基于液質(zhì)聯(lián)用的植物化學(xué)形態(tài)學(xué)分析體系建設(shè)初探
——以甜葉菊葉為例

羅慶云，印敏

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，南京 210095；2.江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所（南京中山植物園）江蘇省藥用植物研究開(kāi)發(fā)中心，南京 210014）

0 引言

植物化學(xué)分類學(xué)（Plant chemotaxonomy）是植物分類學(xué)與植物化學(xué)相互滲透、相互補(bǔ)充、互為借鑒而形成的一門交叉學(xué)科。它以植物化學(xué)成分為依據(jù)，以經(jīng)典分類學(xué)為基礎(chǔ)，對(duì)植物加以分類和記述，研究植物化學(xué)成分與植物類群間的關(guān)系，探討植物界的演化規(guī)律[1]。植物化學(xué)分類學(xué)的主要研究任務(wù)是：（1）探索各級(jí)分類群所含化學(xué)成分及其合成途徑；（2）探索各種化學(xué)成分在植物系統(tǒng)中的分布規(guī)律；（3）配合傳統(tǒng)分類學(xué)及有關(guān)學(xué)科，從植物中化學(xué)成分的角度，共同探索植物系統(tǒng)發(fā)育[2]。植物化學(xué)形態(tài)學(xué)（Plant chemical morphology,PCM）研究是對(duì)植物資源目標(biāo)器官所含化合物的全面解析，是以特定部位所含化合物為依據(jù)對(duì)資源加以描述和分類的一門形態(tài)學(xué)與化學(xué)相互滲透的學(xué)科。它揭示種內(nèi)亞種、變種及變型分化的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，為種內(nèi)各化學(xué)變種、化學(xué)型及化學(xué)宗的確定提供分類依據(jù)，是植物化學(xué)分類學(xué)的有機(jī)組成部分。它基于植物化學(xué)成分間的有機(jī)聯(lián)系，探討化合物的形成、積累及轉(zhuǎn)化機(jī)制，為以植物資源特定部位所含化合物為關(guān)注對(duì)象的遺傳改良和栽培管理提供依據(jù)。植物化學(xué)形態(tài)學(xué)的主要研究任務(wù)包括：（1）建立全面表征植物特定部位所含化合物的方法；（2）探索植物特定部位所含化合物的形成、積累、轉(zhuǎn)化機(jī)制；（3）分析種內(nèi)各化學(xué)變種、化學(xué)型及化學(xué)宗間所含化學(xué)組分差異，探索種內(nèi)分化的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。

我國(guó)植物化學(xué)分類工作的特點(diǎn)之一就是與植物資源開(kāi)發(fā)緊密結(jié)合[1]，植物化學(xué)形態(tài)學(xué)的研究著眼于種內(nèi)，在對(duì)種內(nèi)各化學(xué)變種、化學(xué)型及化學(xué)宗所屬各植株間特定部位所含化合物定性、定量差異分析基礎(chǔ)上，闡明各化合物的形成、積累、轉(zhuǎn)化機(jī)制，揭示種內(nèi)亞種、變種及變型分化的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，為以特定部位所含化合物為關(guān)注對(duì)象的遺傳改良、栽培管理和開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

甜葉菊（Stevia rebaudianaBertoni）為原產(chǎn)于南美洲阿曼山脈的菊科斯特維亞屬宿根性多年生草本植物，因其葉內(nèi)富含一類口味不同程度地接近蔗糖、甜度為蔗糖200～300倍、熱量為蔗糖1/300的四環(huán)二萜類化合物——甜菊糖苷（Steviol glycosides）而被廣為種植加工。自上世紀(jì)70年代引入以來(lái)，我國(guó)已發(fā)展為世界最主要的甜葉菊種植、加工基地。為探討植物化學(xué)形態(tài)學(xué)分析體系建設(shè)所面臨的挑戰(zhàn)及對(duì)策，建立植物化學(xué)形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)分析體系，為植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究提供參考，本研究以對(duì)甜菊糖苷所在關(guān)鍵部位——甜葉菊葉所含化學(xué)組分的分析為例進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

為建立植物化學(xué)形態(tài)學(xué)分析體系，本研究以甜葉菊為例，2018 年以本實(shí)驗(yàn)室于2016—2018 年選育的田間性狀及葉片各甜菊糖苷組分差異大、按常規(guī)方法種植于江蘇東臺(tái)（E 120.8375、N 32.7794）的208份甜葉菊品系的現(xiàn)蕾期植株葉片為材料。為進(jìn)一步考察不同采集時(shí)期、不同種植區(qū)域及儀器狀態(tài)對(duì)甜葉菊葉內(nèi)包括甜菊糖苷在內(nèi)各化合物檢出穩(wěn)定性的影響，2019年以種植于江蘇南京（E 118.8455、N 32.0409）、江蘇東臺(tái)（E 120.6163、N 32.8414）、山西運(yùn)城（E 111.6323、N 35.5174）、新疆奎屯（E 84.9149、N 44.4169）等地的38 份甜葉菊品系葉片為材料。

1.2 材料的處理

所有葉片在日光下曬干后于80℃烘箱中烘干過(guò)夜，參照羅慶云[3]等方法準(zhǔn)備樣品，備用。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品

甜菊糖苷標(biāo)準(zhǔn)品瑞鮑迪苷D（Rebaudioside D,RD）、瑞鮑迪苷M（Rebaudioside M,RM）、瑞鮑迪苷A（Rebaudioside A,RA）、甜菊苷（Stevioside,STV）、瑞鮑迪苷F（Rebaudioside F,RF）、瑞鮑迪苷C（Rebaudioside C,RC）、杜克苷A（Dulcoside A,DA）、甜茶苷（Rubusoside,Rub）、瑞鮑迪苷B（Rebaudioside B,RB）和雙糖苷（Steviolbioside,SB）等標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于ChromaDex，用含30%（v/v）乙腈的水溶液溶解。

1.4 甜菊糖苷的液質(zhì)聯(lián)用分析器材及方法

分析儀器：液質(zhì)聯(lián)用儀Agilent 1260 UPLC-DAD-6530 ESI-QTOF MS。

質(zhì)譜條件為：離子源為電噴霧電離源，負(fù)離子掃描模式，霧化氣為純度99.9%氮?dú)?，碰撞氣為純?9.999%氮?dú)?，霧化氣壓力為50 psi，干燥氣溫度為350 ℃，干燥氮?dú)饬髁繛?0.0 L/min，毛細(xì)管電壓為3 500 V，Mass range 100～3 500 m/z，碰裂電壓170 V，Mass Hunter B0.05.00工作站。

分析耗材：色譜柱ACE Ultracore 2.5 Super C18柱（150 mm×4.6 mm,2.5 μm）（廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司）；甲酸（美國(guó)如意,LCMS級(jí)），乙腈（Tedia company Inc,absolv），去離子純化水。

1.5 液質(zhì)聯(lián)用分析數(shù)據(jù)的采集、匹配和整理用軟件的編寫(xiě)

為便于相關(guān)人員的使用和升級(jí)，使用VB6.0語(yǔ)言，依照人為處理/判斷模式擬人化地設(shè)計(jì)解決方案。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜葉菊葉各組分分離體系的建立

對(duì)目標(biāo)器官所含化合物的鑒別及含量測(cè)定是植物化學(xué)形態(tài)學(xué)分析體系確立的基礎(chǔ)，包括本研究所涉對(duì)象甜葉菊葉在內(nèi)的植物器官所含化學(xué)組分復(fù)雜（如，甜葉菊葉內(nèi)已檢出化合物達(dá)1 000 種以上），常采用的HPLC-UV 檢測(cè)體系因其只能檢測(cè)對(duì)紫外有吸收的化合物且僅以保留時(shí)間來(lái)定性各化合物，信息采集少、化合物鑒別效率低。為充分利用化合物相關(guān)信息、提高檢出能力、實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)器官所含化合物的全面評(píng)估，化學(xué)形態(tài)學(xué)分析體系的建設(shè)宜采用定性范圍廣、相對(duì)定量準(zhǔn)確的LC-MS技術(shù)。在LC-MS技術(shù)支持下，可通過(guò)碎片離子、分子離子、雙分子離子、加和化合物離子等的m/z值信息相對(duì)全面地表征各化合物。LC-MS 技術(shù)對(duì)各化合物的定性鑒別以高效液相技術(shù)對(duì)各化合物的有效分離為支撐，為此我們首先對(duì)適宜于LC-MS技術(shù)的甜葉菊葉各組分UPLC分離體系進(jìn)行了探討。

由于磷酸鹽緩沖體系不適用于質(zhì)譜檢測(cè)儀，本研究以甲酸為pH調(diào)節(jié)劑建立適宜于質(zhì)譜儀的甜葉菊葉組分分析的UPLC分離體系。研究結(jié)果表明，在以ACE Ultracore 2.5 Super C18柱（150 mm×4.6 mm,2.5 μm）為固定相、含0.1%（v/v）甲酸（A）的純凈水和乙腈（B）為流動(dòng)相條件下，實(shí)現(xiàn)甜葉菊葉各組分有效分離的洗脫梯度條件為：0 min 22.0%B；7.0 min 26.5%B；12.0 min 26.5%B；15.0 min 38.0%B；19.0 min 100%B；22.0 min 100%B；22.01 min 22.0%B。其他相關(guān)條件為：進(jìn)樣量5 μL、柱溫50℃、流動(dòng)相流速1.5 mL/min，并用分流器將進(jìn)入檢測(cè)系統(tǒng)的流速調(diào)整為0.5 mL/min、二極管陣列檢測(cè)器（DAD）檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

基于前述方法，初步建立了利用LC-MS 的甜葉菊葉所含化學(xué)組分的分離檢測(cè)體系。圖1 為基于前述檢測(cè)體系的本室自育‘1351’甜葉菊品系葉內(nèi)所含化合物的總離子流（TIC）圖譜。其中保留時(shí)間（tR）=6.4 min左右處的最高峰所示化合物為當(dāng)前所開(kāi)發(fā)的口感最接近蔗糖的甜菊糖苷RM，tR=5.6 min 左右處的最高峰所示化合物為甜葉菊葉內(nèi)另一口感相對(duì)較好的甜菊糖苷RD，tR=11.2 min左右處的最高峰所示化合物為甜葉菊體內(nèi)含量高但口感一般的甜菊糖苷RA和STV。

圖1 甜葉菊葉LC-MS檢出化合物總離子流（TIC）圖示例Fig.1 Total ion current(TIC)of extracted chemical materials of stevia leaf

對(duì)2018 年檢測(cè)的208 份材料及2019 年新增檢測(cè)的38 份材料的聯(lián)合分析表明，在上述分離條件下，在1.0～5.0 min、15～20 min、23.5～24.0 min 三個(gè)tR段內(nèi)檢出化合物種類較多，多達(dá)150～450種/min（見(jiàn)圖2），出現(xiàn)信號(hào)擁擠，這為基于tR、碎片及分子離子峰m/z的化合物定性帶來(lái)不便。后續(xù)分析結(jié)果表明，為實(shí)現(xiàn)對(duì)包括本研究所涉甜葉菊葉在內(nèi)的植物器官所含化合物的有效定性定量，實(shí)現(xiàn)對(duì)其化學(xué)形態(tài)學(xué)性狀的準(zhǔn)確評(píng)估，目標(biāo)器官所含化合物在各檢測(cè)時(shí)間段內(nèi)應(yīng)分布均勻且每分鐘檢出化合物數(shù)應(yīng)介于30～50種。

圖2 各tR段內(nèi)甜葉菊葉所含化合物檢出數(shù)分布情況（種/min）Fig.2 Distribution of compounds in stevia leaves in different retention periods(kinds per minute)

2.2 植物化學(xué)形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)采集分析所面臨的挑戰(zhàn)

除嚴(yán)格自交、無(wú)性繁殖及人工雜交制種材料外，自然界分布的多為雜交的野生資源，單株間遺傳變異大。植物種內(nèi)各化學(xué)變種、化學(xué)型及化學(xué)宗等種下等級(jí)的分類研究，多涉及不同地區(qū)、不同居群和不同生育期樣品的分析，因目標(biāo)器官所含化合物的有無(wú)及含量高低受外界環(huán)境影響大，由目標(biāo)器官所含化合物構(gòu)成的化學(xué)形態(tài)學(xué)性狀多表現(xiàn)為受微效多基因控制的低遺傳力性狀，要求單株取樣、單株分析[1]，為提高分析結(jié)果可靠性，還應(yīng)在對(duì)各單株進(jìn)行無(wú)性繁殖的基礎(chǔ)上重復(fù)采樣，需分析材料多，為便于植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究工作的有效開(kāi)展，有必要建立一種可對(duì)大批量樣品的化學(xué)形態(tài)學(xué)信息進(jìn)行快速且準(zhǔn)確的采集手段，這存在下述3方面挑戰(zhàn)（下面以本文所涉材料甜葉菊葉為例進(jìn)行闡述）：

2.2.1 目標(biāo)器官所含化合物種類繁多，各化合物間有效分離受限

圖3 示為甜葉菊品系“1351”葉片樣品檢測(cè)時(shí)，tR介于13.0～17.2 min 間各化合物的分離情況。為進(jìn)行有效積分，理論上應(yīng)實(shí)現(xiàn)基線分離，從圖3 可以看出，即便在化合物分布密度適中的13.0～15.0 min 間，化合物間也存在重疊，受化學(xué)形態(tài)學(xué)研究所需考察大批量樣品及目標(biāo)器官所含化合物種類繁多等特點(diǎn)影響，不可能將所有化合物一一分開(kāi)，需建立一種允許化合物間存在一定重疊的化合物信息采集方法。

圖3 甜葉菊品系‘1351’葉樣品LC-MS檢測(cè)時(shí)各化合物分離情況Fig.3 Separation of leaf compounds of stevia line of"1351"in detection of LC-MS

2.2.2 樣品間各化合物保留時(shí)間的不規(guī)則漂移，各化合物相關(guān)信息提取受限

圖4示2018年利用同一色譜柱、同批流動(dòng)相、在同一LC-MS儀器上所檢測(cè)的208個(gè)甜葉菊品系葉片所含化合物tR漂移情況。各樣品檢出圖譜間存在不規(guī)則的tR漂移，與參照樣品檢出圖譜相比，在同一個(gè)樣品中，在一部分區(qū)段內(nèi)tR提前而在另一區(qū)段內(nèi)tR延后，這對(duì)基于幾個(gè)參照化合物的tR來(lái)計(jì)算一個(gè)固定漂移時(shí)間從而對(duì)各材料檢測(cè)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的分析策略形成了挑戰(zhàn)。

圖4 甜葉菊葉樣品間各化合物tR漂移情況Fig.4 Drift of retention times of compounds from leaves samples of different stevia lines

2.2.3 材料間及樣品內(nèi)化合物含量波動(dòng)幅度大，化合物定性信息豐度不一

由于不同地區(qū)、不同居群和不同生育期樣品間化合物的含量差異大，同一化合物在不同材料間及同一樣品內(nèi)不同化合物間含量相差可達(dá)10～100倍以上，使LC-MS 檢測(cè)中可用于化合物鑒定的碎片離子信息豐度不一，有的化合物碎片離子信息多（圖5A 所示），有的化合物碎片離子信息少（圖5B 所示），結(jié)合前述樣品間各化合物tR的不規(guī)則漂移，這對(duì)基于tR和碎片離子m/z信息的各化合物定性鑒別構(gòu)成了挑戰(zhàn)。

圖5 甜葉菊葉樣品間及樣品內(nèi)各化合物定性用碎片離子信息量差異情況Fig.5 Differences of abundance of fragment ions used for qualitative analysis of compounds in leaves samples of the same and different sevia lines

2.3 植物化學(xué)形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)采集分析對(duì)策

開(kāi)展植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究，種內(nèi)各化學(xué)變種、化學(xué)型及化學(xué)宗所屬材料目標(biāo)器官所含化合物的準(zhǔn)確定性及相對(duì)含量的有效確定是基礎(chǔ)。包括甜葉菊葉在內(nèi)各植物材料所含化合物L(fēng)C-MS數(shù)據(jù)信息豐富，為化合物的定性和定量帶來(lái)了便利，但也為這些信息的歸類整理及分析帶來(lái)不便，人為整理枯燥易錯(cuò)，若能利用計(jì)算機(jī)軟件來(lái)輔助歸類整理植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究所涉海量信息，為數(shù)據(jù)分析提供便利，必將促進(jìn)植物化學(xué)形態(tài)學(xué)學(xué)科發(fā)展。為此，本研究以甜葉菊葉樣品LC-MS數(shù)據(jù)的歸類整理為例建立了植物化學(xué)形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)的采集整理軟件。

2.3.1 植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究LC-MS數(shù)據(jù)的采集

由于樣品所含化合物離子信息極為豐富，為實(shí)現(xiàn)對(duì)其快速準(zhǔn)確提取，以VB 語(yǔ)言為工具，編寫(xiě)了LC-MS 數(shù)據(jù)信息提取系統(tǒng)《LC-MS 數(shù)據(jù)采集匹配輸出助手》（見(jiàn)圖6），該軟件可幫助研究人員對(duì)各化合物離子信息進(jìn)行采集并輸出到Excel 表中，避免手工采集時(shí)因枯燥而導(dǎo)致的錯(cuò)漏，提高工作效率，確保數(shù)據(jù)采集準(zhǔn)確。

圖6 軟件《LC-MS數(shù)據(jù)采集匹配輸出助手》使用界面Fig.6 Interface of the software of LC-MS data collection,matching and output

2.3.2 植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究LC-MS數(shù)據(jù)的整理

進(jìn)行植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究需面對(duì)大量的、化學(xué)組分各異的樣品。為探討目標(biāo)器官內(nèi)化合物的形成、積累及轉(zhuǎn)化機(jī)制，揭示亞種、變種及變型間分化的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，為種內(nèi)各化學(xué)變種、化學(xué)型及化學(xué)宗的分類提供依據(jù)，材料間相關(guān)化合物的有無(wú)及含量高低等信息是植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究得以實(shí)施的基礎(chǔ)。在前述各樣品所含化合物離子信息采集基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)對(duì)大批量樣品所含化學(xué)組分的快速、準(zhǔn)確定性是植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究面臨的關(guān)鍵點(diǎn)。為實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)，以VB語(yǔ)言為工具，編寫(xiě)的基于LC-MS數(shù)據(jù)信息的化合物高通量定性分類整理軟件系統(tǒng)——《LC-MS 檢出數(shù)據(jù)歸類整理及篩選系統(tǒng)》（見(jiàn)圖7）可幫助研究人員依照tR和碎片離子信息實(shí)現(xiàn)對(duì)各樣品所含化合物的碎片離子、衍生離子、分子離子、雙分子離子等信息的整理，有助于實(shí)現(xiàn)各化合物的準(zhǔn)確定性及后續(xù)定量。

圖7 軟件《LC-MS檢出數(shù)據(jù)歸類整理及篩選系統(tǒng)》使用界面Fig.7 Interface of the software of sorting and screening system of LC-MS detected data

分析結(jié)果表明，材料間化合物種類的差異是開(kāi)展化學(xué)形態(tài)學(xué)研究必須面臨的挑戰(zhàn)之一。如，在編號(hào)‘1351’的甜葉菊品系葉片中共檢出1 003 種化合物、而在編號(hào)‘1353’的甜葉菊品系葉片中僅檢出466種化合物（見(jiàn)圖8）。

圖8 甜葉菊品系‘1351’和‘1353’葉中檢出化合物種類差異比較Fig.8 Difference of detected compounds in leaves of stevia lines of"1351"and"1353"

2.3.3 植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究LC-MS檢出化合物的歸類

對(duì)各化合物的定性/歸類是植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究的基礎(chǔ)。研究結(jié)果表明，在LC-MS條件下，無(wú)論其含量高低、各類化合物都有一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的主峰（最大峰面積峰）和次峰（第二大峰面積峰），結(jié)合這兩種特征峰及tR等信息可較好地實(shí)現(xiàn)對(duì)各化合物的定性/歸類。對(duì)此，經(jīng)過(guò)前述軟件的歸類整理，以當(dāng)前LC-MS 方法檢出化合物種類最豐富、編號(hào)‘1351’甜葉菊品系葉片所檢出1 003種化合物的tR及相關(guān)化合物的離子信息為參照實(shí)現(xiàn)對(duì)編號(hào)‘1349’的甜葉菊品系葉片所檢出954 種化合物中939 種化合物的匹配鑒定（見(jiàn)圖9）。進(jìn)一步分析表明，模糊匹配者多因化合物離子信息不充分所致，可通過(guò)調(diào)整化合物碎片信息采集量來(lái)增強(qiáng)化合物匹配度。

圖9 利用《LC-MS檢出數(shù)據(jù)歸類整理及篩選系統(tǒng)》軟件對(duì)‘1349’品系葉片檢出化合物匹配結(jié)果示例圖Fig.9 Example of matching and sorting output of detected compounds in leaves of line"1349"by software"Sorting and Screening System of LC-MS Detected Data"

2.3.4 植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究LC-MS檢出化合物的定量

LC-MS 的質(zhì)量分析器包括四極桿、離子阱、軌道阱、飛行時(shí)間和傅里葉變換等，因植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究要求對(duì)目標(biāo)器官所含化合物全面表征，所面臨化學(xué)組分復(fù)雜，相對(duì)其他質(zhì)譜分析方法，Q-TOF的使用成本相對(duì)低、可檢測(cè)質(zhì)量范圍寬、分子量測(cè)定精確度高，可為植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究所采用[4-5]。

在定量分析方法上，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)技術(shù)（Multiple Reaction Monitoring，MRM）代表的定量分析方法雖具靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)等特點(diǎn)，但其不足之處在于：（1）只能檢測(cè)已知m/z的化合物，無(wú)法滿足植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究對(duì)目標(biāo)器官所含未知化合物的表征[6-7]；（2）在樣品體系中，因各待檢化合物易與提取溶劑或流動(dòng)相各組分發(fā)生加成反應(yīng)生成各種加和離子，濃度高者還會(huì)形成雙分子離子，由于同一化合物在各樣品間濃度差異大，導(dǎo)致各待檢化合物存在形式中包括分子離子峰在內(nèi)的各離子所占比例波動(dòng)幅度大，如表1 所示，LC-Q-TOF檢測(cè)體系中，各品系甜葉菊葉所含RA等4種代表性甜菊糖苷的分子離子峰檢出峰面積占各化合物對(duì)應(yīng)檢出離子峰總面積的相對(duì)百分比波動(dòng)明顯，表明只利用包括分子離子峰在內(nèi)的一種或幾種離子來(lái)表征化合物含量的策略所得數(shù)據(jù)可靠性差。

表1 LC-Q-TOF 檢測(cè)各甜葉菊葉樣品所含4 種代表性甜菊糖苷的分子離子峰檢出面積占比波動(dòng)情況Table 1 Fluctuation of area ratio of molecular ion peak of 4 representative steviol glycosides in stevia leaf detected by LC-Q-TOF

為此，在植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究中，為實(shí)現(xiàn)對(duì)LC-MS 各檢出化合物的有效定量，應(yīng)對(duì)其各加和離子、分子離子、雙分子離子、質(zhì)荷比大于等于M/2的碎片離子等進(jìn)行聯(lián)合計(jì)算，以實(shí)現(xiàn)對(duì)各化合物含量相對(duì)準(zhǔn)確的定量。

3 討論

3.1 植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究對(duì)植物化學(xué)分類學(xué)研究的推動(dòng)作用

在對(duì)目標(biāo)器官所含化合物全貌進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)種內(nèi)各化學(xué)變種、化學(xué)型及化學(xué)宗所屬株系目標(biāo)器官所含化合物的系統(tǒng)分析，解析各化合物間存在的有機(jī)聯(lián)系，明確推動(dòng)種內(nèi)化學(xué)變種、化學(xué)型及化學(xué)宗分化的關(guān)鍵化合物，有助于推動(dòng)種內(nèi)化學(xué)變種、化學(xué)型及化學(xué)宗分化的分子基礎(chǔ)研究，促進(jìn)植物化學(xué)分類學(xué)與分子遺傳學(xué)研究的結(jié)合。

3.2 植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究對(duì)于作物品質(zhì)提升之必要性

植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究是對(duì)目標(biāo)器官所含化合物的全面評(píng)價(jià)，有利于促進(jìn)植物種質(zhì)評(píng)價(jià)、目標(biāo)化合物合成通路解析、收獲器官品質(zhì)育種和栽培措施確定，為植物收獲器官所含化合物的分類、評(píng)價(jià)、改良和利用研究提供依據(jù)，對(duì)植物產(chǎn)品品質(zhì)改良意義明顯。

3.3 將本類研究定名為植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究的原因

在對(duì)植物特定器官所含化合物的分離鑒定中，其所含化合物因理化性質(zhì)差異tR不同。在特定的固定相和流動(dòng)相條件下，各化合物出現(xiàn)在不同tR節(jié)點(diǎn)上，最終不同tR段內(nèi)各化合物的分離色譜呈現(xiàn)出以tR軸為樹(shù)干的類似于根冠、枝條和樹(shù)冠一樣的圖譜，將各tR段類比于由根到冠不同部位，各tR段內(nèi)檢出化合物的多少類比于根冠、枝條和樹(shù)冠形態(tài)的復(fù)雜度，各tR段檢出化合物間的相關(guān)性類比于樹(shù)各部位性狀間的關(guān)聯(lián)性。這種將植物特定器官所含化合物在一定分離檢測(cè)體系下所呈現(xiàn)出的類似于一棵樹(shù)的由下向上形態(tài)上的類比有利于研究人員對(duì)種內(nèi)各化學(xué)變種、化學(xué)型及化學(xué)宗間目標(biāo)器官所含化合物在質(zhì)和量上的差異形成一個(gè)直觀印象，有利于化學(xué)分類及遺傳改良工作的開(kāi)展。為此，我們將這種植物特定器官所含化合物在一定分離體系下所呈現(xiàn)出的類似于一棵樹(shù)的由下向上的“樹(shù)形圖”定名為植物化學(xué)形態(tài)（見(jiàn)圖10），是對(duì)植物特定器官所含檢出化合物的統(tǒng)稱。

圖10 同一LC-Q-TOF監(jiān)測(cè)體系下3個(gè)代表性品系甜葉菊葉檢出化合物總離子流（TIC）圖多樣性Fig.10 Diversity of total ion current(TIC)diagrams of detected compounds in leaves of 3 representative stevia lines under same LC-Q-TOF detection system

3.4 植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究與其他研究之間的區(qū)別和聯(lián)系

植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究著眼于種內(nèi)各化學(xué)變種、化學(xué)型及化學(xué)宗所屬植株目標(biāo)器官所含化合物信息的全面提取、分析和比較，這是與其他研究區(qū)別的本質(zhì)之所在。

在概念上與植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究易混淆的是有研究者將基于組織化學(xué)（Histochemistry）定位的研究稱為化學(xué)形態(tài)學(xué)研究（Chemomorphology）[8]。后者為在組織或細(xì)胞水平，對(duì)某種（類）物質(zhì)在其內(nèi)的存在性或移動(dòng)性進(jìn)行定性、定量分析，將該類研究定義為組織化學(xué)定位研究較為確切，其研究目標(biāo)在于明確相應(yīng)組織或細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)化合物的存在性，其敏感性低、假陽(yáng)性高，且其研究對(duì)象多為一種或少數(shù)幾種化合物，無(wú)法從整體上揭示各化合物間的有機(jī)聯(lián)系，與基于色譜分離技術(shù)的植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究間差異明顯，現(xiàn)多應(yīng)用于酶等有催化活性蛋白的存在性檢測(cè)。

在研究方法上與植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究最接近的為植物代謝組學(xué)研究[9-12]。植物代謝組學(xué)是對(duì)植物的某一組織或細(xì)胞在特定生理?xiàng)l件下所含代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析的一門學(xué)科，其多著眼于組織細(xì)胞等微觀對(duì)象。由于化合物在細(xì)胞、組織及器官間存在轉(zhuǎn)運(yùn)，植物化學(xué)形態(tài)學(xué)分析著眼于器官等宏觀對(duì)象，對(duì)以收獲器官所含特定化合物為評(píng)價(jià)指標(biāo)的作物品質(zhì)育種及栽培管理更具指導(dǎo)意義。

在表現(xiàn)方式上與植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究最接近的為指紋圖譜和特征圖譜研究。指紋圖譜和特征圖譜研究為產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性評(píng)估研究，指紋圖譜強(qiáng)調(diào)對(duì)各批次產(chǎn)品間所含化合物的共同性和相似性進(jìn)行表征，特征圖譜強(qiáng)調(diào)對(duì)各批次產(chǎn)品間一種或幾種化合物的一致性進(jìn)行表征，兩者都是對(duì)各產(chǎn)品所含化合物信息的部分提取，無(wú)全面表征要求[13-15]。而植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究是對(duì)目標(biāo)器官所含化合物的全面表征，全面分析種內(nèi)各化學(xué)變種、化學(xué)型及化學(xué)宗所屬各單株目標(biāo)器官所含化合物在質(zhì)和量上的不同，即，植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究要求對(duì)各單株目標(biāo)器官所含化合物進(jìn)行全面表征，其對(duì)研究體系的穩(wěn)定性和可靠性要求更高。

3.5 植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究對(duì)各化合物結(jié)構(gòu)解析的要求分析

植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究對(duì)各化合物結(jié)構(gòu)解析的要求具階段性。在研究初期，植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究的主要任務(wù)為：（1）分析種下各化學(xué)變種、化學(xué)型及化學(xué)宗所屬各單株系目標(biāo)器官所含化合物在質(zhì)和量上的差異，明確在各化學(xué)變種、化學(xué)型及化學(xué)宗分化過(guò)程中具有分類意義的一種或一組化合物；（2）分析各化合物間的轉(zhuǎn)化關(guān)系，明確與目標(biāo)化合物的形成、積累及轉(zhuǎn)化密切相關(guān)的化合物。在此階段，植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究對(duì)各化合物結(jié)構(gòu)信息的需求度不高。在明晰前述兩類關(guān)鍵化合物的基礎(chǔ)上，隨著植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究的深入，可將薄層色譜（TLC）、氣相色譜（GC）、高效液相色譜（HPLC）等色譜法與紅外光譜（IR）、紫外光譜（UV）、質(zhì)譜（MS）、核磁共振（NMR）及X 衍射等光譜法結(jié)合，對(duì)該兩類化合物進(jìn)行追蹤、分離、純化、鑒定和結(jié)構(gòu)解析，在此基礎(chǔ)上分析各化合物間的轉(zhuǎn)化機(jī)制。簡(jiǎn)言之，植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究初期的重點(diǎn)在于解析各化合物之間的關(guān)聯(lián)性，不需要明確其結(jié)構(gòu)信息，在此基礎(chǔ)上，再對(duì)關(guān)鍵化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。

3.6 植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究對(duì)各化合物定量的要求分析

植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究對(duì)各化合物的定量要求也具階段性。在研究初期，植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究的主要任務(wù)為：（1）明確材料間各化合物的有無(wú)及相對(duì)含量高低；（2）解析各化合物間的轉(zhuǎn)化關(guān)系。在此階段，對(duì)各化合物含量進(jìn)行相對(duì)定量即可。當(dāng)在種內(nèi)分化上起關(guān)鍵作用或與目標(biāo)化合物的形成和積累密切相關(guān)化合物確定后，隨著植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究的深入，可分離制備該類關(guān)鍵化合物標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)其在關(guān)鍵材料內(nèi)的絕對(duì)含量進(jìn)行標(biāo)定。

3.7 液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)在植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究中的優(yōu)勢(shì)分析

為實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)器官所含化合物的全面解析，色譜技術(shù)是必須依賴的技術(shù)，而質(zhì)譜技術(shù)因可提供化合物分子量、化學(xué)基團(tuán)等相關(guān)信息，也作為植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究的一個(gè)關(guān)鍵技術(shù)。氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）和液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)是目前發(fā)展較為成熟的色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。GC-MS 是最早商品化的聯(lián)用儀器，其優(yōu)點(diǎn)在于有標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)可比對(duì)，方便解析化合物的種類，其不足之處在于只能分析熱穩(wěn)定高、能氣化的揮發(fā)性小分子化合物。LC-MS應(yīng)用面廣，可檢測(cè)非揮發(fā)性化合物、極性化合物、熱不穩(wěn)定化合物、大分子量化合物等，但是由于多沒(méi)有商品化的譜庫(kù)可查詢，只能自己建庫(kù)或自己解析譜圖。在植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究的早期階段，其重點(diǎn)在于解析化合物間的關(guān)聯(lián)性，不需要明確其具體結(jié)構(gòu)信息，可利用LC-MS可分析化合物種類多的特點(diǎn)，盡量全面地解析目標(biāo)器官所含化合物[4]，為此，在本研究案例中，我們以液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)作為植物化學(xué)形態(tài)學(xué)分析體系建設(shè)的基本技術(shù)，寄此建立植物化學(xué)形態(tài)學(xué)分析體系，為植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究提供支撐。

3.8 植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究的可能表現(xiàn)形式

植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究是對(duì)目標(biāo)器官所含化合物的全面分析，該類研究的表現(xiàn)形式有：

（1）當(dāng)所使用材料包括種內(nèi)各化學(xué)變種、化學(xué)型及化學(xué)宗所屬株系，豐富度及差異代表性足夠時(shí)，有助于解明推動(dòng)種內(nèi)各化學(xué)變種、化學(xué)型及化學(xué)宗分化的關(guān)鍵化合物，為進(jìn)一步開(kāi)展推動(dòng)種內(nèi)化學(xué)變種、化學(xué)型及化學(xué)宗分化的分子基礎(chǔ)研究，促進(jìn)植物化學(xué)分類學(xué)研究與分子生物學(xué)及分子遺傳學(xué)研究的結(jié)合提供依據(jù)。

（2）當(dāng)所使用材料對(duì)種內(nèi)各化學(xué)變種、化學(xué)型及化學(xué)宗代表性足夠時(shí)，有助于解析各化合物間的關(guān)聯(lián)性、相互轉(zhuǎn)化關(guān)系、明確與目標(biāo)化合物的形成、積累及轉(zhuǎn)化相關(guān)的化合物，為結(jié)合各組學(xué)手段解析目標(biāo)化合物形成、積累及轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制提供依據(jù)。

（3）同樣地，當(dāng)所使用材料對(duì)種內(nèi)各化學(xué)變種、化學(xué)型及化學(xué)宗的代表性足夠時(shí)，在明確化合物間關(guān)聯(lián)性及相互轉(zhuǎn)化關(guān)系基礎(chǔ)上，可有效評(píng)價(jià)各材料用作提高有用化合物含量或降低有害化合物含量育種親本的可行性，促進(jìn)作物品質(zhì)育種核心種質(zhì)資源庫(kù)建設(shè)，促進(jìn)作物收獲器官所含化合物改良。

（4）當(dāng)所使用材料的區(qū)域代表性和田間栽培措施差異度足夠大時(shí)，可進(jìn)一步分析土壤及田間栽培措施對(duì)收獲器官所含化合物品質(zhì)性狀的影響，為適宜產(chǎn)地及有效栽培措施的確定提供依據(jù)。

從上述分析可以看出，植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究對(duì)目標(biāo)器官所含化合物的全面分析，有助于有效解析各化合物間相互轉(zhuǎn)化關(guān)系，在促進(jìn)植物化學(xué)分類學(xué)發(fā)展、目標(biāo)化合物次生代謝途徑解明、作物品質(zhì)育種核心種質(zhì)庫(kù)建設(shè)、作物品質(zhì)育種親本評(píng)價(jià)和作物栽培措施評(píng)估等方面具有廣泛應(yīng)用場(chǎng)景。

4 結(jié)論

植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究是對(duì)目標(biāo)器官所含化合物的全面解析，探討化合物形成、積累、轉(zhuǎn)化機(jī)制，揭示種內(nèi)亞種、變種及變型分化物質(zhì)基礎(chǔ)，是以特定部位所含化合物為關(guān)注對(duì)象的作物品質(zhì)改良和栽培管理的前提條件。但是，由于自然界分布的多為自交不親和的雜交資源，單株間遺傳變異大，且所含化合物的有無(wú)及含量高低受外界環(huán)境影響大，要求進(jìn)行單株取樣、單株分析，為便于植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究工作的有效開(kāi)展，應(yīng)建立一種可對(duì)大批量樣品化學(xué)形態(tài)信息進(jìn)行快速準(zhǔn)確采集的手段。

相比HPLC-UV 等檢測(cè)體系，LC-MS 具有定性范圍廣、相對(duì)定量準(zhǔn)確等特點(diǎn)，可充分利用化合物相關(guān)信息提高檢出能力，實(shí)現(xiàn)對(duì)植物器官所含化合物進(jìn)行全面評(píng)估。但LC-MS 檢出信息的有效利用存在3方面挑戰(zhàn)：（1）目標(biāo)器官所含化合物種類繁多，化合物間有效分離受限；（2）多樣品間各化合物保留時(shí)間不規(guī)則漂移；（3）材料間及樣品內(nèi)各化合物含量波動(dòng)幅度大，化合物定性信息豐度不一。

對(duì)此，本研究利用Visual Basic 編程語(yǔ)言，初步建成植物器官所含化合物L(fēng)C-MS 分析數(shù)據(jù)的采集、整理、定性和定量分析系統(tǒng)，為以甜葉菊為代表的作物品質(zhì)育種及作物收獲器官化學(xué)形態(tài)學(xué)研究提供分析工具。該分析系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)對(duì)LC-MS 檢出數(shù)據(jù)的全面提取，促進(jìn)對(duì)目標(biāo)器官所含化合物的全面分析，有利于高效解析各化合物間的相互轉(zhuǎn)化關(guān)系，促進(jìn)植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究在植物化學(xué)分類學(xué)發(fā)展、目標(biāo)化合物次生代謝途徑解明、作物品質(zhì)育種核心種質(zhì)庫(kù)建設(shè)、作物品質(zhì)育種親本評(píng)價(jià)和作物栽培措施評(píng)估等方面的應(yīng)用。