犢牛致病性大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

曹貴忠

（青海省西寧市湟源縣畜牧獸醫(yī)站 812100）

犢牛腹瀉在奶牛及肉牛養(yǎng)殖業(yè)中十分常見，其中大部分的發(fā)病原因?yàn)楦腥玖酥虏⌒源竽c桿菌。大腸桿菌在人類及動(dòng)物腸道內(nèi)非常常見，由于環(huán)境不同，腸桿菌毒素也不同，使得一些特殊的大腸桿菌產(chǎn)生致病性，犢牛尤其是一周齡以內(nèi)的犢牛由于抵抗力較低，在遇到致病性大腸桿菌時(shí)發(fā)病率十分高。具有致病性的大腸桿菌通過(guò)發(fā)病牛排泄物還可能傳染給周圍環(huán)境的家畜及人類，導(dǎo)致被感染者出現(xiàn)一系列癥狀，最嚴(yán)重的可能會(huì)引起死亡，因此，防控該類疾病十分重要。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源

病料采自青海湟源縣某肉牛場(chǎng)病死犢牛肝、脾、腸道內(nèi)容物樣品，無(wú)菌低溫保存。

1.2 剖檢與樣品采集

對(duì)病死犢牛進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)剖驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其共同癥狀為胃腸道出血、肝脾及淋巴結(jié)腫大等典型癥狀[1]，分別采集肝臟、脾臟、腸道發(fā)病部位病料一份，無(wú)菌保存，標(biāo)記備用。

1.3 試驗(yàn)材料及儀器

接菌環(huán)、手術(shù)剪刀，無(wú)菌生理鹽水，無(wú)菌試管、麥康凱培養(yǎng)基、高壓滅菌鍋、生化試驗(yàn)試劑、血平板、麥康凱培養(yǎng)基、伊紅亞甲藍(lán)培養(yǎng)基等。

1.4 細(xì)菌的分離與培養(yǎng)

無(wú)菌條件下將無(wú)菌采集到的肝臟、脾臟、腸道內(nèi)容物分別均勻地涂于血平板上，將接種好的血平板做好標(biāo)記，并放置于恒溫培養(yǎng)箱中，溫度設(shè)定為37℃，經(jīng)過(guò)24h 的培養(yǎng)后觀察是否有細(xì)菌生長(zhǎng)以及菌落的形態(tài)、顏色、大小等情況。鏡檢后根據(jù)情況可進(jìn)行鑒別培養(yǎng)。

1.4.1 涂片染色鏡檢

分離出細(xì)菌的培養(yǎng)基要進(jìn)行染色鑒定。挑取單菌落處理后進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察其形態(tài)，可以對(duì)觀察到的菌體形態(tài)進(jìn)行初步鑒定。

1.4.2 分離培養(yǎng)與鑒定

革蘭氏染色后觀察細(xì)菌形態(tài)，初步判斷細(xì)菌種類。

1.5 大鼠致病性試驗(yàn)

在無(wú)菌環(huán)境下，挑取單菌落接種于含有10%犢牛血清的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中，37℃，培養(yǎng)16h 后，將4 只小鼠分為2 組，每組兩只，實(shí)驗(yàn)組小白鼠腹腔注射含量108cfu/ml 的菌液0.2ml，另一組腹腔注射0.2ml 的培養(yǎng)液。觀察小鼠后續(xù)反應(yīng)。

1.6 生化性質(zhì)鑒定試驗(yàn)

將腹瀉死亡的犢牛中致病菌和小鼠體內(nèi)分離到的細(xì)菌在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行生化性質(zhì)鑒定。

1.7 藥物敏感性試驗(yàn)

采用K-B 法進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，CLSI 標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)結(jié)果

由表1 可知，通過(guò)單菌落的形態(tài)顏色及鑒別培養(yǎng)接的培養(yǎng)結(jié)果顯示，分離到的菌落在普通營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上的形態(tài)為乳白色、菌落邊緣光滑、凸起的毒株；血平板中培養(yǎng)可見溶血，中等菌落的細(xì)菌；麥康凱培養(yǎng)基中可見紅色，中等菌落；伊紅亞甲藍(lán)培養(yǎng)基中黑色、中等菌落。通過(guò)以上的培養(yǎng)鑒別可以初步確定為大腸桿菌。

表1 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果

2.2 涂片染色鏡檢結(jié)果

革蘭氏染色后在顯微鏡下可以觀察到紅色的桿狀細(xì)菌，大小中等，無(wú)芽孢。有的細(xì)菌近似球狀，有的細(xì)菌近似絲狀，不呈鏈?zhǔn)椒至选?/p>

2.3 動(dòng)物致病性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別腹腔注射菌液和培養(yǎng)基后，在飼料、飲水、墊料等環(huán)境相同的情況下發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組小鼠在注射細(xì)菌后的第二天出現(xiàn)腹瀉癥狀，第三天全部死亡；對(duì)照組小鼠健康存活，未出現(xiàn)腹瀉。剖檢病死鼠后對(duì)腸道內(nèi)容物進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，分離得到的細(xì)菌在培養(yǎng)基培養(yǎng)與鏡檢結(jié)果與之前在腹瀉致死犢牛腸道內(nèi)容物中的細(xì)菌形態(tài)及性質(zhì)相同。本試驗(yàn)結(jié)果可證明該菌株有較強(qiáng)的致病性。

2.4 細(xì)菌的生化試驗(yàn)結(jié)果

將犢牛腸道內(nèi)容物分離到的細(xì)菌和小鼠腸道內(nèi)容物分離到的細(xì)菌接種于表2 的生化管中，通過(guò)培養(yǎng)結(jié)果可以看到，該菌符合大腸桿菌的生化特性。

表2 試驗(yàn)結(jié)果

2.5 細(xì)菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

在藥物敏感性試驗(yàn)中選取林可霉素、青霉素等6 種抗菌藥進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，該細(xì)菌對(duì)青霉素、卡那霉素敏感，對(duì)大觀霉素、阿莫西林、頭孢拉定、多西環(huán)素耐藥。

3 討論

大腸桿菌廣泛存在于人類及家畜腸道中。在飼養(yǎng)過(guò)程中為了更好地避免出現(xiàn)大腸桿菌感染，從業(yè)人員要在平時(shí)工作中加強(qiáng)飼養(yǎng)管理。保障養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)飼料安全無(wú)污染，及時(shí)清理動(dòng)物糞便，在適宜的時(shí)間做好疾病防控工作。在肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)中，尤其要做好犢牛保健工作。當(dāng)出現(xiàn)由于致病性大腸桿菌引起的犢牛腹瀉后，要進(jìn)行合理治療，盡量減少經(jīng)濟(jì)損失。

通過(guò)本次犢牛腹瀉的發(fā)病情況可以看到，藥敏試驗(yàn)中使用的6 種藥物有4 種產(chǎn)生了耐藥性。這也提醒相關(guān)工作人員要做好有針對(duì)性的用藥，避免出現(xiàn)濫用藥情況。近年來(lái)，亂用藥的現(xiàn)象比較常見，使得耐藥性越來(lái)越嚴(yán)重。希望越來(lái)越多的肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)可以通過(guò)采用無(wú)抗養(yǎng)殖的方法飼養(yǎng)肉牛，減少抗生素的使用，提高飼養(yǎng)管理水平，提高家畜免疫力，杜絕濫用藥物。