皮佳婷,劉冬敏,王建輝,牟鳴薇,方芳,寧?kù)o恒,張永生
(長(zhǎng)沙理工大學(xué) 化學(xué)與食品工程學(xué)院, 湖南 長(zhǎng)沙,410114)
泡菜在中國(guó)已擁有3 000多年的歷史[1],是中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜食品,其富含有機(jī)酸、維生素、膳食纖維等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),通常作為配菜或開(kāi)胃菜[2]。隨著富氮化肥在農(nóng)業(yè)中的廣泛應(yīng)用,新鮮蔬菜從土壤中吸收大量的氮肥并將其轉(zhuǎn)化為硝酸鹽,而硝酸鹽被蔬菜表面附著的微生物或蔬菜固有的硝酸還原酶還原成亞硝酸鹽,造成亞硝酸鹽的積累[3]。由于原料、工藝差異,不同泡菜中的亞硝酸鹽含量可能存在很大差異[4]。
亞硝酸鹽具有很強(qiáng)的氧化能力,短時(shí)間內(nèi)過(guò)量攝入會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)血紅蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,引起中毒,甚至影響人體血液系統(tǒng),干擾維生素A的吸收,從而引發(fā)維生素A缺乏癥[4]。如何降低泡菜中亞硝酸鹽的含量已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的關(guān)切點(diǎn)。本文擬重點(diǎn)分析與探討乳酸菌降解亞硝酸鹽的機(jī)制與影響因素,歸納總結(jié)現(xiàn)有降低泡菜中亞硝酸鹽含量的方法,并對(duì)乳酸菌在泡菜中的應(yīng)用進(jìn)行展望。
乳酸菌對(duì)亞硝酸鹽的降解機(jī)制已引起研究學(xué)者們的廣大關(guān)注。相較于自然發(fā)酵,接種魏斯氏菌KACC 15510的發(fā)酵泡菜,其“亞硝峰”峰值降低,且發(fā)酵蔬菜的口感與風(fēng)味明顯提高[5]。張慶芳等[6]研究認(rèn)為乳酸菌降解亞硝酸鹽有2個(gè)階段,即產(chǎn)酸降解與產(chǎn)降解。發(fā)酵前期pH>4.0時(shí),以乳酸菌產(chǎn)亞硝酸鹽還原酶降解為主;發(fā)酵后期pH<4.0時(shí),以乳酸菌產(chǎn)乳酸降解為主,并且此時(shí)發(fā)酵環(huán)境中pH較低,不利于產(chǎn)亞硝酸鹽的微生物生長(zhǎng),從而抑制亞硝酸鹽的生成。同時(shí),LIU等[7]研究發(fā)現(xiàn),糞腸球菌Y31產(chǎn)生的細(xì)菌素Y3可促進(jìn)乳酸菌菌群增殖,使亞硝酸鹽含量維持在較低水平。迄今為止,關(guān)于乳酸菌降解亞硝酸鹽機(jī)制的研究主要集中于產(chǎn)酸、產(chǎn)酶和產(chǎn)乳酸菌素降解3個(gè)方向,如圖1所示。
圖1 乳酸菌降解亞硝酸鹽的可能機(jī)制Fig.1 The possible degradation mechanism of nitrite by lactic acid bacteria in pickled vegetables
部分乳酸菌在代謝過(guò)程中除會(huì)產(chǎn)生有機(jī)酸和亞硝酸鹽還原酶外,同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生具有抑制其他微生物生長(zhǎng)的乳酸菌素。乳酸菌素是一類由乳酸菌核糖體產(chǎn)生并分泌到胞外的抗菌肽,能抑制亞硝酸鹽的生成[7]。FANG等[13]從自然發(fā)酵的食品中分離得到4株具有抗菌活性的乳酸菌,其中棒狀乳桿菌BBE-H3降低亞硝酸鹽含量的能力最強(qiáng),該菌株能產(chǎn)生針對(duì)絲狀霉菌和酵母菌的蛋白類抗菌化合物,抑制其他產(chǎn)亞硝酸鹽菌株的生長(zhǎng),從而抑制硝酸鹽還原成亞硝酸鹽。接種糞腸球菌Y31發(fā)酵生產(chǎn)泡菜過(guò)程中產(chǎn)生的細(xì)菌素Y3可有效控制泡菜中致腐和病原微生物的生長(zhǎng),促進(jìn)乳酸菌菌群增殖,減少雜菌數(shù)量,加快發(fā)酵速度,使發(fā)酵液中亞硝酸鹽含量維持在較低水平。因此,糞腸球菌Y31不僅可有效控制泡菜的腐敗,還可降低亞硝酸鹽含量[7]。
泡菜制作過(guò)程中不同的發(fā)酵原料、溫度、pH、時(shí)間、食鹽濃度以及發(fā)酵罐的材質(zhì)等均會(huì)影響體系中微生物尤其是乳酸菌的生長(zhǎng),最終影響泡菜中亞硝酸鹽的含量。不同發(fā)酵條件下泡菜的生產(chǎn)及亞硝酸鹽的降解情況如表1所示。
表1 不同發(fā)酵條件與發(fā)酵方式對(duì)泡菜亞硝酸鹽變化的影響Table 1 Effects of different fermentation conditions and methods on nitrite change in pickled vegetables
發(fā)酵開(kāi)始前體系中原料及添加物會(huì)影響蔬菜發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽的含量。DING等[14]測(cè)定了美國(guó)北卡羅納州市場(chǎng)上46種不同原料泡菜的亞硝酸鹽含量,發(fā)現(xiàn)其主要存在于腌制青豆(1 mg/kg)、腌制卷心菜(2 mg/kg)、腌制甜菜(6 mg/kg)和腌制蘑菇(2 mg/kg)4種酸化泡菜與希臘橄欖菜(3 mg/kg)和韓國(guó)大白菜(14 mg/kg)2種發(fā)酵泡菜中。黃潤(rùn)秋等[15]研究發(fā)現(xiàn),嫩姜硝酸鹽含量達(dá)2 250 mg/kg,萵筍和蘿卜含量為1 110 mg/kg,將以上單原料制成泡菜,蘿卜的“亞硝峰”出現(xiàn)在第1天(30 mg/kg),萵筍的“亞硝峰”出現(xiàn)在第2天(22 mg/kg),嫩姜泡菜在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽含量均低于20 mg/kg;相關(guān)性分析表明,亞硝酸鹽的積累與原料中硝酸鹽的含量呈正相關(guān)(r=0.82),而嫩姜中硝酸鹽含量很高卻未出現(xiàn)亞硝酸鹽積累,究其原因可能與嫩姜中含有生姜精油、姜辣素等抑菌物質(zhì)有關(guān)。泡菜使用的原料種類是導(dǎo)致亞硝酸鹽含量差異的主要影響因素。不同蔬菜組合在自然發(fā)酵過(guò)程中 “亞硝峰”的變化范圍為12~60 mg/kg,蔬菜組合越多,“亞硝峰”峰值越低,大白菜、豇豆、白蘿卜、胡蘿卜與黃瓜的組合“亞硝峰”峰值最低,僅為13 mg/kg[16]。
泡菜在發(fā)酵過(guò)程中容易產(chǎn)生亞硝酸鹽,控制其發(fā)酵條件(發(fā)酵溫度、pH值、發(fā)酵時(shí)間與食鹽濃度等)可明顯減緩亞硝酸鹽的生成。乳酸菌的最適溫度為30~40 ℃,最適pH為5.5~6.5,因此,發(fā)酵溫度和pH都會(huì)影響乳酸菌降解亞硝酸鹽的能力。WANG等[17]研究發(fā)現(xiàn),在一定范圍內(nèi)提高發(fā)酵溫度,有利于泡菜快速產(chǎn)酸并縮短成熟期,在發(fā)酵第1天,溫度為25、35 ℃的實(shí)驗(yàn)組pH值下降至3.5左右,而溫度為10、15 ℃的實(shí)驗(yàn)組到達(dá)相同pH則需要15~20 d。相較于自然發(fā)酵,在發(fā)酵第7天,-1 ℃條件下3種乳酸菌(清酒乳桿菌、彎曲乳桿菌、短乳桿菌)的亞硝鹽降解率分別為87.9%、66.0%、57.1%,而15 ℃培養(yǎng)條件下3種乳酸菌的亞硝酸鹽降解率均接近100%[18]。
除此之外,在發(fā)酵過(guò)程中,鹽濃度對(duì)乳酸菌降解亞硝酸鹽的能力也有很大影響。YANG等[19]將植物乳桿菌HBUAS 51041和腸系膜明串珠菌ORC 2以1∶1的比例接種至鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.5%、1.5%、2.5%、3.5%的大白菜中,發(fā)現(xiàn)“亞硝峰”均出現(xiàn)在第3天,其中鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的泡菜中亞硝酸含量最高(2.0~2.5 mg/kg),其次是鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.5%的泡菜(1.0~1.5 mg/kg),這可能是由于鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的泡菜中存在腐敗菌,而鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.5% 的泡菜中乳酸菌的生長(zhǎng)受到抑制;因此,當(dāng)發(fā)酵期延長(zhǎng)至第30天,鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的泡菜中亞硝酸鹽含量反而最低(0.29 mg/kg)。李軍波[20]對(duì)3種鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)(2%、5%、8%)發(fā)酵的泡菜進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的泡菜中乳酸菌繁殖代謝最快,亞硝酸鹽含量降低最快,而鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的泡菜中乳酸菌繁殖代謝最慢,亞硝酸鹽含量降低最慢,泡菜成熟所需時(shí)間最長(zhǎng)。
泡菜在自制或工業(yè)化生產(chǎn)中所用容器類型的不同對(duì)泡菜中亞硝酸鹽含量的影響較大。LIU等[21]研究發(fā)現(xiàn),在密封發(fā)酵第31天,塑料罐和陶瓷罐中發(fā)酵的四川泡菜亞硝酸鹽含量較高,分別為2.50、2.35 mg/kg;而玻璃罐中四川泡菜的亞硝酸鹽含量最低,僅為1.90 mg/kg。
泡菜生產(chǎn)過(guò)程中降低亞硝酸鹽含量的方法一般可分為3類:物理降解法、化學(xué)降解法和生物降解法。圖2展示了不同方法降低泡菜中亞硝酸鹽含量的途徑。
圖2 降低泡菜中亞硝酸鹽含量的方法途徑Fig.2 Methods for nitrite reduce in pickled vegetables
物理降解法主要是對(duì)泡菜原料進(jìn)行前處理,包括低溫冷藏、高溫處理等,通過(guò)降低原料中硝酸鹽含量、抑制亞硝酸鹽產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)以及降低硝酸鹽還原酶活性等方式,最終降低泡菜產(chǎn)品中的亞硝酸鹽含量。
3.1.1 低溫冷藏
低溫冷藏能降低蔬菜中固有的硝酸還原酶活性,抑制亞硝酸鹽的積累。尹豐等[32]通過(guò)對(duì)比12種蔬菜在低溫冷藏和常溫貯藏下亞硝酸鹽含量的變化發(fā)現(xiàn),低溫貯藏可延遲“亞硝峰”的出現(xiàn),但低溫會(huì)破壞蔬菜細(xì)胞結(jié)構(gòu),使發(fā)酵后的泡菜風(fēng)味和口感變差。徐斌等[33]檢測(cè)了9種山野菜冷凍干燥后亞硝酸鹽含量的變化發(fā)現(xiàn),凍干后的山野菜中亞硝酸鹽含量均遠(yuǎn)低于室溫貯存的山野菜中亞硝酸鹽含量。
3.1.2 高溫處理
高溫處理如漂燙處理既可抑制蔬菜中硝酸還原酶的活性,亦可殺死部分附著在蔬菜表面的硝酸還原菌,從而抑制發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽的形成,亞硝酸鹽含量隨漂燙時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低[34]。MENARD等[34]研究發(fā)現(xiàn)漂燙處理可降低蔬菜中近75%的亞硝酸鹽含量。
3.2.1 添加抗氧化劑
抗壞血酸(維生素C)、抗壞血酸鈉和異抗壞血酸鈉等抗氧化劑可將亞硝酸鹽還原成NO,從而降低亞硝酸鹽含量。在原料中加入0.5‰的維生素C能將香菇泡菜中亞硝酸鹽含量從6.16 mg/kg降低至3.11 mg/kg[35]。在泡菜中加入維生素C可降低泡菜發(fā)酵過(guò)程中的“亞硝峰”峰值,發(fā)酵第9天時(shí),維生素C組亞硝酸鹽含量為5.47 mg/kg,而對(duì)照組達(dá)10.34 mg/kg[36]。
3.2.2 添加有機(jī)酸
3.2.3 添加發(fā)酵輔料
發(fā)酵輔料是指泡菜在發(fā)酵過(guò)程中為了提升風(fēng)味而添加的調(diào)味料,部分發(fā)酵輔料具有一定的降低亞硝酸鹽含量的能力,如大蒜、大蔥、姜、糖以及花椒等。泡菜中添加天然香辛料辣椒、花椒、大蒜和生姜對(duì)有害菌的抑制效果依次為辣椒>大蒜>生姜>花椒,將4種香辛料以最優(yōu)配比(辣椒0.36 g/L、大蒜0.8 g/L、花椒0.18 g/L、生姜0.6 g/L)投入泡菜中,發(fā)酵第7天時(shí),亞硝酸鹽含量降低了90%[39]。除可通過(guò)抑制有害菌的生長(zhǎng)而減緩亞硝酸鹽的生成外,大蒜中所含巰基化合物亦可與亞硝酸鹽結(jié)合生成酯類化合物[40],從而降低泡菜中亞硝酸鹽含量。
3.2.4 添加天然成分
一些天然成分因具有較強(qiáng)的還原能力,可與亞硝酸鹽發(fā)生反應(yīng),從而達(dá)到降低亞硝酸鹽含量的效果,將蓮房原花青素提取物、玫瑰多酚、綠茶提取物等加入泡菜中還能豐富泡菜風(fēng)味[41]。在泡菜中添加9%的藍(lán)莓酒渣后,其亞硝酸鹽含量比空白對(duì)照組低62.20%,可顯著降低泡菜中亞硝酸鹽與生物胺的含量[42]。而在700 g四川泡菜中加入60 g枸杞,不僅可增加泡菜的總酸含量和抗氧化能力,還可降低泡菜中亞硝酸鹽含量并改善泡菜感官品質(zhì)[43]。
3.3.1 亞硝酸鹽還原酶降解法
3.3.2 微生物降解法
發(fā)酵乳桿菌、植物乳桿菌、腸膜明串珠菌等乳酸菌均具有良好的亞硝酸鹽清除作用。比較我國(guó)不同區(qū)域泡菜中的細(xì)菌組成發(fā)現(xiàn),亞硝酸鹽還原菌屬包括乳酸菌(73.37%)、片球菌(0.93%)、不動(dòng)桿菌(0.74%)、白串珠菌(0.31%)等,其中乳酸菌為優(yōu)勢(shì)菌屬,與亞硝酸鹽含量呈顯著負(fù)相關(guān)[45]。XIA等[22]從自然發(fā)酵的泡菜中提取得到了對(duì)亞硝酸鹽具有較高耐受性的乳酸菌菌株AR123,并將其重新應(yīng)用于泡菜發(fā)酵中,相較于自然發(fā)酵,接種發(fā)酵泡菜的亞硝酸含量由17.92 mg/kg顯著降低至0.83 mg/kg。
3.3.3 接種噬菌體降解法
近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),噬菌體可控制食品中腐敗菌和致病菌的生長(zhǎng),其同樣可能對(duì)泡菜中亞硝酸鹽的降解具有一定潛力。ZHENG等[46]研究表明,泡黃瓜中產(chǎn)生亞硝酸鹽的優(yōu)勢(shì)菌群是嗜中溫需氧細(xì)菌,在泡菜中同時(shí)接種嗜中溫需氧細(xì)菌的特異性噬菌體和乳酸菌進(jìn)行混合發(fā)酵,能在泡菜發(fā)酵前期降低亞硝酸鹽含量。
泡菜雖可通過(guò)加入鹽溶液發(fā)酵制作,但目前更多是使用鹵水發(fā)酵進(jìn)行制作。鹵水發(fā)酵制作泡菜高度依賴原料中自身攜帶的乳酸菌,如腸系膜明串珠菌、植物乳桿菌、糞腸球菌等。陳壇鹵水是指循環(huán)使用多次的泡菜鹵水,重復(fù)使用的鹵水具有啟動(dòng)發(fā)酵快、乳酸菌大量積累、減少有害微生物滋生等特點(diǎn)。泡菜中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(如碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪)能被乳酸菌轉(zhuǎn)化為各種有機(jī)酸、氨基酸、醇、酯和酮等,從而形成泡菜的獨(dú)特風(fēng)味。CHEN等[47]研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)過(guò)第4輪發(fā)酵,蘿卜泡菜成熟時(shí)的微生物菌群、有機(jī)酸、游離氨基酸和揮發(fā)性成分含量等與鹵水基本一致,并且還能將發(fā)酵時(shí)間從6 d減少至1~2 d,顯著縮短發(fā)酵時(shí)間。但由于自然發(fā)酵生產(chǎn)的泡菜受環(huán)境因素(生產(chǎn)季節(jié)、操作衛(wèi)生條件等)影響較大,導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性差,為抑制雜菌生長(zhǎng)并且獲得安全優(yōu)質(zhì)的泡菜產(chǎn)品,接種發(fā)酵泡菜越來(lái)越受到關(guān)注。
接種發(fā)酵是將標(biāo)準(zhǔn)菌種接種于蔬菜上進(jìn)行發(fā)酵的方式。20世紀(jì)60年代起,泡菜生產(chǎn)中開(kāi)始應(yīng)用接種發(fā)酵。一些具有優(yōu)良特性的優(yōu)勢(shì)乳酸菌種類,如腸系膜明串珠菌,乳酸乳球菌、檸檬酸乳桿菌和植物乳桿菌等是可有效提高泡菜質(zhì)量的發(fā)酵劑[48]。乳酸菌純種發(fā)酵、乳酸菌與商業(yè)發(fā)酵劑混合接種發(fā)酵均可迅速降低泡菜中的pH值和亞硝酸鹽含量;泡菜純種發(fā)酵和混合接種發(fā)酵72 h后亞硝酸鹽含量(1.00、0.88 mg/kg)顯著低于自然發(fā)酵(17.92 mg/kg)[22],純種發(fā)酵與混合接種發(fā)酵能更為有效的降低亞硝酸鹽含量,增強(qiáng)泡菜的感官特性,同時(shí)縮短泡菜的發(fā)酵時(shí)間。XIANG等[31]研究表明,植物乳酸桿菌與魏斯氏菌混合接種發(fā)酵可使四川泡菜中亞硝酸還原酶的表達(dá)比自然發(fā)酵高2倍,使亞硝酸鹽降解速度更快,并顯著提升泡菜的風(fēng)味。腸系膜明串珠菌、短乳桿菌與魏斯氏菌混合接種發(fā)酵的四川泡菜“亞硝峰”峰值比自然發(fā)酵更低,且由于產(chǎn)酸時(shí)間較早,泡菜中乳酸、甘露醇、鮮味與甜味氨基酸含量提高,總酸含量降低,泡菜的感官品質(zhì)得到大幅提升[25]。接種從泡菜中分離得到的巨大芽孢桿菌L222能使泡菜中醇類物質(zhì)含量維持在較高水平,促進(jìn)酯類物質(zhì)合成,抑制硫化物的生成以及致病菌的生長(zhǎng),從而提高泡菜發(fā)酵的整體質(zhì)量[28]。將植物乳桿菌LV02與小扁豆乳酸桿菌LV73進(jìn)行混合接種發(fā)酵,泡菜中嗜溫微生物和乳酸菌總數(shù)比自然發(fā)酵更占優(yōu)勢(shì),從而使泡菜穩(wěn)定性大幅提高,發(fā)酵周期大大縮短,為泡菜的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供了理論基礎(chǔ)[29]。
由于接種發(fā)酵的工藝流程較為繁瑣、操作要求較高,因此采用操作簡(jiǎn)便的直投式發(fā)酵劑發(fā)酵為蔬菜發(fā)酵研究提供了新的思路。直投式發(fā)酵劑是指將高濃度的發(fā)酵菌種冷凍干燥后,制成方便運(yùn)輸貯藏、無(wú)需活化等預(yù)處理、可直接加入原料中進(jìn)行發(fā)酵的發(fā)酵劑。將直投式發(fā)酵劑用于發(fā)酵蔬菜的生產(chǎn),可節(jié)省人力、空間、資源和時(shí)間,不僅可使生產(chǎn)專業(yè)化、規(guī)范化和統(tǒng)一化,還可提高產(chǎn)品質(zhì)量,保障消費(fèi)者健康。利用直投式乳酸菌凍干粉對(duì)青菜進(jìn)行發(fā)酵,當(dāng)接種量為0.05%、鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%,發(fā)酵溫度為33.9 ℃、加糖量為1.74%、發(fā)酵時(shí)間為91.5 h時(shí),泡菜中亞硝酸鹽含量最低(2.54 mg/kg),且相較于自然發(fā)酵其泡菜口感更好[49];在草菇發(fā)酵中投入植物乳桿菌dy-1直投式發(fā)酵劑,同時(shí)以草菇的脆度與色差進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化,研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)添加檸檬酸2 g/L、CaCl26 g/L、鹽10 g/L、燙漂時(shí)間為9 min時(shí),泡菜發(fā)酵品質(zhì)最佳,相較于自然發(fā)酵,其亞硝酸鹽含量下降更顯著,發(fā)酵時(shí)間更短,感官品質(zhì)更高[50]。
利用乳酸菌降解泡菜中的亞硝酸鹽具有安全、高效等特點(diǎn)。但目前利用乳酸菌降解亞硝酸鹽的研究尚處于初級(jí)階段,主要還是集中在對(duì)產(chǎn)酸、產(chǎn)酶或產(chǎn)乳酸菌素的乳酸菌菌株進(jìn)行篩選與純化,然后將其應(yīng)用于蔬菜發(fā)酵過(guò)程中,而對(duì)乳酸菌菌種改良并進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)的相關(guān)研究不多,對(duì)乳酸菌降解亞硝酸鹽的分子機(jī)制知之甚少。采用乳酸菌接種發(fā)酵可有效降低泡菜中亞硝酸鹽含量并大幅縮短泡菜發(fā)酵周期,但當(dāng)前大部分尚處于實(shí)驗(yàn)室研究階段,鮮有工業(yè)化的實(shí)際應(yīng)用,因此,還需進(jìn)一步完善接種發(fā)酵的質(zhì)量與安全管理體系,從而為工業(yè)化生產(chǎn)安全、營(yíng)養(yǎng)、美味的泡菜提供解決方案。