的ALT、AST 和T-BIL 明顯高于空白組，提示急性肝損傷模型復(fù)制成功，而苦參堿注射液各治療組ALT、AST、T-BIL較模型組明顯下降，且隨著劑量因素比重的增大，抑制作用更明顯。說明苦參堿注射液預(yù)處理能穩(wěn)定肝細胞膜，抑制因肝細胞破裂、壞死而引起的血清轉(zhuǎn)氨酶升高，保護肝細胞免于大量酒精攝入引起的損傷。

肝臟內(nèi)TG 的積累是機體對乙醇消耗的重要反應(yīng)之一，也是肝臟脂肪變性的重要特征。與空白組相比，模型組TG 水平升高，苦參堿預(yù)處理可降低肝臟中TG 水平，且隨著劑量因素比重的增加，抑制作用更明顯。油紅O 是一種偶氮染料，可特異性的與組織中的TG 等中性脂肪結(jié)合呈小脂滴狀并著色，組織內(nèi)的脂滴呈橘紅色[19]。本研究油紅O 染色結(jié)果顯示經(jīng)苦參堿預(yù)處理后，小鼠肝組織中的脂滴較模型組下降，表明苦參堿可有效抑制酒精引起的小鼠肝臟脂質(zhì)代謝紊亂，抑制肝臟中脂肪過度沉積，減少脂質(zhì)過氧化損傷。

氧化應(yīng)激指機體產(chǎn)生大量自由基，造成體內(nèi)多種分子的氧化或硝化損傷，降低清除自由基的能力，損傷脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及DNA[20]。過量的ROS 可激活肝細胞脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致MDA 和其他脂質(zhì)過氧化物大量生成，這可能破壞細胞膜，導(dǎo)致細胞的腫脹和壞死[9]。MDA 作為不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)生成的終末產(chǎn)物之一，可破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，其水平可反映自由基產(chǎn)生的強度，體現(xiàn)機體損傷的程度[21]。模型組小鼠肝組織勻漿中MDA 顯著增加，表明其肝臟脂質(zhì)過氧化受損嚴重，而苦參堿可拮抗酒精攝入引起的氧化損傷。SOD、GSH、CAT 是體內(nèi)重要的抗氧化酶和非酶抗氧化劑，可直接或間接清除氧自由基，及時修復(fù)受損細胞[22]。與模型組比較，苦參堿高劑量組的SOD、GSH、CAT 水平明顯提高，表明苦參堿可提高機體抗氧化能力，清除自由基，改善肝損傷。