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    兩頭烏豬JAZF1基因的克隆及生物信息學(xué)分析

    2022-01-13 10:44:06徐興莉饒榮海
    豬業(yè)科學(xué) 2021年12期
    關(guān)鍵詞:鋅指結(jié)構(gòu)域磷酸化

    楊 虎 ,徐興莉 ,饒榮海

    (1.宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院,江西 宜春 336000;2.宜黃縣桃陂鎮(zhèn)獸醫(yī)站,江西 撫州 344400)

    JAZF1(Ju xtaposed with another zinc finger gene1)基因又名Tip27,ZNF802,最早由全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)的與人Ⅱ型糖尿病相關(guān)的基因,JAZF1基因?qū)?dòng)物糖和脂肪代謝有重要調(diào)控作用。盧春敏等將JAZF1基因轉(zhuǎn)染到小鼠肝細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)JAZF1基因過表達(dá)可以使SREBP1基因表達(dá)下調(diào),而SREBP1基因表達(dá)產(chǎn)物是脂肪代謝調(diào)控的重要轉(zhuǎn)錄因子,這些轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控直接影響脂肪的合成。通過對小鼠研究發(fā)現(xiàn),JAZF1基因過表達(dá)能夠顯著抑制肝臟的糖異生作用。這些研究表明JAZF1是體內(nèi)脂代謝和糖代謝的重要調(diào)控因子。JAZF1基因在動(dòng)物體內(nèi)對脂肪代謝分子調(diào)控機(jī)制還不清楚,而脂肪含量特別是肌內(nèi)脂肪和肌間脂肪含量是評價(jià)動(dòng)物肉質(zhì)的重要指標(biāo)。文章以肌內(nèi)脂肪含量適中的贛西兩頭烏豬為研究對象,克隆JAZF1基因的cDNA全長,并對該序列的組成、編碼蛋白質(zhì)的特點(diǎn)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,為探索JAZF1基因調(diào)控脂肪代謝機(jī)制提供基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    組織樣品取自贛西兩頭烏豬的背最長肌,且保存于-80 ℃,5'RACE和3'RACE克隆試劑盒分別購自Invitrogen公司和 Clontech 公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 總RNA提取及cDNA 合成

    用反轉(zhuǎn)錄酶和特異性引物先合成cDNA第1鏈,然 后 用RNase Mix 對cDNA處理,最后再純化cDNA。

    1.2.2 PCR擴(kuò)增

    根據(jù)GenBank提供的人JAZF1基因(登錄號(hào):NM_175061)序列設(shè)計(jì)PCR引物(表1)擴(kuò)增并克隆測序,即可獲得JAZF1基因部分CDS(coding domain sequence)序列。

    表1 引物序列

    1.2.3 RACE擴(kuò)增

    1)5'RACE擴(kuò)增。首先對純化后的cDNA末端加上多聚C,再用試劑盒特異性引物對已經(jīng)加尾的cDNA進(jìn)行第一輪擴(kuò)增;再用特異性引進(jìn)行第二輪擴(kuò)增,電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行并回收,最后將PCR產(chǎn)物與pMD18-T連接,并進(jìn)行測序,得到長度為684 bp的目的序列。2)3'RACE擴(kuò)增。 使用試劑盒特異引物及合成的cDNA進(jìn)PCR擴(kuò)增,電泳檢測并回收,純化后的PCR產(chǎn)物與載體連接并克隆測序,最終得到420 bp的序列。

    1.3 統(tǒng)計(jì)分析

    1.3.1 JAZF1基因的序列分析

    根據(jù)克隆測序結(jié)果,利用軟件DNAstar7.1 預(yù)測JAZF1基因的ORF(Open Reading Frame)并預(yù)測氨基酸序列。

    1.3.2 豬JAZF1基因的蛋白結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測

    分別預(yù)測JAZF1氨基酸的磷酸化位點(diǎn)( http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)、潛在的糖基化位點(diǎn)(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)及JAZF1蛋白的親水性(http://web.expasy.org/protscale/),利用Smart(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域。

    2 結(jié)果與分析

    本實(shí)驗(yàn)成功克隆了兩頭烏豬JAZF1基因部分CDS序列,利用RACE技術(shù)成功獲得了該基因的5'末端序列和3'末端序列。電泳檢測5'RACE和3'RACE的兩個(gè)產(chǎn)物片段,結(jié)果如圖1所示,兩頭烏豬部分CDS序列產(chǎn)物長為 620 bp(圖1A),5'RACE 產(chǎn)物長 684 bp(圖1B),3'RACE 產(chǎn)物長420 bp(圖1C), 回收條帶并克隆測序。 最后得到了JAZF1基因的cDNA全長序列,共1 098 bp,包括ORF 732 bp,編碼243個(gè)氨基酸,氨基酸序列見圖2(DNASTAR)。

    圖1 豬JAZF1基因 1%瓊脂糖凝膠電泳圖

    圖2 豬JAZF1核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列圖

    2.1 豬JAZF1蛋白結(jié)構(gòu)分析

    2.1.1 蛋白理化性質(zhì)分析

    豬JAZF1蛋白分子量為27 079.4 Da,等電點(diǎn)為8.63;JAZF1蛋白的氨基酸中,絲氨酸(Ser)含量為11.9%,所占比例最高,含量最低為蛋氨酸(Met),比例為2.1%。

    2.1.2 JAZF1蛋白跨膜螺旋結(jié)構(gòu)

    TMPRED分析蛋白跨膜結(jié)構(gòu),顯示豬JAZF1蛋白有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu),且由內(nèi)向外,跨膜區(qū)的氨基酸殘基位置在8-25處,見圖3。

    圖3 TMPRED軟件預(yù)測JAZF1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)

    2.1.3 JAZF1潛在磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)分析

    在線分析JAZF1蛋白的磷酸化位點(diǎn),發(fā)現(xiàn)2個(gè)蘇氨酸(Thr)、3個(gè)酪氨酸(Tyr)及18個(gè)絲氨酸(Ser)屬于蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)(圖4); 糖基化位點(diǎn)有19個(gè)(圖5)。

    圖4 JAZF1蛋白磷酸化位點(diǎn)

    圖5 JAZF1糖基化位點(diǎn)

    2.1.4 JAZF1蛋白親疏水性分析

    蛋白疏水性分析顯示,豬JAZF1基因編碼蛋白為水溶性蛋白,如圖6所示。JAZF1蛋白疏水性最小值為-2.700,,最大值為1.511,氨基酸序列內(nèi)大部分屬于親水性氨基酸。

    圖6 JAZF1氨基酸親水性分析

    2.1.5 蛋白結(jié)構(gòu)域分析及功能預(yù)測

    結(jié)構(gòu)域顯示,豬JAZF1氨基酸殘基分別有3個(gè) ZnF-C2H2 的結(jié)構(gòu)域;JAZF1蛋白功能分析結(jié)果如表2所示,發(fā)現(xiàn)該蛋白在能量代謝、脂肪酸代謝的作用概率明顯高于其他功能,蛋白運(yùn)載結(jié)合概率最高為2.030,說明JAZF1基因在脂肪酸代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用,可能對調(diào)節(jié)脂肪的沉積有重要影響。

    表2 JZAF1蛋白功能預(yù)測結(jié)果

    3 討論與結(jié)論

    JAZF1作為一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的基因,其對糖代謝和脂肪代謝的重要調(diào)控作用已經(jīng)得到證實(shí)。糖代謝方面,JAZF1的表達(dá)與人的二型糖尿病密切相關(guān),其詳細(xì)調(diào)控機(jī)制目前尚不明晰。脂肪代謝方面主要是通過抑制脂肪形成和促進(jìn)其分解來調(diào)控,有研究證實(shí),JAZF1主要是通過抑制細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸和甘油三酯的沉積,來提高肝臟脂肪酸的β氧化作用,進(jìn)而促進(jìn)脂肪分解。梁艷等研究發(fā)現(xiàn),隨著日齡的增加,JAZF1基因在豬肌肉中的表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢,研究結(jié)果顯示JAZF1基因在肌肉發(fā)育和肌內(nèi)脂肪沉積過程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用;朱才業(yè)對不同品種羊全基因組關(guān)聯(lián)分析,證實(shí)JAZF1基因與脂肪形成密切相關(guān)。JAZF1的結(jié)構(gòu)域顯示該蛋白含有鋅指家族中最為普遍的C2H2結(jié)構(gòu)域類型,C2H2結(jié)構(gòu)域根據(jù)含鋅指結(jié)構(gòu)數(shù)量的多少可分為三類鋅指蛋白,含3個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)的C2H2型鋅指蛋白(tC2H2),含多個(gè)C2H2結(jié)構(gòu)的鋅指蛋白(maC2H2);鋅指成對間隔排列的 spC2H2 型。豬的JAZF1蛋白結(jié)構(gòu)含有3個(gè)鋅指結(jié)構(gòu),屬于tC2H2型鋅指蛋白,每個(gè)鋅指由一個(gè)螺旋和2個(gè)折疊組成,鋅指間由接頭連接,接頭內(nèi)氨基酸具有保守性,3個(gè)鋅指在蛋白內(nèi)串聯(lián)排列均結(jié)合到DNA大溝內(nèi)。此類結(jié)構(gòu)域通常作為重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子參與表達(dá)調(diào)控,所以JAZF1蛋白極有可能是參與肌內(nèi)脂肪沉積的重要調(diào)控因子。

    蛋白質(zhì)磷酸化糖基化是最常見、最重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式之一,也是一種普遍的生命活動(dòng)調(diào)節(jié)方式,在信號(hào)傳遞等過程中發(fā)揮重要作用。利用生物信息學(xué)軟件分析,發(fā)現(xiàn)JAZF1蛋白存在18個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn),3個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn),2個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)及19個(gè)糖基化位點(diǎn), 這些位點(diǎn)可能在細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、分化及細(xì)胞生長等多個(gè)生理過程中發(fā)揮著重要作用。JAZF1蛋白功能的預(yù)測表明該蛋白對脂肪酸代謝及能量代謝有重要的調(diào)節(jié)作用,JAZF1基因?qū)χ镜暮铣煽赡苡兄匾绊憽?/p>

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