山東田橫島海域長牡蠣性腺發(fā)育及生化成分周年變化?

呂 敏， 李 琪,2??

(1.海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國海洋大學(xué))， 山東 青島 266003； 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家試點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室， 山東 青島 266237)

海洋雙殼貝類性腺發(fā)育與環(huán)境因子(溫度、食物)及內(nèi)在生理代謝密切相關(guān)。溫度調(diào)控配子發(fā)生的時間和速度，食物豐歉調(diào)控配子發(fā)生的強(qiáng)度，配子重吸收循環(huán)是性腺發(fā)育額外營養(yǎng)來源[1]。海洋雙殼貝類能量儲存和生化成分的季節(jié)性變化與生殖活動密切相關(guān)[2]。糖原、蛋白質(zhì)、脂肪是軟體動物體內(nèi)的主要能源供應(yīng)形式。不同物種配子發(fā)生期間所消耗能源類型存在差異，Liu等[3]研究發(fā)現(xiàn)滑頂薄殼鳥蛤(Fulviamutica)配子發(fā)生期的能源是脂質(zhì)；Kang等[4]研究發(fā)現(xiàn)韓國海灣扇貝配子發(fā)生期的能源是糖原；Thompson[5]對巨扇貝(Placopectenmagellanicus)研究發(fā)現(xiàn)其配子發(fā)生期的能源來自近期攝入的食物和之前的儲備。根據(jù)雙殼貝類配子發(fā)生動員的能量類型不同，Bayne[6]將其總結(jié)為兩種不同繁殖策略：(1)配子發(fā)生利用之前儲存于各組織中能量的物種稱為保守種，如褶牡蠣(Crassostreaplicatula)、中國蛤蜊(Mactrachinensis)；(2)配子發(fā)生利用最近攝入的食物作為能量的物種稱為機(jī)會種，如堅(jiān)固馬坷蛤(Spisulasolida)[7-9]。

長牡蠣(Crassostreagigas)又稱太平洋牡蠣，是我國主要的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)貝類。隨著養(yǎng)殖面積與養(yǎng)殖密度的擴(kuò)大，養(yǎng)殖環(huán)境惡化、種質(zhì)退化、死亡率上升等問題逐年增加，對養(yǎng)殖海區(qū)長牡蠣生長與繁殖發(fā)育產(chǎn)生較大影響。Li等[7-8,10]報(bào)道了日本宮城長牡蠣、山東乳山沿海中國蛤蜊和褶牡蠣性腺發(fā)育周期及生化成分季節(jié)變化，柯巧珍等[11]報(bào)道了山東北部沿海四角蛤蜊性腺發(fā)育年周期，棲息海域的不同往往引起雙殼貝類繁殖習(xí)性發(fā)生變化[12]。田橫島位于山東省青島市即墨東部海域，自然條件良好，長牡蠣等貝類資源較為豐富。然而有關(guān)其生殖周期與海區(qū)環(huán)境因子關(guān)系的研究，目前還沒有報(bào)道。本研究調(diào)查田橫島海域長牡蠣生殖發(fā)育周期與環(huán)境因子、各組織生化成分周年變化的關(guān)系，旨在為保護(hù)田橫島海域長牡蠣種質(zhì)資源，開展人工養(yǎng)殖提供重要的參考資料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

調(diào)查樣品采于青島市田橫島牡蠣養(yǎng)殖海區(qū)，自2019年4月—2020年3月，每月中旬采集長牡蠣40～60個體，使用多參數(shù)水質(zhì)分析儀(YSI proplus)現(xiàn)場測定水溫(WT)和鹽度(S)。同時，取表層水樣固定，測定葉綠素a(Chla)濃度，其測定方法參照《海洋監(jiān)測規(guī)范 GB 17378.4—2007》[13]。長牡蠣樣品活體運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，每3個個體為一組，解剖獲取外套膜、鰓、閉殼肌及性腺-內(nèi)臟團(tuán)組織，-80 ℃冷凍保存。

1.2 組織學(xué)分析

每月取長牡蠣30個個體，鑒別雌雄及發(fā)育狀況，解剖取厚度為5 mm左右的性腺組織，置于 Bouin氏液固定24 h后，70%酒精梯度脫水，石蠟滲透和包埋，組織切片，愛氏蘇木精-曙紅(HE)法染色，在顯微鏡(Olympus BX53)下辨別雌雄和性腺發(fā)育狀況。每月隨機(jī)選取10張雌性性腺切片，每張切片測量50個卵母細(xì)胞的直徑(穿過核仁的最長軸)，計(jì)算平均值以確定性腺發(fā)育程度[14]。

1.3 生化成分測定

將外套膜、鰓、閉殼肌及性腺-內(nèi)臟團(tuán)4種組織冷凍干燥48 h，研磨成粉末狀，80目篩絹過濾后，儲存于干燥器中。采用Wang等[15]構(gòu)建的近紅外(NIR)(Antaris MX, Thermo Fisher)分析模型對各組織中的糖原、蛋白質(zhì)及脂肪含量進(jìn)行測定。

1.4 條件指數(shù)

每月取10個長牡蠣個體，將軟體部及貝殼在80 ℃烘箱內(nèi)烘至恒重，以平均軟體部干質(zhì)量(g)/平均貝殼干質(zhì)量(g)計(jì)算每月條件指數(shù)(CI)，確定性腺發(fā)育程度[16]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 23.0軟件處理。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)比較各月卵徑、條件指數(shù)及各組織生化成分含量的差異顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果

2.1 調(diào)查海區(qū)環(huán)境因子季節(jié)變化

青島市田橫島海區(qū)水溫具有明顯的季節(jié)變化，夏季8月溫度最高27.3 ℃，隨后溫度逐月下降，冬季1月溫度降至最低5.4 ℃。周年調(diào)查海區(qū)鹽度無明顯季節(jié)變化，變化幅度介于30.48～32.28。調(diào)查海區(qū)屬于溫帶季風(fēng)性大陸氣候，夏季高溫多雨，鹽度在夏季降至全年最低。葉綠素a濃度表現(xiàn)為春秋季節(jié)高于夏冬季節(jié)，上下半年各有一次高峰，9、10月葉綠素a濃度最高，9月為周年最高峰3.10 μg·L-1，隨后逐漸下降，在冬季1月降至最低(1.10 μg·L-1)。春季葉綠素a濃度逐漸升高，在4 月出現(xiàn)次高峰(2.20 μg·L-1)。

圖1 調(diào)查海區(qū)溫度、鹽度、葉綠素a濃度周年變化Fig. 1 Seasonal variation of water temperature, salinity and chlorophyll a concentration in the survey area of Tianheng Island

2.2 調(diào)查海區(qū)長牡蠣性腺發(fā)育階段特征

通過對調(diào)查海區(qū)長牡蠣性腺外部形態(tài)及組織切片的觀察，性腺發(fā)育周期共分為六個階段：形成期、增殖期、成熟期、排放期、耗盡期和休止期，各階段特點(diǎn)如圖2所示。

形成期：外觀長牡蠣性腺較薄，表面可見內(nèi)臟團(tuán)組織。切片可辨雌雄，濾泡較小，結(jié)締組織較多，雌性濾泡壁上卵原細(xì)胞開始發(fā)育；雄性濾泡壁上有許多精原細(xì)胞。

增殖期：外觀長牡蠣性腺逐漸增厚，結(jié)締組織減少。雌性卵巢中濾泡變大，濾泡壁上附著大量的卵母細(xì)胞，泡內(nèi)有空隙及少數(shù)成熟卵子游離；雄性精巢內(nèi)濾泡內(nèi)空隙逐漸縮小，游離精子增多。

陜西關(guān)中冬季往往干旱寒冷，梨黑星病菌主要以菌絲和分生孢子在病梢、芽鱗和病枝上，或殘存在落葉上越冬。在冬季溫暖潮濕年份，分生孢子易喪失生活力而不能越冬，但病菌轉(zhuǎn)而在落葉上形成菌絲團(tuán)（12月）及子囊殼（1—2月）越冬，翌春再產(chǎn)生子囊孢子進(jìn)行初次侵染。由于病菌能否形成子囊殼主要決定于冬季的濕度，因此在不同年份、不同地區(qū)，甚至同一地區(qū)不同小環(huán)境中，均可有不同的越冬方式。

成熟期：性腺肥厚飽滿，軟體部被性腺包裹，幾乎沒有結(jié)締組織，濾泡間幾乎沒有間隙。雌性卵巢中濾泡內(nèi)有大量游離成熟的卵子，呈現(xiàn)出不規(guī)則的多邊形，少數(shù)卵母細(xì)胞附著在濾泡壁上；雄性精巢內(nèi)濾泡中大量成熟的精子密集呈輻射狀。

排放期：性腺開始萎縮，表面有明顯的生殖導(dǎo)管，結(jié)締組織增多，濾泡縮小，濾泡間間距加大。雌性卵巢中濾泡破裂，大量卵子排出，泡內(nèi)成熟的卵子數(shù)目減少；雄性精巢中濾泡內(nèi)輻射狀精子成流動狀向外排出。

耗盡期：性腺變薄呈透明狀，結(jié)締組織增多，該階段屬于性腺重吸收階段，濾泡內(nèi)僅有少量殘留卵子和精子。

休止期：無法辨別雌雄，性腺中充滿結(jié)締組織。

(A1、A2：形成期；B1、B2：增殖期；C1、C2：成熟期；D1、D2：排放期；E1、E2：耗盡期。CT：結(jié)締組織；FW：濾泡壁；OO：卵原細(xì)胞；DO：未成熟卵子；MO：成熟卵子；RO：殘留卵子；SN：精原細(xì)胞；SP：精子；RS：殘留精子；標(biāo)尺：50 μm。A1, A2: Early active stage; B1, B2: Development stage; C1, C2: Ripe stage; D1, D2: Spawning stage; E1, E2: Spent stage. CT: Connective tissue; FW: Follicle wall; OO: Oogonia; DO: Developing oocyte; MO: Mature oocyte; RO: Residual oocyte; SN: Spermatogonia; SP: Sperm; RS: Residual sperm; bar: 50 μm.)

2.3 性腺發(fā)育周期的周年變化

圖3顯示調(diào)查海區(qū)長牡蠣性腺發(fā)育周期所占比例的周年變化。1月進(jìn)入形成期的雌雄個數(shù)分別占22.2%和9.0%。3月長牡蠣全部處于形成期。4月絕大部分長牡蠣處于增殖期，少部分個體進(jìn)入成熟期。5月長牡蠣處于成熟期，6月部分個體開始排放配子(雌性17.4 %，雄性33.3 %)，配子排放集中在7—8月。隨著配子排放，9月進(jìn)入耗盡期的個體數(shù)量逐漸增加，10—12月絕大多數(shù)長牡蠣處于休止期。

2.4 長牡蠣卵徑與條件指數(shù)季節(jié)變化

如圖4所示，卵徑從1月開始逐漸增大，在5月進(jìn)入成熟期之后卵徑達(dá)到最大值(51.38 μm)，隨著配子排放卵徑逐漸縮小，各月卵徑差異性顯著(P< 0.05)。

圖3 調(diào)查海區(qū)長牡蠣性腺發(fā)育周期的周年變化Fig. 3 Seasonal variation of gonad development cycle of C. gigas in the survey area of Tianheng Island

圖4 調(diào)查海區(qū)長牡蠣卵徑季節(jié)變化Fig.4 Seasonal variation of oocyte diameter of C. gigas in the survey area of Tianheng Island

如圖5所示，條件指數(shù)在5月長牡蠣進(jìn)入成熟期后達(dá)到最大6.6%，隨著配子排放，條件指數(shù)逐漸減小，在9月降到最低3.7%。當(dāng)長牡蠣性腺處于休止期時，條件指數(shù)各月份無顯著差異。性腺發(fā)育周期重新開始時，條件指數(shù)逐步增加，各發(fā)育階段有顯著差異(P<0.05)。

2.5 各組織營養(yǎng)成分周年變化

圖5 調(diào)查海區(qū)長牡蠣條件指數(shù)季節(jié)變化Fig. 5 Seasonal variation of condition index of C. gigas in the survey area of Tianheng Island

閉殼肌(74.27%±2.14%)蛋白質(zhì)含量高于外套膜(48.18%±4.22 %)、鰓(56.55%±3.87%)和性腺-內(nèi)臟團(tuán)(48.74%±4.96%)，閉殼肌蛋白質(zhì)含量各月份變化幅度不顯著。在配子發(fā)生期間，4—7月性腺-內(nèi)臟團(tuán)和外套膜蛋白質(zhì)含量顯著升高；配子排出后，蛋白質(zhì)含量顯著下降。各組織在8—10月緩慢增加，進(jìn)入冬季后蛋白質(zhì)含量逐漸下降，但差異不顯著(見圖7)。

(字母不同表示月間差異顯著(P < 0.05)。Different letters denote significant difference between different month (P < 0.05).)

(字母不同表示月間差異顯著(P < 0.05)。Different letters denote significant difference between different month (P < 0.05).)

性腺-內(nèi)臟團(tuán)(8.67%±2.33%)的脂肪含量高于閉殼肌(2.55%±1.05%)、外套膜(4.15%±0.92%)和鰓(3.53%±1.42%)。閉殼肌和性腺-內(nèi)臟團(tuán)變化趨勢一致，在配子發(fā)生時(1月)，脂肪含量逐漸上升，在5月性腺成熟期達(dá)到最大；隨著配子排放，脂肪含量下降，進(jìn)入休止期后含量逐漸上升。外套膜和鰓脂肪含量周年變化平緩，各月份無顯著差異(見圖8)。

(字母不同表示月間差異顯著(P<0.05)。Different letters denote significant difference between different month (P < 0.05).)

3 討論

3.1 長牡蠣性腺發(fā)育周期與環(huán)境因子關(guān)系

雙殼貝類繁殖周期與內(nèi)源因素(營養(yǎng)和激素)和外源因素(水溫、鹽度、食物)密切相關(guān)[6, 17]。配子發(fā)生周期及產(chǎn)卵持續(xù)時間受地理緯度特別是水溫的影響顯著[18]。配子形成是緩慢過程，水溫被認(rèn)為是決定貝類配子發(fā)育和產(chǎn)卵最重要的環(huán)境因素。一方面溫度能有效控制生殖細(xì)胞的有絲分裂，控制性腺發(fā)育程度；另一方面溫度升高能提高浮游植物豐度，為繁殖期間雙殼貝類提供能量來源[2,14,19]。Mann[20]研究表明雙殼貝類的繁殖發(fā)育有相應(yīng)的生物學(xué)零度和誘導(dǎo)產(chǎn)卵的最低絕對溫度，而且同一物種在不同地區(qū)的配子發(fā)育和產(chǎn)卵溫度不同[21]。Li等[10]研究發(fā)現(xiàn)日本女川灣的長牡蠣配子開始發(fā)育溫度為8～10 ℃。本研究結(jié)果顯示，調(diào)查海區(qū)長牡蠣少部分個體的配子自1月開始發(fā)育，此時海區(qū)溫度為5.4 ℃。Drummond等[22]研究發(fā)現(xiàn)短暫的升溫刺激有可能促進(jìn)配子的發(fā)生。長牡蠣誘導(dǎo)產(chǎn)卵的最低絕對溫度為18 ℃[20]，調(diào)查區(qū)17.4%雌性牡蠣配子于6月開始排放，此時水溫為20.0 ℃。

溫度影響雙殼貝類的性腺發(fā)育，餌料豐度影響其繁殖力與配子質(zhì)量[19]。浮游植物是海洋的初級生產(chǎn)者，是海洋貝類的主要食物來源，葉綠素a相對濃度高低反映水體浮游植物豐度[23-24]。Ruiz等[25]研究表明西班牙海域長牡蠣第二個產(chǎn)卵高峰發(fā)生在浮游植物豐度最大、溫度較低的10月，由此可見溫度并不是刺激牡蠣產(chǎn)卵的唯一環(huán)境因素，浮游植物豐度也會刺激雙殼貝類產(chǎn)卵。Starr等[26]研究表明充足的浮游植物可以刺激海膽(Strongylocentrotusdroebachiensis)和紫貽貝(Mytilusedulis)產(chǎn)卵。劉文廣等[27]研究表明饑餓狀態(tài)下長牡蠣存在發(fā)育遲緩、配子不排等現(xiàn)象。本研究測定葉綠素a濃度周年變化，通過組織學(xué)觀察該海區(qū)長牡蠣配子發(fā)生在溫度較低、餌料含量相對豐富的春季。這與滑頂薄殼鳥蛤(Fulviamutica)和魁蚶(Scapharcabroughtonii)的配子發(fā)育起始時間相似[3,28]。隨著溫度不斷升高，成熟配子集中在7—8月排放，此時葉綠素a含量達(dá)到高峰，為長牡蠣幼體的發(fā)育提供充足的食物供應(yīng)，以維持幼體的存活。

條件指數(shù)反映牡蠣性腺成熟程度，因?yàn)榕渥赢a(chǎn)生和釋放在組織重量上表現(xiàn)出增加或減少[29]。Kim等[30]研究指出條件指數(shù)會隨著性腺發(fā)育程度變化，性腺成熟過程中數(shù)值逐漸增大，排放后數(shù)值逐漸下降。本研究結(jié)果顯示，配子發(fā)育初期條件指數(shù)不斷上升，性腺成熟時達(dá)到最大值，隨著配子排出，條件指數(shù)逐漸下降，在休止期處于平穩(wěn)狀態(tài)。卵徑變化也是判斷配子發(fā)生的一種方法，能反映牡蠣性腺發(fā)育程度[1]，調(diào)查海區(qū)長牡蠣在卵子成熟過程中卵徑不斷增大，排卵后卵徑逐漸縮小。條件指數(shù)與卵徑變化相結(jié)合可以更準(zhǔn)確的判斷長牡蠣性腺的發(fā)育程度。

3.2 長牡蠣各組織生化成分的季節(jié)變化

糖原在雙殼貝類配子發(fā)生的能量代謝過程中起重要作用，其含量的儲存與消耗變化與生殖活動密切相關(guān)[20,31]。Berthelin等[32]研究法國西海岸長牡蠣與糖原儲存相關(guān)的囊泡細(xì)胞，在配子發(fā)生前具有較高的儲存能力，隨著配子發(fā)生儲存能力逐漸下降。本研究顯示，配子發(fā)育成熟前各組織糖原含量逐漸增加，4月達(dá)到最大值，隨著配子發(fā)育成熟，各組織糖原含量下降，7月降至最低，8—10月顯著上升。其原因可能包括：夏末秋初食物資源豐富，從外界攝入補(bǔ)充體內(nèi)糖原的消耗；8—10月長牡蠣性腺發(fā)育階段屬于排放后期與耗盡期，性腺中未排出配子開始重新吸收，配子重新吸收是額外的營養(yǎng)補(bǔ)充[1]。春季浮游植物生物量升高，食物充沛，各組織糖原大量積累，為繁殖期做準(zhǔn)備[2,30]。在配子發(fā)生期間，調(diào)查海區(qū)長牡蠣主要利用儲藏在各組織中糖原作為配子發(fā)生的能源。研究結(jié)果顯示，性腺-內(nèi)臟團(tuán)和外套膜糖原含量遠(yuǎn)高于閉殼肌和鰓，推測性腺-內(nèi)臟團(tuán)和外套膜是糖原儲存的主要組織。

在海洋雙殼貝類中脂質(zhì)含量能準(zhǔn)確反映性腺發(fā)育過程[7,33]。性腺-內(nèi)臟團(tuán)中脂質(zhì)含量變化與卵徑變化一致。性腺的發(fā)育涉及糖原向脂質(zhì)的代謝過程[34-35]。在配子發(fā)生過程中，糖原含量逐漸降低，脂質(zhì)含量逐漸增加，主要原因是糖原代謝分解過程中會產(chǎn)生甘油三酯，而甘油三酯參與卵母細(xì)胞中卵黃脂的合成，而在雄性精子形成過程中脂質(zhì)(磷脂)是參與細(xì)胞膜形成的主要物質(zhì)[10]，所以在性成熟過程中性腺-內(nèi)臟團(tuán)脂質(zhì)含量逐漸增加，隨著配子排放，性腺萎縮，脂質(zhì)含量逐漸降低。外套膜、內(nèi)臟團(tuán)和鰓脂質(zhì)含量遠(yuǎn)低于性腺-內(nèi)臟團(tuán)，且周年穩(wěn)定無顯著差異，表明它們不是貯藏脂質(zhì)的組織。

蛋白質(zhì)是卵母細(xì)胞的重要組成成分，與脂質(zhì)相結(jié)合形成卵黃蛋白，約占卵細(xì)胞的40%～50%[36]。本研究表明，在配子成熟過程中，蛋白質(zhì)含量在卵巢中不斷累積，隨著卵子的排放，含量顯著下降。蛋白質(zhì)是主要的能源物質(zhì)，在配子發(fā)生過程中，卵巢中蛋白質(zhì)含量增加，精巢情況則相反，在糖原含量極低的狀況下，蛋白質(zhì)會為精子產(chǎn)生提供能量[35]。在配子發(fā)生結(jié)束后，8—10月各組織蛋白質(zhì)含量顯著增加。11月至次年1月各組織蛋白含量持續(xù)下降，可能由于季節(jié)性食物匱乏，長牡蠣為保證機(jī)體正常代謝，蛋白質(zhì)成為主要利用的能源物質(zhì)[4]。閉殼肌的蛋白質(zhì)含量高于其他三個組織，且周年變化相對平穩(wěn)，表明在長牡蠣繁殖期間閉殼肌的蛋白質(zhì)可能沒有為配子發(fā)育提供能量，這與褶牡蠣[7]、魁蚶[28]、縊蟶[37]研究結(jié)果相類似。

4 結(jié)語

水溫和葉綠素a濃度(餌料豐度)是影響田橫島海域長牡蠣性腺發(fā)育的主要環(huán)境因子。少部分個體在冬季(1月)開始發(fā)育，隨著溫度和葉綠素a濃度升高，6月部分個體進(jìn)入排放期，在溫度較低的10—12月性腺處于休止期。條件指數(shù)與卵徑相結(jié)合可更準(zhǔn)確地判斷該海區(qū)長牡蠣性腺的發(fā)育程度。研究結(jié)果表明，該海區(qū)長牡蠣各組織生化成分周年變化與性腺發(fā)育密切相關(guān)，儲存在各組織中的糖原是性腺發(fā)育的主要能量來源；性腺-內(nèi)臟團(tuán)中脂質(zhì)和蛋白質(zhì)與配子發(fā)育密切相關(guān)；在餌料相對匱乏季節(jié)，蛋白質(zhì)是維持機(jī)體正常代謝的能源物質(zhì)。本研究探究了田橫島海域長牡蠣繁殖發(fā)育周期與環(huán)境因子、各組織生化成分周年變化的關(guān)系，為保護(hù)田橫島海域長牡蠣種質(zhì)資源，開展人工養(yǎng)殖提供重要的參考資料。