大菱鲆趨化因子CCL34基因的鑒定及其響應(yīng)細(xì)菌感染的表達(dá)特征?

宋歡歡， 張 羽， 張 佩， 李雨晴， 趙壽聰， 李 超， 傅 強(qiáng)

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院， 山東 青島 266109)

免疫系統(tǒng)為生物體抵御外來致病微生物提供了一種有效的防御機(jī)制。魚類在進(jìn)化上是介于僅具有天然免疫系統(tǒng)動(dòng)物和主要依賴獲得性免疫系統(tǒng)動(dòng)物的中間類群[1]。相對(duì)于哺乳動(dòng)物，魚類在抵御外來病原微生物侵?jǐn)_時(shí)，先天性免疫系統(tǒng)發(fā)揮主要作用且?guī)缀醪皇軠囟鹊挠绊慬2]。研究表示，魚類具有一個(gè)包含信號(hào)分子、細(xì)胞因子和趨化因子的網(wǎng)絡(luò)，從而能夠控制和調(diào)節(jié)先天性和獲得性免疫[3]。當(dāng)受到致病因子刺激活化后，淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等會(huì)分泌一種小分子活性多肽物質(zhì)，分子量約8～14 kDa，含90～100個(gè)氨基酸，此即為趨化因子[4-5]。它們能夠促進(jìn)白細(xì)胞遷移到感染部位[6]，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和細(xì)胞分化，是關(guān)鍵的免疫調(diào)節(jié)因子，充當(dāng)天然免疫和適應(yīng)性免疫之間的橋梁[7]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)趨化因子參與了多種機(jī)體反應(yīng)活動(dòng), 如炎癥反應(yīng)、細(xì)胞間通訊、抗原呈遞、血細(xì)胞發(fā)育和轉(zhuǎn)移及病毒侵染和傷口愈合等[8-11]。除了在免疫中發(fā)揮作用，它們還參與血管再生[12]，神經(jīng)發(fā)育[13]，器官發(fā)生[14]與生殖細(xì)胞遷移和正常生長發(fā)育[15]。大多數(shù)趨化因子含有四個(gè)保守的半胱氨酸殘基，根據(jù)前兩個(gè)半胱氨酸殘基的位置，將趨化因子分為四個(gè)亞族：CC、CXC、C和CX3C，其中CC是最大的亞族[16]。

近年來，魚類中很多趨化因子被分離和鑒定出來，大多數(shù)魚類的趨化因子基因在免疫器官或組織如頭腎、脾臟中表達(dá)水平較高，推測它們在先天免疫中發(fā)揮作用[17]。最近幾年對(duì)魚類趨化因子CXC型和CC型進(jìn)行了大量的研究，然而對(duì)于魚類趨化因子基因功能的研究尚未成熟。魚類中第一個(gè)被鑒定的 CC 型趨化因子是虹鱒魚(Oncorhynchussmykiss)的 CK-1[18]，從虹鱒魚中鑒定出來的CC型趨化因子CK1和CK2在炎癥反應(yīng)中起一定的作用。目前為止，大西洋鱈魚(Gadusmorhua)[19]、虹鱒魚(O.mykiss)[19]、金頭鯛(Sparusaurata)[20]和大黃魚(Larimichthyscrocea)[21-22]中鑒定出很多 CC 型趨化因子。目前比較系統(tǒng)全面的趨化因子鑒定發(fā)現(xiàn)斑馬魚有62個(gè)CC趨化因子[10-11]，斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluruspunctatas)有64個(gè)CC趨化因子[23-25]。在已發(fā)現(xiàn)的35種CC趨化因子中，有8種僅在魚類中有報(bào)道[25]，分別是CCL32、CCL33、CCL34、CCL35、CCL36、CCL38、CCL39和CCL44。到目前, 在大菱鲆(S.maximus)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了3個(gè)CXC趨化因子, 3個(gè)CC趨化因子和3個(gè)趨化因子受體CCR3、CCR9和 CXCR4[26-32]。

大菱鲆是一種重要的低溫適應(yīng)冷水性海水養(yǎng)殖魚類，在過去的十年里，中國養(yǎng)殖年平均產(chǎn)量為5×104～6×104t，約占世界水產(chǎn)養(yǎng)殖大菱鲆總產(chǎn)量的80%[33]。其生長迅速，肉質(zhì)好，耐低溫，因此能夠迅速得到產(chǎn)業(yè)化推廣。然而，隨著大菱鲆養(yǎng)殖集約化程度不斷提高、養(yǎng)殖密度不斷增大，大菱鲆病害頻發(fā)，各種病毒性疾病、細(xì)菌性疾病和寄生蟲病的報(bào)道日漸增多[34-36]。通常使用抗生素來防治疾病，但其具有強(qiáng)烈的副作用，會(huì)使病原菌產(chǎn)生耐藥性，同時(shí)引起環(huán)境污染。目前，分子生物學(xué)技術(shù)的興起，為增強(qiáng)養(yǎng)殖魚類的免疫力和提高抗病能力提供了新的手段。本研究從大菱鲆基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中鑒定出大菱鲆的一種趨化因子CCL34，同時(shí)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析和共線性分析，確定此趨化因子CC的分類地位。此外，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)，分析大菱鲆趨化因子CCL34在健康的大菱鲆組織及被鰻弧菌和無乳鏈球菌感染的大菱鲆腸道和皮膚組織中的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚

大菱鲆購自黃海所養(yǎng)殖基地，體重250～500 g，運(yùn)至青島農(nóng)業(yè)大學(xué)藍(lán)谷校區(qū)實(shí)驗(yàn)室喂養(yǎng)1個(gè)月，水溫16～20 ℃。取正常大菱鲆組織(皮膚，血液，肝臟，腸，鰓，脾臟，腦和頭腎)及被鰻弧菌和無乳鏈球菌分別感染的大菱鲆組織(皮膚和腸道)，立即放入液氮中凍存，然后保存在-80 ℃冰箱中，用于后續(xù)總RNA提取。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 序列鑒定 在NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、Ensemble (http://www.ensemble.org)和ZFIN(http://zfin.org/)中下載人(Homosapiens)、鼠(Musmusculus)、雞(Gallusgallus)、斑馬魚(Daniorerio)、斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)、河豚(Takifugurubripes)、日本青鳉(Oryziaslatipes)、羅非魚(Oreochromisniloticus)、牙鲆(Paralichthysolivaceus)等趨化因子CCL的mRNA序列和蛋白序列?；谕椿虻南嗨菩?，將這些序列放到已構(gòu)建的大菱鲆基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中blastn比對(duì)[37-38]，在此基礎(chǔ)上利用Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)去除初始序列中的重復(fù)序列，根據(jù)基因位置的唯一性和可信度初步篩選大菱鲆趨化因子CC。從大菱鲆轉(zhuǎn)錄組數(shù)庫中提取目標(biāo)cDNA序列，用ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預(yù)測目標(biāo)序列所編碼的蛋白序列，BLASTP比對(duì)NCBI的非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫。通過分子結(jié)構(gòu)分析工具SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1)確定序列的特征性功能結(jié)構(gòu)域，并通過BLASTP預(yù)測的保守結(jié)構(gòu)域?qū)ζ溥M(jìn)行驗(yàn)證。SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)網(wǎng)站用于分析目標(biāo)序列信號(hào)肽。其三維結(jié)構(gòu)由Phyre2 服務(wù)器建立(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)。為了確定表達(dá)蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)，使用STRING軟件11.0(https://string-db.org/cgi/input?sessionId=beUB0fx2FZid&input_page_active_form=single_sequence)，以0.4的置信度分析了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的網(wǎng)絡(luò)表達(dá)形式。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 參照從大菱鲆基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中提取的趨化因子CCL34cDNA序列，根據(jù)該趨化因子的開放閱讀框設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物(CCL34F/R，見表1)用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)來分析該趨化因子的表達(dá)，以大菱鲆cDNA為模板，PCR產(chǎn)物大小為183 bp。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物序列

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)生分析 利用分子進(jìn)化遺傳學(xué)分析(MEGA 7)軟件包對(duì)預(yù)測的大菱鲆趨化因子CCL34蛋白序列與在各種數(shù)據(jù)庫中搜索并下載下來的人、鼠、雞、斑馬魚、斑點(diǎn)叉尾鮰、河豚、日本青鳉、羅非魚、牙鲆等生物的趨化因子CCL蛋白序列一同構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，用Muscle 程序(通過對(duì)數(shù)預(yù)期進(jìn)行多序列比較)比對(duì)氨基酸序列同源性，數(shù)據(jù)分析采用泊松定理P選項(xiàng)，重復(fù)1 000次，計(jì)算方法為Maximum Likelihood，用自展內(nèi)部分支法來評(píng)定系統(tǒng)進(jìn)化樹的可靠性。

1.2.4 共線性分析 基于大菱鲆CCL34和斑馬魚，牙鲆的相鄰基因比較，共線性分析可進(jìn)一步確定目標(biāo)序列是大菱鲆趨化因子CCL34。通過FGENESH程序從大菱鲆基因組中預(yù)測CCL34相鄰基因的蛋白質(zhì)序列，通過BLASTP比對(duì)NCBI非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白質(zhì)序列，并用UniProt知識(shí)庫(https://www.uniprot.org/)進(jìn)行注釋。從Genomicus(http://www.genomicus.biologie.ens.fr/genomicus-94.01/cgi-bin/search.pl)網(wǎng)站中確定其他物種CCL34相鄰蛋白質(zhì)序列的保守共線性，共線性分析結(jié)果圖見圖3。

1.2.5 細(xì)菌感染及樣品收集 為了研究CCL34在宿主防御中的免疫作用，選擇革蘭氏陰性菌鰻弧菌(Vibrioanguillarum)和革蘭氏陽性菌無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)分別感染平均體重為250～500 g的大菱鲆。先進(jìn)行預(yù)感染，選擇有明顯癥狀的魚體，分離兩種菌，進(jìn)行生化鑒定。從單菌落中分離細(xì)菌，接種于LB肉湯培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)(28 ℃，180 r/min)。

選擇健康的大菱鲆在5×107CFU/mL濃度的鰻弧菌溶液中浸泡感染，分別在2、6、12、24 h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)解剖魚體，取皮膚、腸道組織。選擇健康的大菱鲆在5×106CFU/mL濃度的無乳鏈球菌溶液中浸泡感染，分別在2、4、8、12 h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)解剖魚體，取皮膚、腸道組織放入液氮中凍存，保存在-80 ℃冰箱中。

1.2.6 CCL34趨化因子的表達(dá)分析 從上述凍存的大菱鲆組織(1.1和1.2.5)中，用Trizol試劑提取總RNA。按照FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒(快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒)(Invitrogen, USA)的說明書進(jìn)行大菱鲆cDNA的合成，特異引物(CCL34F/R，見表1)用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)表達(dá)分析，以8種健康大菱鲆組織(肝臟，脾臟，頭腎，皮膚，腸，血液，鰓，腦)cDNA為PCR反應(yīng)模板，模板稀釋10倍，每種組織做3個(gè)平行樣，以18sRNA作為內(nèi)參基因。本研究采用的是 BIO-RAD CFX96熒光定量 PCR儀 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), 每次反應(yīng)均為10 μL 體系: TB Green Premix Ex Taq II 5 μL, 上下游引物各0.4 μL, cDNA模板0.8 μL。反應(yīng)條件采用三步法: 95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 32 s, 40 個(gè)循環(huán); 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 95 ℃ 15 s。

數(shù)據(jù)處理: 用Relative Expression Software Tool (REST)分析結(jié)果來捕獲P值<0.05的顯著性表達(dá)。用腸的Ct值(腸的Ct值最大，表達(dá)水平最低)作為對(duì)照來確定大菱鲆健康組織的基因表達(dá)模式；用大菱鲆健康組織(腸，皮膚)的Ct值作為對(duì)照來確定被鰻弧菌和無乳鏈球菌感染后不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)模式。采用2ΔΔCT方法計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)倍數(shù)變化。mRNA表達(dá)水平被標(biāo)準(zhǔn)化到同一樣本的18S RNA基因的表達(dá)水平。所有定量數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

2 結(jié)果

2.1 CCL34序列鑒定

該趨化因子的全長cDNA序列共885 bp，包括1個(gè)327 bp的5’非編碼區(qū)(UTR)，1個(gè)312 bp的開放閱讀框(ORF編碼103個(gè)氨基酸)和1個(gè)246 bp的3’非編碼區(qū)。成熟肽第31、32位為兩個(gè)靠在一起的半胱氨酸，該特征證明該趨化因子是CC趨化因子。通過基因組序列擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)該CCL34基因含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。其蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)(見圖1)與其它CC趨化因子一致，在N端附近有兩個(gè)保守的連續(xù)半胱氨酸殘基。

圖1 CCL34蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)

2.2 系統(tǒng)發(fā)生分析

用分子進(jìn)化遺傳學(xué)分析(MEGA7)軟件包對(duì)大菱鲆趨化因子CCL34構(gòu)建的進(jìn)化樹結(jié)果如圖2所示。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示出幾種魚類的CCL34分為兩支，一是與斑馬魚、斑點(diǎn)叉尾鮰CCL34a聚為一支，另一支則與斑馬魚、斑點(diǎn)叉尾鮰CCL34b聚為一支。通過圖2可以看出大菱鲆趨化因子CCL34和牙鲆先聚到一起，置信度是100，然后與斑馬魚和斑點(diǎn)叉尾鮰的CCL34a聚到一起，置信度是57，最終與斑馬魚和斑點(diǎn)叉尾鮰的CCL34b聚到一起，因此把該趨化因子命名為大菱鲆CCL34。

2.3 共線性分析和基因結(jié)構(gòu)分析

構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹初步鑒定了趨化因子CCL基因?yàn)榇罅怫亿吇蜃覥CL34基因，共線性分析將對(duì)CCL34基因的鑒定提供更加有力的證據(jù)。結(jié)果如圖3所示，大菱鲆趨化因子CCL34基因位于7號(hào)染色體上，其上游基因有tnr，下游基因有rbp1、prmt5、cdh24、rem2、ctnnd2b和astn1。大菱鲆趨化因子CCL34基因附近與牙鲆趨化因子CCL34a基因附近、斑馬魚趨化因子CCL34a.3、CCL34a.4基因附近共有的基因是tnr、rbp1、prmt5、cdh24、rem2、ctnnd2b和astn1。結(jié)果證明，從大菱鲆基因組數(shù)據(jù)庫blast比對(duì)預(yù)測的大菱鲆趨化因子CCL34基因，與斑馬魚、牙鲆、斑點(diǎn)叉尾鮰某些趨化因子CCL34基因親緣關(guān)系比較近，序列比較保守，進(jìn)一步鑒定了從數(shù)據(jù)庫中提取的大菱鲆趨化因子CCL基因可以命名為CCL34基因。

(分支上的數(shù)值代表 1 000 bootstrap 的置信度。GenBank 序列號(hào)在物種名右側(cè)列出。大菱鲆CCL34用“●”標(biāo)注。Numbers at branch nodes represent the confidence level of 1 000 bootstrap replications. The accession numbers of GenBank were shown on the right of species names. Turbot CCL34 were marked by “●”.)

(基因全稱Full gene names：ctnnd2b：Catenin (cadherin-associated protein), delta 2b；astn1：Astrotactin 1；tnr：Tenascin R；prmt5： Protein arginine N-methyltransferase 5；cdh24：Cadherin 24；rem2：RAS (RAD and GEM)-like GTP-binding 2；rbp1：Retinol binding protein 1b, cellular；CCL34a.3：Chemokine (C-C motif) ligand 34a, duplicate 3；CCL34a.4：Chemokine (C-C motif) ligand 34a, duplicate 4； CCL34：CC chemokine isoform 4。共線性分析所需序列信息通過NCBI和Ensembl網(wǎng)站獲取，相同顏色并用短線相連的方格代表同一種基因，趨化因子CCL34用黑色方格標(biāo)注。These syntenies were generated with the information obtained from the NCBI and Ensembl. Squares with same color and connected to represent the same gene. CCL34 are marked with black squares.)

2.4 大菱鲆趨化因子CCL34 在健康組織中的表達(dá)分析

利用qRT-PCR方法檢測大菱鲆趨化因子CCL34基因在健康組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)它在所檢驗(yàn)的健康組織中均普遍表達(dá)(見圖4)。以腸作為基準(zhǔn)，倍數(shù)為1倍，鰓的倍數(shù)為1.50，脾臟的倍數(shù)為2.70，血液的倍數(shù)為7.34，腦的倍數(shù)為44.57，皮膚的倍數(shù)為64.13，肝臟的倍數(shù)為233.85，腎臟的倍數(shù)為1 156.33。大菱鲆趨化因子CCL34基因在腎臟組織中表達(dá)水平最高，其次在大菱鲆肝臟中具有較高表達(dá)水平，大菱鲆趨化因子CCL34基因在皮膚、腦中表達(dá)水平處于中等，然后是在鰓、脾臟和血液中的表達(dá)量偏低，而在腸中表達(dá)量最低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明趨化因子CCL34基因在健康大菱鲆組織中普遍表達(dá)。

(以健康組織為對(duì)照組, 表示與對(duì)照組差異顯著 (p<0.05). Health tissue was chosen as the control group, donates significant compared with control (p<0.05).)

2.5 細(xì)菌感染后大菱鲆CCL34在腸和皮膚中的表達(dá)分析

在鰻弧菌感染后，CCL34在皮膚2 h內(nèi)，下調(diào)1.40倍，到6 h顯著下調(diào)4.41倍，到12 h顯著下調(diào)8.38倍，到24 h下調(diào)1.69倍。與皮膚不同，CCL34在腸道中顯著上調(diào)且上調(diào)趨勢越來越明顯，它在2 h內(nèi)顯著上調(diào)3.167倍，6 h后顯著上調(diào)20.19倍，12 h后顯著上調(diào)35.40倍，24 h后顯著上調(diào)44.53倍。綜上CCL34在皮膚中呈現(xiàn)持續(xù)下調(diào)的趨勢，在腸道中呈現(xiàn)持續(xù)上調(diào)的趨勢。皮膚中大菱鲆趨化因子CCL34在12 h表達(dá)量最低，而在腸道中表達(dá)量隨時(shí)間推移逐漸增大(見圖5)。

無乳鏈球菌感染后，觀察到在皮膚中呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)趨勢，2 h顯著下調(diào)7.93倍，到4 h下調(diào)1.99倍，8 h顯著下調(diào)8.160倍，到12 h顯著下調(diào)2.72倍。而在腸道中呈現(xiàn)顯著上調(diào)趨勢，2 h內(nèi)顯著上調(diào)42.34倍， 4 h顯著上調(diào)30.253倍，8 h內(nèi)顯著上調(diào)37.16倍，到12 h顯著上調(diào)94.41倍。在感染無乳鏈球菌的過程中，發(fā)現(xiàn)在皮膚中呈現(xiàn)持續(xù)下調(diào)的趨勢，在腸道中呈現(xiàn)持續(xù)上調(diào)的趨勢，且在2、4、8 h內(nèi)上調(diào)差異顯著(P<0.05)。皮膚中的基因表達(dá)在8 h表達(dá)最低，腸道在12 h時(shí)基因表達(dá)量最高(見圖6)。

(以健康組織為對(duì)照組, 表示與對(duì)照組差異顯著 (p<0.05). Health tissue was chosen as the control group, donates significant compared with control (p<0.05).)

(以健康組織為對(duì)照組, 表示與對(duì)照組差異顯著 (p<0.05). Health tissue was chosen as the control group, donates significant compared with control (p<0.05).)

2.6 CCL34的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析

PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果揭示了CCL34可能參與的潛在的相互作用蛋白和免疫相關(guān)信號(hào)通路。一方面，與趨化因子配體聯(lián)系最密切的是基因是趨化因子配體和受體(見圖7)。如圖7所示，CCR7和CCR9a都被預(yù)測為相互作用的基因，這表明CCL34與CCR7和CCR9a在大菱鲆中可能存在潛在的互作關(guān)系。此外，還觀察到一些免疫相關(guān)基因與趨化因子CCL34互作，如cxl(CXL1)和gpr(GPR171)。

圖7 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)從構(gòu)建的大菱鲆基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選到一個(gè)大菱鲆趨化因子CCL，系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示(見圖2)，該趨化因子與魚類的親緣關(guān)系比較近，先與斑馬魚和斑點(diǎn)叉尾鮰的CCL34a聚到一起，最終與斑馬魚和斑點(diǎn)叉尾鮰的CCL34b聚到一起。通過與斑馬魚、牙鲆的共線性分析對(duì)該趨化因子進(jìn)一步鑒定(見圖3)，發(fā)現(xiàn)其序列比較保守，因此把該趨化因子命名為大菱鲆CCL34。

目前，對(duì)于魚類趨化因子CCL34的功能研究依舊很少。但根據(jù)一些其它趨化因子CCL的相關(guān)研究可以推測大菱鲆趨化因子CCL34可能參與免疫相關(guān)過程。例如，在關(guān)于斑點(diǎn)叉尾鮰趨化因子CCL的研究中顯示，趨化因子CCL可能在魚的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。當(dāng)愛德華氏菌和柱狀黃桿菌感染斑點(diǎn)叉尾鮰后，趨化因子CCL33、CCL34、CCL36基因顯著表達(dá)；在遲緩愛德華氏菌感染后，CCL19a.2在易感魚類中表達(dá)水平極高，達(dá)200倍以上。此外，CCL19a.1、CCL20a.3和CCL34b.1在易感魚類中的表達(dá)水平也較高，達(dá)20倍以上。這些表達(dá)模式對(duì)趨化因子CCL的功能分析奠定基礎(chǔ)[25]。大菱鲆趨化因子CCL19以一種依賴于保守的DCCL基序的方式招募白細(xì)胞并增強(qiáng)宿主免疫防御。為了檢測rSmCCL19在病毒和細(xì)菌感染時(shí)是否對(duì)宿主免疫反應(yīng)有任何影響，向大菱鲆腹腔注射rSmCCL19后，用病毒病原體巨細(xì)胞病毒活細(xì)菌病原體遲緩大腸桿菌感染大菱鲆，在不同時(shí)間點(diǎn)檢測病毒和細(xì)菌在腎臟內(nèi)的擴(kuò)散情況，發(fā)現(xiàn)rSmCCL19處理的魚在所有檢測時(shí)間內(nèi)回收的細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量都顯著低于對(duì)照魚，說明rSmCCL19增強(qiáng)了宿主對(duì)病毒和細(xì)菌感染的抵抗力。將注射rSmCCL19后的大菱鲆頭腎作為樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量，結(jié)果顯示其對(duì)一些基因如L-1b、IL-8、IL-17A/F、IL-22、IRF-5、IRF-7、IRF-8、Mx和MHCIIα等均有明顯的誘導(dǎo)作用。這些結(jié)果與rSmCCL19對(duì)病原體感染的增強(qiáng)作用是一致的[39]。在大菱鲆中，IRF-5、IRF-7、IRF-8調(diào)節(jié)干擾素依賴的免疫反應(yīng)，這3個(gè)基因被病毒和poly I: C上調(diào)，這表明它在抗病毒感染中發(fā)揮作用[40-42]。這些基因的表達(dá)增加，再加上Mx和NKEF，這兩個(gè)基因是與抗病毒防御相關(guān)的先天免疫反應(yīng)的關(guān)鍵參與者，可能至少在一定程度上解釋了rSmCCL19處理的魚減少病毒感染的原因。SmCCL19誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答可能導(dǎo)致體內(nèi)注射rSmCCL19后對(duì)病毒和細(xì)菌的抵抗力增強(qiáng)[43]。趨化因子CCL可以對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生反應(yīng)，表現(xiàn)出抗菌活性，募集白細(xì)胞，在魚類免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。在一項(xiàng)研究中，用qRT-PCR方法檢測許氏平鲉感染鰻弧菌后0、4、8、12、24、48 h肝、脾臟組織CCL25mRNA的表達(dá)。結(jié)果表明，許氏平鲉CCL25基因在肝臟中的mRNA表達(dá)在24 h后開始顯著升高(p<0.01)，是0 h的11倍，48 h后開始下降(p>0.05)。在脾臟，CCL25mRNA的表達(dá)水平在4 h(46倍，p<0.01)和8 h(6倍，p<0.05)均顯著高于0、12 h后表達(dá)水平恢復(fù)到正常水平，與0 h相比，SsCCL25mRNA的表達(dá)水平在4 h(46倍，p<0.01)和8 h(6倍，p<0.05)顯著升高。通過檢測CCL25 mRNA的組織分布和對(duì)細(xì)菌刺激的時(shí)間表達(dá)反應(yīng)，揭示許氏平鲉CCL25可能參與免疫應(yīng)答。有研究表明，鯰魚在感染ICTALURI愛德華氏菌后，CCL19基因的表達(dá)顯著上調(diào)[25]，這可能表明CCL19在魚類免疫活動(dòng)中起重要作用。有研究表明CCL28是一種廣譜抗菌趨化因子，在粘膜組織中表達(dá)，可從唾液和牛奶中大量回收[40]。CCL28的C末端區(qū)域是其抗菌活性的重要決定因素。

本研究結(jié)果顯示趨化因子CCL34基因在大菱鲆組織中普遍表達(dá)，在腎臟中表達(dá)水平最高，其次是肝臟和皮膚。結(jié)果說明大菱鲆趨化因子CCL34基因具有較高的組織特異性，可能與免疫機(jī)制有關(guān)。大菱鲆趨化因子CCL34基因在多個(gè)組織中均有表達(dá)，并且在細(xì)菌感染后基因表達(dá)變化顯著，說明大菱鲆趨化因子CCL34可能參與機(jī)體內(nèi)的免疫應(yīng)答。其蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析(見圖7)顯示，大菱鲆趨化因子CCL34可能與其他趨化因子配體和受體聯(lián)系在一起參與機(jī)體的免疫反應(yīng)，如CCL25b、CCR1、CXCR1等，也可能與其他的免疫相關(guān)基因一起參與一些與免疫相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，如gpr171、cxl1等。魚類終生生活在水體環(huán)境中，其粘膜持續(xù)暴露于各種病原及物理化學(xué)有害物質(zhì)中，是魚類感染的重要部位，也是抵御病原菌附著和入侵的第一道防線。粘膜免疫系統(tǒng)主要由腸道、皮膚和鰓相關(guān)淋巴組織構(gòu)成[44]。腸道構(gòu)成最大的體表面積不斷地接觸外界的病原菌，并且在免疫防御炎癥反應(yīng)和病原菌感染方面起到關(guān)鍵作用[45]。魚類的皮膚表皮主要由上皮細(xì)胞組成，其間分布有粘液細(xì)胞和囊狀細(xì)胞。魚類上皮組織中含有大量的粘液細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和各類淋巴細(xì)胞，與其他活性物質(zhì)構(gòu)成了抵御病原微生物感染的有效防線。例如, 雖然在血清中沒有檢測到抗體, 但皮膚黏液中的抗體滴度很高, 所以獲得很高的免疫保護(hù)[46]。為了揭示趨化因子CCL34在大菱鲆黏膜免疫中的作用，選取細(xì)菌感染后黏膜組織中腸道和皮膚，對(duì)其表示模式進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，被鰻弧菌和無乳鏈球菌感染后，皮膚中的表達(dá)水平持續(xù)下調(diào)，鰻弧菌和無乳鏈球菌逐漸感染魚體，加劇魚體的病理損傷，抵抗先天性免疫反應(yīng)。在鰻弧菌和無乳鏈球菌感染過程中，腸道基因表達(dá)水平顯著上調(diào)，說明腸道粘膜組織在大菱鲆非特異性免疫中可能發(fā)揮重要的作用。

綜上所述，本研究推測大菱鲆趨化因子CCL34基因與大菱鲆免疫反應(yīng)有關(guān)，起到免疫防御的作用，為進(jìn)一步研究大菱鲆趨化因子CCL34的功能奠定了一定的基礎(chǔ)。