基于全基因組重測(cè)序策略對(duì)谷氨酸棒桿菌外源蛋白高產(chǎn)菌株相關(guān)基因的挖掘及初步驗(yàn)證

孟麗虹，劉秀霞*，楊艷坤，白仲虎

1(江南大學(xué),工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)2(江南大學(xué),糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)是食品安全級(jí)菌株，被廣泛用于生產(chǎn)許多有價(jià)值的氨基酸和副產(chǎn)物[1]。由于其具有完整的分泌途徑，無(wú)內(nèi)毒素且可高密度發(fā)酵等特性，近年來(lái)已發(fā)展成為能夠生成多種外源蛋白的卓越表達(dá)系統(tǒng)。然而，由于原始菌株的自然局限性，仍然存在一些缺點(diǎn)，如產(chǎn)量低，可用遺傳操作工具匱乏等[2]。隨著基因工程技術(shù)以及合成生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，人們有了更多改造宿主的方法，從而提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量，此系統(tǒng)已成為實(shí)驗(yàn)室研究及商業(yè)生產(chǎn)重組蛋白的熱點(diǎn)[3-4]。

目前，隨著基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的深入研究，為挖掘相關(guān)目標(biāo)信息提供了分析手段。目前大多數(shù)外源蛋白都依賴微生物表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行生產(chǎn)[5]。然而，由于底盤細(xì)胞代謝機(jī)制的復(fù)雜性，使理性改造存在一定的困難。因此從表型差異入手，結(jié)合全基因組重測(cè)序，可以進(jìn)一步分析差異表型相關(guān)的候選基因[6]，為高效宿主的開發(fā)提供方向。目前，分析基因組區(qū)域和區(qū)域內(nèi)變化的基因已成為一種挖掘表型差異相關(guān)候選基因的有效方法[7]。例如，ZHANG等[8]在全基因組水平篩選并鑒定了15種梨火疫菌的Sec依賴分泌蛋白酶。外源蛋白表達(dá)是一個(gè)復(fù)雜的耗能過(guò)程，涉及轉(zhuǎn)錄、翻譯、運(yùn)輸、分泌等多個(gè)過(guò)程，受多基因調(diào)控，路徑復(fù)雜。因此基于表型差異，采用組學(xué)的方法挖掘不同菌株之間的差異基因，有望為底盤細(xì)胞的優(yōu)化改造找到潛在的靶點(diǎn)，最終達(dá)到提升宿主蛋白表達(dá)能力的目的。

該研究基于全基因組重測(cè)序策略，對(duì)谷氨酸棒桿菌外源蛋白高產(chǎn)突變菌株進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotide polymorphisms, SNP)挖掘，并結(jié)合生物信息學(xué)分析SNP基因的結(jié)構(gòu)極其功能。進(jìn)一步通過(guò)構(gòu)建SNP基因過(guò)表達(dá)和敲除菌株，評(píng)估這些基因表達(dá)變化對(duì)菌株生長(zhǎng)以及外源蛋白增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescence protein, EGFP)和人重組特立帕肽(recombinant human teriparatide, rtPTH)表達(dá)的影響。最后利用SWISS-MODEL軟件對(duì)基因GL002370編碼的蛋白進(jìn)行建模，并分析了蛋白的功能。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)條件

在該研究所用的菌株見表1。大腸桿菌JM109，谷氨酸棒桿菌原始菌株和谷氨酸棒桿菌高產(chǎn)蛋白突變菌株(經(jīng)常溫室壓等離子體誘變所得)均由本實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌JM109用于質(zhì)粒構(gòu)建，谷氨酸棒桿菌是宿主改造和表達(dá)重組蛋白的底盤細(xì)胞。在LB培養(yǎng)基中于37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)大腸桿菌，谷氨酸棒桿菌菌株在LBB培養(yǎng)基(色氨酸10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，腦心浸出液10 g/L)中于30 ℃、220 r/min培養(yǎng)。大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌培養(yǎng)物中使用的卡那霉素和氯霉素質(zhì)量濃度分別為30、15 μg/mL。

表1 本研究所用菌株Table 1 Strains used in this study

1.2 全基因組重測(cè)序分析

將誘變篩選得到的菌株進(jìn)行全基因組重測(cè)序。分別準(zhǔn)備50 mL 菌液離心樣品(OD600= 10)送至華大基因公司測(cè)序。其在北京基因組研究所分別使用PacBio RS Ⅱ平臺(tái)和Illumina HiSeq 4000平臺(tái)對(duì)突變菌株進(jìn)行了重測(cè)序，以檢測(cè)潛在的SNP位點(diǎn)。

1.3 蛋白結(jié)構(gòu)分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行Protein BLAST分析，查找相似性最高的同源序列，獲得FASTA文件。利用CD-search查找蛋白保守結(jié)構(gòu)域。

1.4 質(zhì)粒

在該研究所用的質(zhì)粒見表2。組成型質(zhì)粒con-pEC-XK99E，用作谷氨酸棒桿菌中基因過(guò)表達(dá)載體；質(zhì)粒pK18 mobsacB為谷氨酸棒桿菌基因敲除載體；質(zhì)粒pXMJ19為谷氨酸棒桿菌中外源蛋白表達(dá)載體。上述3個(gè)質(zhì)粒均由實(shí)驗(yàn)室保存。

表2 本研究所用質(zhì)粒Table 2 Plasmids used in this study

1.4.1 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

根據(jù)全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)，分析突變位點(diǎn)。根據(jù)谷氨酸棒桿菌基因組序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增突變基因片段的引物。分別擴(kuò)增基因片段，同時(shí)用EcoR Ⅰ和PstⅠ對(duì)質(zhì)粒con-pEC-XK99E進(jìn)行酶切。用ABclonal同源同組連接基因片段和酶切載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)。培養(yǎng)出的轉(zhuǎn)化子采用PCR方法驗(yàn)證。正確的轉(zhuǎn)化子于LB液體培養(yǎng)中培養(yǎng)以提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒并測(cè)序，測(cè)序正確的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒命名為con-pEC-gene。

1.4.2 敲除質(zhì)粒構(gòu)建

以谷氨酸棒桿菌CGMCC1.15647基因組中待敲除的突變基因上下游750 bp為模板設(shè)計(jì)引物。用引物Ko-gene-LF和Ko-gene-LR擴(kuò)增上游同源臂，Ko-gene-RF和Ko-gene-RR擴(kuò)增下游同源臂，引物Ko-gene-LF和Ko-gene-RR分別引入同源序列，便于和pK18 mobsacB載體進(jìn)行同源重組。用EcoRⅠ和Hind Ⅲ對(duì)質(zhì)粒pK18 mobsacB進(jìn)行酶切。后續(xù)操作同1.3.1，構(gòu)建的敲除質(zhì)粒命名為pK18-gene。

1.5 過(guò)表達(dá)和敲除菌株構(gòu)建

1.5.1 過(guò)表達(dá)菌株構(gòu)建

測(cè)序正確的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒con-pEC-gene分別通過(guò)電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌感受態(tài)，30 ℃培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)的單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，構(gòu)建SNP基因過(guò)表達(dá)重組菌株。

1.5.2 敲除菌株構(gòu)建

敲除載體pK18-gene分別電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌中。陰性對(duì)照為野生型菌株。30 ℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行蔗糖敏感性篩選，長(zhǎng)出的單菌落同時(shí)點(diǎn)在LBB+K和LBB+K+蔗糖的固體平板上。12 h后挑選在LBB+K上生長(zhǎng)而LBB+K+蔗糖不長(zhǎng)的單菌落，用LBB液體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接到LBB+蔗糖液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h。取1 μL菌液在LBB+蔗糖固體平板上劃線，長(zhǎng)出的單菌落分別點(diǎn)在LBB和LBB+K固體平板上，挑選LBB板上長(zhǎng)而LBB+K不長(zhǎng)的單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證或測(cè)序，構(gòu)建SNP基因敲除菌株。

1.6 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

分別將SNP重組菌株接種于10 mL的LBB培養(yǎng)基中于30 ℃、220 r/min培養(yǎng)，12 h后轉(zhuǎn)接至100 mL的LBB培養(yǎng)基中，使初始OD600值為0.3。在30 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)36 h，一定時(shí)間取1次樣，測(cè)定OD600值。

1.7 熒光強(qiáng)度測(cè)定

將誘導(dǎo)型質(zhì)粒pbtac-HT-11-EGFP轉(zhuǎn)化至構(gòu)建的SNP重組菌株中，挑選單菌落于24孔板中(每孔含2 mL LBB培養(yǎng)基)。在30 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)12 h后，將20 μL菌液轉(zhuǎn)接至新的24孔板中并在每孔加入2 μL IPTG(24 mg/mL)，培養(yǎng) 24 h后測(cè)量熒光強(qiáng)度和OD600吸光值，計(jì)算單位熒光強(qiáng)度(FI/OD600)。

1.8 rtPTH外源蛋白表達(dá)和分析

選擇有價(jià)值的外源蛋白rtPTH進(jìn)行SNP過(guò)表達(dá)和敲除重組菌株的進(jìn)一步分析。將質(zhì)粒pXMJ19-rtPTH電轉(zhuǎn)至over-2370和ko-973-974，后續(xù)操作同1.6。將rtPTH的發(fā)酵產(chǎn)物在12 000 r/min下離心1 min，并將上清液制成蛋白樣品，進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.9 SWISS-MODEL預(yù)測(cè)分析

利用SWISS-MODEL軟件，輸入蛋白序列，搜索以匹配相關(guān)模板，選擇匹配性最高的模板，建立蛋白模型，并利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)分析蛋白功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變菌株的全基因組重測(cè)序分析

將誘變菌株的全基因組重測(cè)序結(jié)果進(jìn)行整理分析后，結(jié)果顯示突變菌株中共有33個(gè)SNP和7個(gè)InDel。SNP包括位于編碼序列(CDS)中的22個(gè)非同義突變和位于基因間區(qū)域中的11個(gè)其他突變。其中編碼序列主要涉及5個(gè)基因(表3)，除GL002370編碼1種預(yù)測(cè)蛋白以外，GL000353，GL000477和GL002063編碼的蛋白質(zhì)分別具有氧化還原酶，核酸內(nèi)切酶和酪氨酸重組酶活性，GL002761編碼ATP依賴性Clp蛋白酶[9]。在位于GL000349～GL000350，GL000476～GL000477，GL000973～GL000974，GL002062～GL002063，GL002369～GL002370，GL002760～GL002761的基因間區(qū)域檢測(cè)到突變。因此，這些突變可能是增加外源蛋白質(zhì)產(chǎn)量的相關(guān)靶基因，但其具體功能仍不清楚，需要進(jìn)一步研究以探索這些基因與其表型變化之間的關(guān)系。

表3 全基因組重測(cè)序突變位點(diǎn)分析Table 3 The analysis for genome resequencing mutation site

2.2 SNP基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)分析

從分析結(jié)果可知，SNP主要集中在GL000353，GL000477，GL002063，GL002370和GL002761這5個(gè)基因中，因此，該研究主要分析驗(yàn)證這5個(gè)基因?qū)τ谕庠吹鞍妆磉_(dá)量的影響。首先通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)分析了5個(gè)基因編碼的蛋白的結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖1所示。GL000353編碼的蛋白共311個(gè)氨基酸，是短鏈型脫氫酶/還原酶。它包含1個(gè)NADB結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域存在于許多代謝途徑的脫氫酶中，例如糖酵解和許多其他氧化還原酶[10]。GL000477編碼5-甲基胞嘧啶特異性限制性核酸內(nèi)切酶McrA，共340個(gè)氨基酸，它是典型的限制性修飾(RM)系統(tǒng)中的一種酶，該系統(tǒng)可保護(hù)宿主免受外源DNA的侵害[11]。McrA包含1個(gè)His-Asn-His (HNH)基序，這個(gè)基序的第1個(gè)氨基酸在HNH核酸酶中的重要催化功能[12]。GL002063編碼特異性酪氨酸重組酶XerC，共315個(gè)氨基酸。Xer位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)可以把通過(guò)同源重組形成的二聚體染色體轉(zhuǎn)化為單體，它的C末端結(jié)構(gòu)域在核心位點(diǎn)結(jié)合，切割和重新連接DNA鏈，而N末端結(jié)構(gòu)域在很大程度上負(fù)責(zé)與同源臂結(jié)合[13]。GL002370編碼1個(gè)含有93個(gè)氨基酸的蛋白。GL002761編碼具有分子伴侶活性和ATP結(jié)合亞基的ClpC蛋白酶，由925個(gè)氨基酸構(gòu)成。此蛋白酶有2個(gè)Clp-N結(jié)構(gòu)域，1個(gè)ClpB-D2-small結(jié)構(gòu)域以及1個(gè)UVR結(jié)構(gòu)域[14]。

圖1 SNP基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of the protein structures encoded by the SNP genes

2.3 SNP基因過(guò)表達(dá)和敲除重組菌株的構(gòu)建

為了驗(yàn)證SNP基因?qū)τ谕庠吹鞍妆磉_(dá)的影響，首先構(gòu)建了SNP基因的過(guò)表達(dá)和敲除重組菌株。將SNP基因過(guò)表達(dá)質(zhì)粒con-pEC-gene電轉(zhuǎn)入谷氨酸棒桿菌中，培養(yǎng)出的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖2-a所示，成功構(gòu)建SNP基因過(guò)表達(dá)菌株：over-353，over-477，over-2063，over-2370，over-2761。將最后培養(yǎng)的敲除菌株進(jìn)行PCR驗(yàn)證，定點(diǎn)突變菌株進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果如圖2-b和圖2-c所示，成功敲除GL000353和GL002370，并且定點(diǎn)突變菌株測(cè)序正確。因此，成功構(gòu)建了SNP基因敲除菌株：ko-353，ko-2370，ko-349-350，ko-476-477，ko-974-973。

a-SNP過(guò)表達(dá)菌株P(guān)CR驗(yàn)證(M：2 000 marker，1～5：over-353，over-477，over-2063，over-2370，over-2761菌株P(guān)CR驗(yàn)證)；b-敲除GL000353菌株P(guān)CR驗(yàn)證(M：2 000 marker，1：陰性對(duì)照，2～4：GL000353敲除菌株)；c-敲除GL002370菌株P(guān)CR驗(yàn)證(M：2 000 marker，1：陰性對(duì)照，2～7：GL002370敲除菌株)圖2 SNP基因過(guò)表達(dá)和敲除菌株P(guān)CR驗(yàn)證Fig.2 The PCR verification of SNP genes overexpression and knockout strains

2.4 SNP基因過(guò)表達(dá)和敲除重組菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

為了觀察SNP基因的過(guò)表達(dá)和敲除是否對(duì)菌株的生長(zhǎng)有影響，進(jìn)行了生長(zhǎng)曲線的測(cè)定。結(jié)果如圖3所示，除了over-353，over-2761和ko-2370前期生長(zhǎng)較為緩慢外，其余SNP基因的過(guò)表達(dá)和敲除對(duì)菌株的生長(zhǎng)沒(méi)有太大影響。

a-SNP基因過(guò)表達(dá)菌株生長(zhǎng)曲線；b-SNP基因敲除菌株生長(zhǎng)曲線圖3 SNP基因過(guò)表達(dá)菌株和敲除菌株生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve of SNP genes overexpression and knockout strains注：WT表示野生型(wild type)(下同)

2.5 SNP重組菌株對(duì)EGFP外源蛋白表達(dá)的影響

為了探究SNP基因重組菌株對(duì)于外源蛋白表達(dá)的影響，將EGFP作為報(bào)告蛋白以觀察熒光蛋白表達(dá)量的變化。將質(zhì)粒pbtac-HT-11-EGFP分別電轉(zhuǎn)入SNP基因重組菌株，在多孔板中培養(yǎng)24 h后檢測(cè)熒光值。結(jié)果如圖4所示，在SNP過(guò)表達(dá)菌株中，除over-2761-EGFP的熒光值明顯降低以外，其余菌株SNP過(guò)表達(dá)菌株的熒光值都增加，且over-2370-EGFP的熒光值最高。在SNP敲除菌株中，ko-2370-EGFP和ko-349-350-EGFP熒光值明顯降低，而ko-973-974-EGFP的熒光值最高，其次是ko-353-EGFP，ko-476-477-EGFP。其中，over-2761-EGFP熒光值降低可能是GL002761編碼的Clp蛋白酶將EGFP外源蛋白降解所致。ko-353-EGFP和over-353-EGFP熒光強(qiáng)度均比野生型(wild type，WT)的高，且前者比后者的提升幅度更明顯，可能是由于過(guò)表達(dá)GL000353編碼的脫氫酶/還原酶加快了整個(gè)菌株的能量代謝流，使熒光蛋白的表達(dá)增加，而敲除該脫氫酶/還原酶可能改變能量代謝的流向，使能量更多的用于外源蛋白的合成。over-477-EGFP，ko-476-477-EGFP和ko-973-974-EGFP均使熒光值增強(qiáng)，而GL000477和GL000974都編碼5-甲基胞嘧啶特異性限制性核酸內(nèi)切酶McrA，該蛋白與外源DNA的導(dǎo)入有關(guān)，對(duì)增強(qiáng)外源蛋白產(chǎn)量的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。同樣over-2370-EGFP顯著增強(qiáng)了EGFP的表達(dá)，但其編碼的蛋白未知，還需要進(jìn)一步探究。因此，基因GL002370以及GL000974確實(shí)與提高蛋白表達(dá)產(chǎn)量密切相關(guān)。

a-SNP過(guò)表達(dá)菌株熒光值；b-SNP敲除菌株熒光值圖4 SNP基因過(guò)表達(dá)和敲除菌株單位熒光強(qiáng)度Fig.4 Unit fluorescence intensity of SNP genes overexpression and knockout strains

2.6 SNP基因重組菌株對(duì)其他外源蛋白表達(dá)的影響

為了觀察SNP基因重組菌株對(duì)其他外源蛋白是否具有同樣的效果。分別選擇上述研究中對(duì)EGFP表達(dá)量最具影響的2株重組菌，over-2370和ko-973-974。在這2株SNP重組菌株中表達(dá)有價(jià)值的外源蛋白rtPTH，以驗(yàn)證它們對(duì)其他外源蛋白表達(dá)量的影響。rhPTH是一種肽藥物，包含1～34個(gè)N末端氨基酸，已用于治療骨質(zhì)疏松癥[15]。該研究使用了新的融合標(biāo)簽Spy來(lái)促進(jìn)rtPTH的穩(wěn)定表達(dá)[16]。將質(zhì)粒pXMJ19-rtPTH分別電導(dǎo)入over-2370和ko-973-974，構(gòu)建over-2370-rtPTH和ko-973-974-rtPTH重組菌株。重組菌株分別誘導(dǎo)表達(dá)24 h后，結(jié)果如圖5所示。Spy-rtPTH蛋白分子質(zhì)量為20.8 kDa，over-2370-rtPTH和ko-973-974-rtPTH均具有比WT有更高的產(chǎn)量。因此，在分析的SNP中，GL002370以及GL000974編碼的蛋白確實(shí)能夠使外源蛋白表達(dá)量明顯增加。

M-26610 marker，1-WT-rtPTH，2-ko-973-974-rtPTH，3-over-2370-rtPTH圖5 rtPTH外源蛋白表達(dá)驗(yàn)證Fig.5 The verification for rtPTH heterologous protein expression

2.7 基因GL002370編碼的蛋白預(yù)測(cè)分析

基于以上蛋白表達(dá)結(jié)果的分析，基因GL000974和GL002370編碼的蛋白對(duì)提高外源蛋白產(chǎn)量影響較大，其中基因GL000974編碼的蛋白功能已知，而GL002370編碼的蛋白功能未知。因此分析了GL002370編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。結(jié)果如圖6所示，經(jīng)SWISS-MODEL分析，預(yù)測(cè)基因GL002370編碼的蛋白與谷氨酸棒桿菌的硫氧還蛋白依賴性砷酸還原酶最為相似，為α-螺旋的同源二聚體結(jié)構(gòu)。硫氧還蛋白依賴性砷酸還原酶(ArsC)屬于砷酸鹽還原酶的第二家族，該家族使用硫氧還蛋白作為電子供體，在生物砷解毒途徑中起重要作用[17]。該家族在結(jié)構(gòu)和功能上與低分子量蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶接近，并且具有磷酸酶活性。磷酸酶和激酶共同構(gòu)成去磷酸化和磷酸化的調(diào)控系統(tǒng)，處于能量代謝的關(guān)鍵位置。而外源蛋白表達(dá)本身就是一個(gè)消耗大量能量的過(guò)程，因此推測(cè)這個(gè)基因可能影響蛋白生成的能量代謝，從而導(dǎo)致了外源蛋白產(chǎn)量的增加，但要明確over-2370影響蛋白產(chǎn)量的作用機(jī)理還需要進(jìn)一步探究。

圖6 SWISS-MODEL預(yù)測(cè)基因GL002370編碼的蛋白結(jié)構(gòu)圖Fig.6 The GL002370 protein structure predicted by SWISS-MODEL

3 結(jié)論與討論

在這項(xiàng)研究中，為了挖掘與蛋白表達(dá)相關(guān)的具體基因并獲得高產(chǎn)外源蛋白的谷氨酸棒桿菌菌株。首先基于全基因組重測(cè)序策略，分析出與蛋白表達(dá)相關(guān)的靶基因，并利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)分析了蛋白的結(jié)構(gòu)。其次構(gòu)建了SNP基因過(guò)表達(dá)和敲除菌株，評(píng)價(jià)生長(zhǎng)曲線以及SNP重組菌株中EGFP的表達(dá)水平。其中，SNP過(guò)表達(dá)菌株over-2370和ko-973-974使蛋白表達(dá)水平顯著增強(qiáng)。此外，我們選擇了有價(jià)值的外源蛋白rtPTH以驗(yàn)證SNP基因重組菌株對(duì)其他外源蛋白的適用性。最后利用SWISS-MODEL軟件進(jìn)行了基因GL002370編碼的蛋白的建模，并分析了蛋白的功能。

但是，在研究過(guò)程中存在一些需要進(jìn)一步研究的問(wèn)題。首先，目前只研究了單基因過(guò)表達(dá)和一些基因敲除對(duì)于蛋白表達(dá)的影響，其他基因的敲除和多基因的組合情況有待進(jìn)一步研究。其次，基因GL002370編碼的具體蛋白以及導(dǎo)致蛋白產(chǎn)量增加的具體機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)一步深入研究。最后，提高外源蛋白產(chǎn)量除了宿主改造還有多個(gè)方面，例如優(yōu)良的表達(dá)載體，表達(dá)元件等，可以探究不同組合之間的相互關(guān)系，以及對(duì)蛋白產(chǎn)量的影響[18-19]。這些研究都具有重要意義，要求研究人員進(jìn)一步探索和發(fā)現(xiàn)新的目標(biāo)。