基于開(kāi)源和節(jié)流兩種策略的耐高滲畢赤酵母菌株的構(gòu)建

趙天宇，王榮斌，王鵬程，白仲虎，楊艷坤

(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫，214122)

巴斯德畢赤酵母(Komagataellaphaffii)是一種甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母，其特有的醇氧化酶1(alcohol oxidase 1，Aox1)可以代謝甲醇，使其能在甲醇為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)[1]。畢赤酵母具有可嚴(yán)緊調(diào)控，可高密度發(fā)酵，可翻譯后修飾等諸多優(yōu)點(diǎn)，因而被開(kāi)發(fā)為現(xiàn)在應(yīng)用最為廣泛的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一。至今已有抗菌肽[2]，病毒樣顆粒[3]，牛胃溶菌酶[4]，普魯蘭酶[5]等多種外源蛋白成功在畢赤酵母中表達(dá)。但畢赤酵母對(duì)滲透壓脅迫的抵抗力較弱，一定程度上影響了其在工業(yè)上的應(yīng)用。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路是真核細(xì)胞中高度保守的響應(yīng)外界環(huán)境刺激的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。釀酒酵母中含有5種MAPK信號(hào)通路[6]，其中高滲甘油信號(hào)通路(high osmolarity glycerol pathway, HOG pathway)可以響應(yīng)多種刺激[7]，如高滲透壓休克、亞砷酸鹽、醋酸、冷休克和熱休克等，是酵母響應(yīng)外界滲透壓變化的重要信號(hào)傳導(dǎo)途徑。HOG信號(hào)通路在響應(yīng)高滲透壓休克時(shí)，會(huì)通過(guò)SLN1和SHO1 2個(gè)上游信號(hào)分支激活MAPKK Pbs2[8]，Pbs2再進(jìn)一步激活Hog1[9]，最終引發(fā)一系列下游基因的表達(dá)變化，達(dá)到在高滲條件下存活的結(jié)果。已有分析表明，約88%的Hog1依賴性基因的表達(dá)需要下游的Hot1、Msn2/4和Sko1 3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子及其組合[10]。在這一過(guò)程中，Hog1作為唯一的MAPK發(fā)揮著最關(guān)鍵的作用，從接收信號(hào)到作為激酶向下游傳導(dǎo)信號(hào)[11]及作為轉(zhuǎn)錄因子直接或間接地調(diào)控下游基因表達(dá)[10]都不可或缺。

然而，前期研究發(fā)現(xiàn)，畢赤酵母雖然也有同源的HOG信號(hào)通路，但與釀酒酵母有不少區(qū)別，例如GT1(glycerol transporter 1)[12]的高滲誘導(dǎo)程度遠(yuǎn)低于釀酒酵母中的同源基因STL1(sugar transporter-like protein 1)[13]的誘導(dǎo)程度，重要的甘油合成基因GPD1[14-15]表達(dá)反而受阻遏等[16]。上述區(qū)別使得畢赤酵母的高滲抗性弱于釀酒酵母?；诖?，我們進(jìn)行了相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組分析(未發(fā)表結(jié)果)，發(fā)現(xiàn)在高滲條件下，畢赤酵母中的甘油通道蛋白基因FPS1，甘油代謝第一步的甘油激酶基因GUT1等的表達(dá)顯著上調(diào)，與釀酒酵母中的情況相反。這些結(jié)果以及胞內(nèi)甘油含量的測(cè)定[16]讓我們確信，畢赤酵母無(wú)法依靠積累胞內(nèi)甘油來(lái)抵抗高滲環(huán)境。

本研究中總結(jié)歸納了前期實(shí)驗(yàn)的結(jié)論，利用2種策略來(lái)增強(qiáng)畢赤酵母的高滲抗性——開(kāi)源和節(jié)流。一方面，通過(guò)嘗試引入釀酒酵母的甘油合成基因ScGPD1、ScGPP2來(lái)增強(qiáng)畢赤酵母合成胞內(nèi)甘油的能力，此為開(kāi)源策略。另一方面，將不利于胞內(nèi)甘油積累的FPS1、GUT1進(jìn)行敲除來(lái)減少胞內(nèi)甘油的外排和代謝，此為節(jié)流策略。進(jìn)而綜合2種改造策略，來(lái)共同提升畢赤酵母的高滲抗性。通過(guò)對(duì)比3種類型的構(gòu)建菌株，我們發(fā)現(xiàn)了畢赤酵母無(wú)法通過(guò)積累胞內(nèi)甘油來(lái)抵抗高滲的主要原因。鑒于Hog1是導(dǎo)致上述基因(除GPD1外)表達(dá)異于釀酒酵母的源頭，對(duì)HOG1進(jìn)行敲除后，發(fā)現(xiàn)了Hog1所具有的2種不同的作用。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

本研究所用菌株見(jiàn)表1。

表1 本研究所用菌株Table 1 Strains used in this study

本研究所用質(zhì)粒見(jiàn)表2。

表2 本研究所用質(zhì)粒Table 2 Plasmids used in this study

1.2 引物

本研究所用引物見(jiàn)表3。

表3 本研究所用引物Table 3 Primers used in this study

1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 5。LLB培養(yǎng)基(g/L)(適用于添加博來(lái)霉素)：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 2.5。YPD培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨20, 酵母提取物10，葡萄糖20。固體培養(yǎng)基在相應(yīng)液體培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂粉。

1.4 菌株的構(gòu)建

fps1Δ菌株的構(gòu)建：通過(guò)本實(shí)驗(yàn)室改良的CRISPER/Cas9基因編輯系統(tǒng)(未發(fā)表研究)進(jìn)行各基因的無(wú)痕敲除。gut1Δ菌株和hog1ΔA、hog1ΔB菌株的構(gòu)建：參考fps1Δ菌株的構(gòu)建。fps1Δgut1Δ菌株的構(gòu)建：在fps1Δ菌株的基礎(chǔ)上進(jìn)行GUT1的敲除。hog1olΔ菌株的構(gòu)建：電轉(zhuǎn)HOG1敲除用的sg質(zhì)粒的同時(shí)電轉(zhuǎn)有且僅有基因組上HOG1編碼區(qū)上下游1 000 bp同源臂(overlap)的片段，實(shí)現(xiàn)整段編碼序列的敲除。

fps1ΔPHSP12-ScGPD1菌株的構(gòu)建：將前期研究構(gòu)建并保藏的pGPHD(pGAPZB-PHSP12-ScGPD1)質(zhì)粒用Lin-F和Lin-R引物通過(guò)環(huán)形PCR的方式線性化，電轉(zhuǎn)至fps1Δ菌株中。fps1ΔPHSP12-ScGPP2菌株的構(gòu)建：將前期研究構(gòu)建并保藏的pGPHP(pGAPKB-PHSP12-ScGPP2)質(zhì)粒用Lin-F和Lin-R引物通過(guò)環(huán)形PCR的方式線性化，電轉(zhuǎn)至fps1Δ菌株中。fps1ΔPHSP12-ScGPD1/ScGPP2菌株的構(gòu)建：線性化的pGPHD和pGPHP質(zhì)粒同時(shí)電轉(zhuǎn)至fps1Δ菌株中。其余雙策略菌株的構(gòu)建方法參考上述方法，均為在相應(yīng)缺陷型宿主中電轉(zhuǎn)對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒。

1.5 培養(yǎng)方法

大腸桿菌的培養(yǎng)方法：液體培養(yǎng)條件37 ℃，220 r/min；平板培養(yǎng)條件37 ℃靜置。畢赤酵母的培養(yǎng)方法：液體培養(yǎng)條件30 ℃，220 r/min；平板培養(yǎng)條件30 ℃靜置。含pGPHD的菌株，采用博來(lái)霉素進(jìn)行篩選，質(zhì)量濃度為大腸桿菌25 μg/mL，畢赤酵母100 μg/mL。含pGPHP的菌株，大腸桿菌采用卡那霉素進(jìn)行篩選，質(zhì)量濃度為25 μg/mL，畢赤酵母采用G418進(jìn)行篩選，質(zhì)量濃度為200 μg/mL。同時(shí)含有pGPHD和pGPHP的畢赤酵母菌株，采用博來(lái)霉素和G418雙抗生素篩選，濃度同上。

1.6 平板生長(zhǎng)檢測(cè)

將酵母細(xì)胞接種至YPD液體培養(yǎng)基中，過(guò)夜活化。然后以初始OD600=0.2接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，并在細(xì)胞生長(zhǎng)至OD600=1.0左右時(shí)收集2 mL細(xì)胞懸液，離心棄上清液后，將細(xì)胞用PBS洗滌2次，并將細(xì)胞密度精確地校準(zhǔn)在OD600=1.0。然后將2 μL的按10倍梯度稀釋的細(xì)胞懸液接種到不同鹽濃度的YPD平板上。培養(yǎng)2～3 d后，觀察生長(zhǎng)情況。

1.7 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將酵母細(xì)胞接種至YPD液體培養(yǎng)基中，過(guò)夜活化。然后以初始OD600=0.1接種到含0.5 mol/L NaCl的YPD培養(yǎng)基中。分別在3、6、9、12、24、36、48、60 h測(cè)定OD600。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的構(gòu)建

fps1Δ，gut1Δ和fps1Δgut1Δ菌株使用本實(shí)驗(yàn)室改良的CRISPER/Cas9基因編輯系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。構(gòu)建結(jié)果采用PCR擴(kuò)增基因組上相對(duì)應(yīng)的序列，送至蘇州金唯智有限公司進(jìn)行測(cè)序來(lái)驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果如圖1所示。fps1Δ，gut1Δ和fps1Δgut1Δ菌株分別發(fā)生了移碼突變。

圖1 fps1Δ，gut1Δ和fps1Δ gut1Δ菌株的測(cè)序結(jié)果Fig.1 The sequencing results of fps1Δ，gut1Δ and fps1Δ gut1Δ strains注：序號(hào)代表堿基所在基因上的位置(下同)

前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)HSP12在高滲條件下誘導(dǎo)表達(dá)程度非常高，因此采用其啟動(dòng)子PHSP12來(lái)啟動(dòng)表達(dá)ScGPD1和ScGPP2。雙策略菌株為在上述各敲除菌株的基礎(chǔ)上進(jìn)行外源蛋白表達(dá)，采用WB驗(yàn)證，結(jié)果如圖2所示。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)及已發(fā)表報(bào)道[17]，我們推測(cè)上述基因的RNA表達(dá)水平在10～45 min達(dá)到峰值，蛋白表達(dá)水平在60～90 min達(dá)到峰值，因此我們分別檢測(cè)了60、90 min時(shí)的蛋白表達(dá)。

圖2 雙策略菌株的WB結(jié)果Fig.2 The WB results of dual-strategy strains注：序號(hào)下劃線菌株將用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)(下同)

hog1ΔA和hog1ΔB菌株的構(gòu)建采用PCR擴(kuò)增基因組上相對(duì)應(yīng)的序列，送至蘇州金唯智有限公司進(jìn)行測(cè)序來(lái)驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果如圖3-a所示。hog1olΔ菌株的構(gòu)建采用PCR擴(kuò)增基因組上相對(duì)應(yīng)的位置，根據(jù)條帶大小來(lái)驗(yàn)證，結(jié)果如圖3-b所示。

a-hog1Δ A，hog1Δ B菌株的測(cè)序結(jié)果;b-hog1olΔ菌株的基因組PCR結(jié)果圖3 hog1Δ A，hog1Δ B和hog1olΔ菌株的構(gòu)建結(jié)果Fig.3 The construction result of hog1Δ A，hog1Δ B and hog1olΔ strains

2.2 PHSP12-ScGPD1, PHSP12-ScGPP2和PHSP12-ScGPD1/ScGPP2菌株的生長(zhǎng)表型檢測(cè)

釀酒酵母在高滲環(huán)境中存活所依賴的重要方式之一為積累胞內(nèi)甘油，此過(guò)程中起關(guān)鍵作用的基因?yàn)镾cGPD1和ScGPP2[17]。為了通過(guò)增強(qiáng)畢赤酵母的甘油合成能力，來(lái)積累胞內(nèi)甘油，進(jìn)而平衡外界高滲環(huán)境，我們將釀酒酵母中甘油合成途徑的關(guān)鍵酶ScGPD1，ScGPP2引入畢赤酵母。為了驗(yàn)證引入釀酒酵母的甘油合成途徑是否提高了畢赤酵母的高滲抗性，將PHSP12-ScGPD1, PHSP12-ScGPP2和PHSP12-ScGPD1/ScGPP2菌株以及畢赤酵母GS115(WT)進(jìn)行平板生長(zhǎng)表型的檢測(cè)。通過(guò)比較不同菌株在不同NaCl濃度的平板上的生長(zhǎng)狀態(tài)來(lái)鑒定外源表達(dá)的蛋白是否提高了畢赤酵母的高滲抗性。如圖4所示，在NaCl濃度為0.4 mol/L時(shí)，3株構(gòu)建菌株都表現(xiàn)出了比GS115更強(qiáng)的高滲抗性。而且，起主要作用的基因似乎是ScGPD1。

圖4 PHSP12-ScGPD1, PHSP12-ScGPP2和PHSP12-ScGPD1/ScGPP2菌株的平板生長(zhǎng)狀況(3 d)Fig.4 Growth status of PHSP12-ScGPD1, PHSP12-ScGPP2 and PHSP12-ScGPD1/ScGPP2 strains on plate (3 d)

鑒于PHSP12-ScGPD1, PHSP12-ScGPP2和PHSP12-ScGPD1/ScGPP2菌株和GS115菌株在中等NaCl濃度下體現(xiàn)出了較大的差別，我們測(cè)定了它們?cè)?.5 mol/L NaCl濃度下的生長(zhǎng)曲線，以進(jìn)一步驗(yàn)證構(gòu)建菌株的高滲抗性。如圖5所示，在高滲條件下，PHSP12-ScGPD1/ScGPP2菌株在12～24 h體現(xiàn)出了最快的生長(zhǎng)速率，然而在正常滲透壓下，其生長(zhǎng)卻是最慢的。作為對(duì)比，GS115則在2種滲透壓情況下分別表現(xiàn)出了相反的表型。在后期PHSP12-ScGPD1/ScGPP2菌株的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)變得不明顯，可能是因?yàn)楦邼B環(huán)境由于菌體緩慢的滲透壓平衡機(jī)制、吸收利用等因素而不再對(duì)菌株的生長(zhǎng)造成不良影響。上述結(jié)果表明引入的ScGPD1/ScGPP2基因確實(shí)起到了增強(qiáng)宿主菌株高滲抗性的作用。

圖5 PHSP12-ScGPD1, PHSP12-ScGPP2和PHSP12-ScGPD1/ScGPP2菌株的液體培養(yǎng)基生長(zhǎng)狀況Fig.5 Growth status of PHSP12-ScGPD1, PHSP12-ScGPP2 and PHSP12-ScGPD1/ScGPP2 strains in liquid medium

2.3 fps1Δ，gut1Δ和fps1Δ gut1Δ菌株的生長(zhǎng)表型檢測(cè)

釀酒酵母在高滲環(huán)境中同時(shí)會(huì)抑制FPS1和GUT1來(lái)降低甘油外排[18]和代謝[17]。為了通過(guò)降低畢赤酵母的甘油外排和代謝，來(lái)積累胞內(nèi)甘油，進(jìn)而平衡外界高滲環(huán)境，我們敲除了畢赤酵母的FPS1，GUT1。為了驗(yàn)證敲除上述基因是否提高了畢赤酵母的高滲抗性，將構(gòu)建成功的fps1Δ，gut1Δ和fps1Δgut1Δ菌株以及畢赤酵母GS115(WT)進(jìn)行平板生長(zhǎng)表型的檢測(cè)。通過(guò)比較不同菌株在不同NaCl濃度的平板上的生長(zhǎng)狀態(tài)來(lái)鑒定敲除相應(yīng)基因是否提高了畢赤酵母的高滲抗性。如圖6所示，3株敲除菌株的高滲抗性均較大幅度地增強(qiáng)，足以耐受0.8 mol/L NaCl的高滲環(huán)境。fps1Δ菌株與gut1Δ菌株之間無(wú)明顯差異，且2個(gè)基因同時(shí)敲除無(wú)疊加效果。

圖6 fps1Δ，gut1Δ和fps1Δ gut1Δ菌株的平板生長(zhǎng)狀況(2 d)Fig.6 Growth status of fps1Δ，gut1Δ and fps1Δ gut1Δ strains on plate (2 d)

2.4 雙策略菌株的生長(zhǎng)表型檢測(cè)

為了通過(guò)綜合上述2種策略，來(lái)積累胞內(nèi)甘油，進(jìn)而平衡外界高滲環(huán)境，我們構(gòu)建了雙策略菌株。為了驗(yàn)證雙策略菌株的高滲抗性，將構(gòu)建成功的fps1ΔPHSP12-ScGPD1，fps1ΔPHSP12-ScGPP2，fps1ΔPHSP12-ScG-PD1/ScGPP2,gut1ΔPHSP12-ScGPD1，gut1ΔPHSP12-ScGPP2，gut1ΔPHSP12-ScGPD1/ScGPP2和fps1Δgut1ΔPHSP12-ScGPD1，fps1Δgut1ΔPHSP12-ScGPP2，fps1Δgut1ΔPHSP12-ScGPD1/ScGPP2菌株以及畢赤酵母GS115(WT)進(jìn)行平板生長(zhǎng)表型的檢測(cè)。通過(guò)比較不同菌株在不同NaCl濃度的平板上的生長(zhǎng)狀態(tài)來(lái)鑒定是否提高了畢赤酵母的高滲抗性。如圖7所示，所有雙策略菌株的高滲抗性相較于GS115均顯著增強(qiáng)，但雙策略菌株之間的差異并不明顯。同時(shí)雙策略菌株足以耐受0.8 mol/L NaCl的高滲。比較在0.8 mol/L的NaCl濃度下開(kāi)源策略和節(jié)流策略帶來(lái)的高滲抗性提升程度，可以發(fā)現(xiàn)節(jié)流策略效果明顯，而將雙策略菌株加入比較，可以發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)的高滲抗性主要起因?yàn)楣?jié)流策略，而開(kāi)源策略在此基礎(chǔ)上僅使得高滲抗性略有提高(0.8 mol/L NaCl第4列)。因此可以推斷，畢赤酵母無(wú)法通過(guò)積累胞內(nèi)甘油來(lái)抵抗高滲，主要是因?yàn)楦视偷耐馀藕痛x導(dǎo)致甘油難以積累，而不是合成能力不足。

圖7 雙策略菌株的平板生長(zhǎng)狀況(2 d)Fig.7 Growth status of dual-strategy strains on plate (2 d)

2.5 hog1Δ菌株的生長(zhǎng)表型檢測(cè)

我們的前期研究表明，畢赤酵母Hog1仍然參與滲透壓調(diào)控，只是調(diào)控機(jī)制不同[19]。鑒于上述與釀酒酵母相反的基因表達(dá)(除GPD1外)都是由Hog1引起的，我們嘗試敲除了HOG1。為了驗(yàn)證敲除HOG1對(duì)畢赤酵母高滲抗性的影響，將構(gòu)建成功的hog1ΔA菌株以及畢赤酵母GS115(WT)進(jìn)行平板生長(zhǎng)表型的檢測(cè)。如圖8所示，hog1ΔA菌株的高滲抗性在0.4、0.8 mol/L的NaCl濃度下強(qiáng)于GS115。這一現(xiàn)象與釀酒酵母截然相反，在釀酒酵母中，Schog1Δ菌株對(duì)高滲的耐受能力大幅降低，生長(zhǎng)狀況不如野生型。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該現(xiàn)象，我們構(gòu)建了在不同位置移碼突變的hog1ΔB菌株，和整段編碼序列敲除的hog1olΔ菌株。將構(gòu)建成功的上述菌株以及畢赤酵母GS115(WT)進(jìn)行平板生長(zhǎng)表型的檢測(cè)。

圖8 hog1Δ A，hog1Δ B，hog1olΔ和HOG1OE菌株的平板生長(zhǎng)狀況(3 d)Fig.8 Growth status of hog1Δ A，hog1Δ B，hog1olΔ and HOG1OE strains on plate (3 d)

如圖8所示，hog1ΔB菌株以及hog1olΔ菌株都表現(xiàn)出了強(qiáng)于GS115的高滲抗性，證明該現(xiàn)象是可重復(fù)的。上述結(jié)果間接證實(shí)了Hog1確實(shí)是導(dǎo)致上述基因異常表達(dá)的起因，進(jìn)一步說(shuō)明Hog1的存在對(duì)畢赤酵母的高滲抗性起到了負(fù)面作用。另外，3種hog1缺陷型菌株的高滲抗性并沒(méi)有比雙策略菌株更高，甚至稍弱于雙策略菌株(0.8 mol/L NaCl)，進(jìn)一步證明了我們前期研究的結(jié)論，即Hog1還存在著某些對(duì)高滲抗性起正面作用的調(diào)控機(jī)制，例如損傷修復(fù)[16]等。但總體而言，畢赤酵母Hog1的存在不利于畢赤酵母高滲抗性。我們進(jìn)一步構(gòu)建了HOG1過(guò)表達(dá)(over experessed,OE)菌株，來(lái)檢查過(guò)表達(dá)HOG1是否能降低畢赤酵母的高滲抗性。結(jié)果表明，HOG1OE菌株與GS115的高滲抗性無(wú)顯著區(qū)別。其原因可能為Hog1發(fā)揮功能取決于磷酸化的狀態(tài)[20]，而不是蛋白質(zhì)的數(shù)量。

3 結(jié)論與討論

HOG信號(hào)通路對(duì)于釀酒酵母在高滲環(huán)境中的存活至關(guān)重要。然而在畢赤酵母中，Hog1阻遏甘油合成基因GPD1的表達(dá)，誘導(dǎo)甘油外排通道蛋白基因FPS1、甘油代謝基因GUT1的表達(dá)，反而不利于胞內(nèi)甘油的積累，進(jìn)而不利于畢赤酵母在高滲環(huán)境中的存活。

本研究通過(guò)引入外源甘油合成基因ScGPD1，ScGPP2，敲除不利于甘油積累的基因FPS1，GUT1的策略，將Hog1引起的各基因的表達(dá)變化加以逆轉(zhuǎn)，來(lái)促進(jìn)畢赤酵母胞內(nèi)甘油的積累，最終提高了畢赤酵母的高滲抗性。對(duì)HOG1的敲除表明，Hog1雖然對(duì)高滲抗性同時(shí)有著負(fù)面和正面2種作用，但總體而言不利于畢赤酵母的高滲抗性。hog1Δ菌株反而具有更強(qiáng)的高滲抗性這一現(xiàn)象，揭示了畢赤酵母與釀酒酵母截然不同的HOG信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制。具體通過(guò)何種機(jī)制來(lái)調(diào)控下游基因的表達(dá)，本研究尚未深入探討，需要在未來(lái)進(jìn)行更細(xì)致的研究。

本研究構(gòu)建的耐高滲畢赤酵母菌株可應(yīng)用于特定產(chǎn)物的發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)。在甘油培養(yǎng)階段可以加入較高濃度的甘油，簡(jiǎn)化了操作流程。