一株虹鱒源枯草芽孢桿菌的分離鑒定及生物學(xué)特性研究?

樊 丹， 鄧福容， 李紹戊， 盧彤巖， 劉紅柏， 王 荻??

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所， 黑龍江 哈爾濱 150070；2. 黑龍江省水生動物病害與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 黑龍江 哈爾濱 150070；3. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心， 上海 201306；4. 上海海洋大學(xué)國家水生動物病原庫， 上海 201306)

虹鱒(Oncorhynchusmykiss)是世界上廣泛養(yǎng)殖的重要冷水性魚類，因肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)價(jià)值高而廣受消費(fèi)者喜愛。近年來，國內(nèi)虹鱒養(yǎng)殖行業(yè)發(fā)展迅速，在滿足人們?nèi)找嬖鲩L的蛋白質(zhì)營養(yǎng)及風(fēng)味需求等方面發(fā)揮了不可替代的重要作用，具有廣闊的市場前景。隨著虹鱒養(yǎng)殖規(guī)?？焖僭龃?，片面追求經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)忽略了科學(xué)管理進(jìn)而引發(fā)一系列水質(zhì)環(huán)境惡化、密度脅迫、營養(yǎng)失衡等問題，導(dǎo)致細(xì)菌性疾病暴發(fā)風(fēng)險(xiǎn)提高。目前抗菌藥物的使用仍是虹鱒養(yǎng)殖過程中細(xì)菌性疾病的主要治療手段[1]，盡管抗菌藥物具有見效快、成本低等優(yōu)點(diǎn)[2]，但易導(dǎo)致藥物殘留、耐藥菌株產(chǎn)生及環(huán)境污染和食品安全等問題，對養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展甚至人類健康具有潛在危害。

益生菌(Probiotics)作為一種新型綠色飼料添加劑，在提高動物生產(chǎn)性能和抗病力方面有良好的效果，廣泛應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖、水產(chǎn)養(yǎng)殖、醫(yī)藥等領(lǐng)域[3-5]。益生菌被糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)定義為對宿主具有一定的積極作用的微生物。Basoulis等[6]認(rèn)為益生菌是活的微生物，足量使用可對宿主產(chǎn)生積極作用，而Balcázar等[7]認(rèn)為益生菌是對宿主健康有益生效果的微生物或化合物，包括酵母菌、細(xì)菌和藻類。隨著益生菌及其產(chǎn)品的不斷篩選和研發(fā)，其在促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的生長、提高機(jī)體免疫力和改善腸道菌群結(jié)構(gòu)等方面均表現(xiàn)出較好的效果[8]。益生菌的作用機(jī)制包括競爭腸道黏膜的結(jié)合位點(diǎn)、抑制致病菌的增殖、刺激免疫系統(tǒng)、產(chǎn)生抑菌物質(zhì)、提高消化酶活性、調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)、為宿主提供細(xì)胞營養(yǎng)成分等[9-11]。其中有關(guān)虹鱒的研究報(bào)道表明，益生菌在促生長及提高免疫力等方面具有顯著效果[12-15]。Vazi-rzadeh等[16]發(fā)現(xiàn)釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)顯著提高了虹鱒成魚的增重率。Merrifield等[17]和Mohammadian等[18]研究結(jié)果表明枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、保加利亞桿菌(Lactobacilluselbrueckiisubsp.bulgaricus)、嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)和檸檬酸桿菌(Citrobacterfarmeri)可提高虹鱒的特定生長率，增強(qiáng)免疫功能，降低飼料系數(shù)。雖然國外已有針對虹鱒的益生菌研究[19-20]，但國內(nèi)尚缺乏冷水性魚類益生菌相關(guān)研究報(bào)道。因此，分離篩選適用于虹鱒養(yǎng)殖的益生菌菌株是亟待解決的問題之一。

本研究從遼寧省虹鱒主養(yǎng)區(qū)養(yǎng)殖場的健康虹鱒幼魚腸道中篩選到1株細(xì)菌，并對菌株進(jìn)行了形態(tài)和分子特征、產(chǎn)酶性能、抑菌性、抗逆性和安全性研究，以期為虹鱒益生菌制劑的研發(fā)與應(yīng)用提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

用于篩選益生菌的健康虹鱒幼魚購自遼寧省本溪艾格莫林實(shí)業(yè)有限公司，初始平均體質(zhì)量為(35.30±3.20) g，于循環(huán)養(yǎng)殖箱(160 cm×60 cm×60 cm)中飼養(yǎng)，養(yǎng)殖溫度(15.0±1.0) ℃。用于人工感染實(shí)驗(yàn)的健康虹鱒初始體質(zhì)量為(10.00±0.89) g，養(yǎng)殖溫度(15.0±1.0) ℃，暫養(yǎng)14 d。

實(shí)驗(yàn)用溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)、殺鮭氣單胞菌(A.salmonicida)、維氏氣單胞菌(A.veronil)、嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)和魯氏耶爾森菌(Yersiniaruckeri)等菌株作為本實(shí)驗(yàn)室鑒定保存菌株。芽孢染色液購自北京雷根生物技術(shù)有限公司；蛋白酶和纖維素酶測試試劑盒購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、熒光染色劑5(6)-羧基熒光素二乙酸酯(CFDA-SE)購自北京天根生化科技有限公司；枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基(BSOM)購自招遠(yuǎn)拓普生物工程有限公司；藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 樣品采集和菌株分離培養(yǎng)

在無菌條件下對虹鱒((35.30±3.20) g)體表進(jìn)行消毒，解剖獲取虹鱒消化道，無菌生理鹽水沖洗3次后，采用組織勻漿器破碎腸道組織，將勻漿液收集于1 mL無菌生理鹽水中，梯度稀釋后分別取100 μL涂布于BSOM固體培養(yǎng)基表面，28 ℃倒置培養(yǎng)。挑取優(yōu)勢菌落劃線純培養(yǎng)，直到獲得純培養(yǎng)物。將純培養(yǎng)物接種到LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，28 ℃，120 r/min振搖16 h，菌懸液與80%滅菌甘油按3∶1混合均勻后分裝于1.5 mL的EP管中，-80 ℃冰箱保存，便于后續(xù)生物學(xué)研究。

1.3 產(chǎn)酶能力測定

選取生長良好的3株優(yōu)勢菌株，分別命名為RT-BS07、RT-BS08、RT-BS09，于LB液體培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)24 h后，4 000 r/min離心30 min。取上清液用蛋白酶和纖維素酶試劑盒測定其相應(yīng)酶活，操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 菌株形態(tài)和分子鑒定

1.4.1 菌株形態(tài)學(xué)觀察 選取產(chǎn)酶性能良好的菌株接種到LB固體平板上，28 ℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)過夜，觀察菌落形態(tài)特征。分別用革蘭氏染液與芽孢染色液進(jìn)行處理，在光學(xué)顯微鏡下觀察革蘭氏染色與芽孢染色后的菌株形態(tài)特征。

1.4.2 16S rRNA基因及同源性比對分析 選取16S rRNA基因作為目標(biāo)基因，采用分子生物學(xué)方法進(jìn)行菌株種屬鑒定。將候選菌株接種于LB肉湯培養(yǎng)基中，28 ℃，120 r/min振搖16～20 h后離心收集菌體，按照試劑盒說明書提取細(xì)菌基因組DNA作為PCR模板。16S rRNA基因通用引物序列：27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。PCR擴(kuò)增體系為：DNA模板1 μL，2×Premix 25 μL，引物27F(10 μmol/L)和1492R(10 μmol/L)各2 μL，加水補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測及純化后委托吉林省庫美生物科技有限公司進(jìn)行測序分析。16S rRNA基因拼接序列與EzBioCloud基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對分析(https://www.ezbiocloud.net/)。

1.5 體外抑菌特性分析

參照秦春秀等[21]的研究方法并改進(jìn)，將過夜培養(yǎng)的致病菌懸液加入半冷卻的LB培養(yǎng)基中并調(diào)整菌終濃度為1.0×108CFU/mL，倒板，待培養(yǎng)基凝固后用牛津杯打孔。取100 μL受試菌懸液添加至牛津孔內(nèi)，以無菌PBS為陰性對照，于28 ℃下培養(yǎng)24 h后利用十字交叉法測量抑菌圈直徑并計(jì)算抑菌面積。

1.6 耐受性實(shí)驗(yàn)

1.6.1 酸堿耐受 分別用1 mol/L HCl與1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)LB肉湯培養(yǎng)基pH為2、3、4、6、8和10，對照組培養(yǎng)基pH為7。取0.5 mL受試菌懸液(1.0×108CFU/mL)分別接種到實(shí)驗(yàn)組及對照組的50 mL培養(yǎng)基中，28 ℃，120 r/min振搖24 h后測量菌液OD600值，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。相對存活率(RS)計(jì)算公式：RS=Nχ/N0×100%；式中：Nχ為pH為2、3、4、6、8和10時(shí)的OD600值，N0為pH為7時(shí)的OD600值。

1.6.2 鹽度耐受 配置NaCl含量為2%、3%、4%、6%和8%的LB液體培養(yǎng)基，以1%為對照組。取0.5 mL受試菌懸液(1.0×108CFU/mL)分別接種到實(shí)驗(yàn)組及對照組的50 mL培養(yǎng)基中，28 ℃，120 r/min振搖24 h后測量菌液OD600值，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。相對存活率(RS)計(jì)算公式：RS=Nχ/N0×100%；式中：Nχ為鹽度為2%、3%、4%、6%和8%時(shí)的OD600值，N0為鹽度為1%時(shí)的OD600值。

1.7 體外黏附實(shí)驗(yàn)

解剖獲取健康虹鱒的腸道組織，用無菌PBS緩沖液反復(fù)沖洗腸道組織內(nèi)部直至腸黏膜表面無黏附物。以無菌PBS洗滌菌液3次去除培養(yǎng)基干擾，調(diào)整菌懸液終濃度為1.0×109CFU/mL。添加熒光標(biāo)記物CFDA-SE后，于37 ℃下避光孵育20 min。利用注射器分別在健康虹鱒的前、中、后腸注入菌懸液200 μL，用細(xì)線結(jié)扎浸于PBS緩沖液中，37 ℃孵化6 h后取出腸道組織，以無菌PBS反復(fù)洗滌3次，并迅速冷凍保存樣品。參照肖立等[22]的方法進(jìn)行冷凍切片制作及熒光顯微觀察。

1.8 安全性檢測

1.8.1 溶血性檢測 參考Williams等[23]的方法稍有改動，用含有無菌500 μL EDTA緩沖液的注射器抽取虹鱒尾靜脈血轉(zhuǎn)移至離心管，加入133 μL孟加拉紅染料混勻添加至半冷卻的LB培養(yǎng)基并倒板。取100 μL過夜培養(yǎng)的受試菌菌懸液涂布于血平板，28 ℃培養(yǎng)48 h，觀察溶血現(xiàn)象。

1.8.2 人工感染實(shí)驗(yàn) 用PBS調(diào)整受試菌濃度為1.0×108CFU/mL，隨機(jī)選取10尾健康虹鱒((10.00±0.89) g/尾)設(shè)置為實(shí)驗(yàn)組，每尾灌喂200 μL菌懸液，對照組灌喂同等體積的PBS，持續(xù)觀察120 h并記錄受試魚游動、攝食、體色及死亡等情況。

1.8.3 藥敏實(shí)驗(yàn) 采用K-B紙片擴(kuò)散法測定菌株的藥敏反應(yīng)[24]，取100 μL受試菌株菌懸液涂布至MH培養(yǎng)基，將藥敏片置放于培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h后利用十字交叉法測量抑菌圈直徑。受試菌株對恩諾沙星等10類25種抗菌藥物的藥敏性結(jié)果判定參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)(NCCLS)[25]。

1.9 候選菌株投喂實(shí)驗(yàn)

選取愛樂銀牌魚飼料(Aller Silver fish feed)作為基礎(chǔ)飼料，飼料有效成分包括：45.0%的粗蛋白(Crude protein)，20.0%的粗脂肪(Crude fat)，17.9%的無氮浸出物(NFE)，1.9%纖維(Fibre)，7.2%的灰分(Ash)，1.1%的總磷(P total)，0.3%的總鈉(Na total)，1.0%的總鈣(Ca total)。并含有10.000 IU/kg的維生素A，1.000 IU/kg的維生素D3，3 mg/kg的鈣(碘化鈣)，5 mg/kg的銅(硫酸銅)，12 mg/kg的錳(硫酸錳)，70 mg/kg的鋅(硫酸鋅)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)魚大小選取2 mm口徑飼料，并用基礎(chǔ)飼料制備含益生菌餌料。在液體LB培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，28 ℃，120 r/min，培養(yǎng)18 h。于4 ℃條件下4 000 r/min離心10 min收集菌體，PBS重懸，用PBS反復(fù)洗滌3次，去除培養(yǎng)基干擾，最終調(diào)節(jié)PBS菌懸液濃度約為1×1011CFU/mL，取140 mL菌液均勻噴灑至1 400 g飼料上，并反復(fù)翻動保持通風(fēng)陰干，最終獲得含有1×108CFU/g益生菌的餌料。隨機(jī)選取健康、非免疫狀態(tài)下虹鱒幼魚((10.00±0.89) g)，分別設(shè)立對照組和實(shí)驗(yàn)組，每組30尾，3個(gè)平行。對照組投喂基礎(chǔ)飼料，實(shí)驗(yàn)組投喂含益生菌的餌料，于水溫(14.0±0.2) ℃下，按照2%魚體質(zhì)量的投餌量每日投喂2次，分別于實(shí)驗(yàn)初始0天和投喂后的第42天，稱量實(shí)驗(yàn)魚的體質(zhì)量，記錄數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 酶活分析結(jié)果

由表1可見，RT-BS07株的蛋白酶和纖維素活力最高，分別達(dá)到(0.039±0.002)和(0.393±0.002) U/mg。RT-BS08和RT-BS092株的蛋白酶活力相近；RT-BS092株的產(chǎn)纖維素酶活力為(0.256±0.014) U/mg，高于RT-BS08株((0.162±0.011) U/mg)。結(jié)果表明，RT-BS07株的產(chǎn)消化酶能力顯著高于其他兩株菌。

表1 三株菌的酶活分析結(jié)果Table 1 The result of enzyme activity on three strains

2.2 菌株鑒定結(jié)果

RT-BS07株菌落在LB固體平板上呈乳白色、粗糙不透明，邊緣不光滑伴有褶皺隆起。革蘭氏染色后在高倍顯微鏡下可見紫色短桿菌，為革蘭氏陽性菌(見圖1a)；桿狀菌體中央有紅色膨大的未出芽芽孢，呈圓形或橢圓形，約占菌體體積的1/2～2/3(見圖1b)。PCR擴(kuò)增RT-BS07株的16S rRNA片段大小為1 472 bp(GenBank登錄號：MW559564)。將序列與EzBioCloud基因數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)，RT-BS07株與枯草芽孢桿菌NCBI3610株的親緣關(guān)系最近，其16S rRNA基因的同源性為99.86%。綜合形態(tài)和分子特征分析結(jié)果，將RT-BS07株鑒定為枯草芽孢桿菌。

(a．革蘭氏染色；b.芽孢染色。a．Gram staining; b. Spore staining.)

2.3 抑菌效果

RT-BS07菌株對嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌、溫和氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌和魯氏耶爾森菌等水產(chǎn)動物病原菌具有較強(qiáng)拮抗和抑菌作用。其中，對溫和氣單胞菌的抑菌面積最大達(dá)5.34 cm2，對殺鮭氣單胞菌、魯氏耶爾森氏菌、嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌的抑菌面積分別為3.27、2.40、1.74和1.54 cm2，陰性對照PBS未對致病菌形成抑菌圈(見表2)。

表2 RT-BS07菌株對5種病原菌的抑菌效果Table 2 The antimicrobial effect of RT-BS07 strain to several pathogens

2.4 耐受性分析結(jié)果

RT-BS07株在不同pH的LB液體培養(yǎng)基中相對存活率差異顯著(P<0.05)。其中，在pH為6時(shí)菌株相對存活率最高(82.00%)；pH為4和8時(shí)，菌株相對存活率分別為75.65%和60.00%；pH為2和10時(shí)，菌株相對存活率低，分別為8.33%和9.01%(見表3)。

表3 RT-BS07菌株在不同pH LB培養(yǎng)基中的相對存活率Table 3 Relative survival rate of RT-BS07 strain in LB broth medium with different pH values

菌株耐受鹽度范圍廣，相對存活率差異顯著(P<0.05)，菌株在低鹽度時(shí)的相對存活率高，鹽度為2%和3%時(shí)，相對存活率分別高達(dá)93.28%和91.02%；隨著鹽度的升高，菌株相對存活率降低，鹽度為8%時(shí)，相對存活率為5.70%。結(jié)果表明，RT-BS07株對酸堿和鹽度均具有一定耐受力(見表4)。

表4 RT-BS07菌株在不同鹽度LB培養(yǎng)基中的相對存活率Table 4 Relative survival of RT-BS07 strain in LB broth medium with different salinity

2.5 黏附效果

利用熒光顯微鏡觀察RT-BS07株在腸道中的黏附效果，結(jié)果表明，RT-BS07株可大量黏附于前腸的腸道黏膜上(見圖2a)，在中腸(見圖2b)與后腸(見圖2c)部位黏附的菌相對較少，呈稀疏彌散分布。前腸的黏附效果優(yōu)于中腸與后腸，同時(shí)腸道組織結(jié)構(gòu)完整性良好。

(a. 前腸；b. 中腸；c. 后腸。白色箭頭所指藍(lán)色區(qū)域?yàn)槟c道組織，紅色箭頭所指為熒光標(biāo)記菌。a. Foregut; b. Midgut; c. Hindgut. The blue areas indicated by the white arrows are intestinal tissue, and the red arrows are fluorescent-labeled target bacteria.)

2.6 安全性分析結(jié)果

RT-BS07株在血平板上培養(yǎng)48 h后，菌落生長正常且血平板完整性良好，未觀察到溶血現(xiàn)象。受試魚灌喂RT-BS07菌懸液后連續(xù)觀察120 h，受試魚與對照組無差異，體色、體型等體征無變化，呼吸、攝食及游動等行為均正常，無死亡，剖檢也未見肝、脾、腸等臟器有病變情況，表明RT-BS07菌株對虹鱒安全，無毒副作用。

2.7 藥敏分析結(jié)果

藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RT-BS07株對左氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星，鏈霉素、卡那霉素、阿米卡星、慶大霉素、大觀霉素、新霉素、強(qiáng)力霉素、阿莫西林、氨芐西林、頭孢哌酮、甲氧嘧啶、氟哌酸、磺胺異惡唑、氯霉素與紅霉素均表現(xiàn)為敏感；對恩諾沙星和四環(huán)素表現(xiàn)為中度敏感；對呋喃唑酮、呋喃妥因、青霉素G及利福平表現(xiàn)為耐藥(見表5)。

表5 菌株藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 The results on the antibiotic susceptibility of different strains

續(xù)表

2.8 候選菌株投喂實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果

實(shí)驗(yàn)初始實(shí)驗(yàn)組與對照組實(shí)驗(yàn)魚體質(zhì)量差異極小，投喂42 d，實(shí)驗(yàn)組體質(zhì)量73.88 g顯著高于對照組的63.18 g(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組增重率達(dá)到101.42%，對照組為78.98%(見表6)。結(jié)果表明，候選菌株在促進(jìn)虹鱒體質(zhì)量增長方面具有顯著作用。

表6 候選菌株對虹鱒魚體質(zhì)量變化的影響Table 6 Effects of probiotic on the body weight at rainbow trout

3 討論

菌株具有產(chǎn)消化酶性能是篩選益生菌的重要因素，此類菌株在動物腸道內(nèi)產(chǎn)酶協(xié)同動物內(nèi)源性消化酶，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收提高飼料利用率，達(dá)到促進(jìn)機(jī)體生長的效果[26-27]。竇春萌等[28]據(jù)此從凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)腸道分離篩選獲得4株產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶及脂肪酶能力強(qiáng)的益生菌候選株。韓旭凱[29]從土壤中篩選獲得枯草芽孢桿菌K12株具有良好的淀粉酶活性、纖維素酶活性、蛋白酶活性。巴翠玉等[30]從養(yǎng)魚塘底泥和健康鯽魚(Carassiusauratus)腸道中分離獲得兩株枯草芽孢桿菌B1株和B2株具有產(chǎn)脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶性能。王成強(qiáng)等[31]從健康的珍珠龍膽石斑魚(Epinephelusfuscoguttatus♀×Epinepheluslanceolatus♂)腸道中分離獲得的4株枯草芽孢桿菌都具有產(chǎn)纖維素酶、淀粉酶和蛋白酶的能力。本實(shí)驗(yàn)分離獲得的枯草芽孢桿菌RT-BS07株與上述結(jié)果相似，具有產(chǎn)消化酶性能，其產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶性能強(qiáng)，且顯著促進(jìn)虹鱒體質(zhì)量增長，可作為益生菌候選株進(jìn)行后續(xù)研究。同時(shí)研究結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌具有抑菌作用，如任雨薇[32]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌對嗜水氣單胞菌具有抑制作用。劉曉燕等[33]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌WH1株對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)抑菌效果極顯著(P<0.01)。秦瑤等[34]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌Q4和Q10株具有抑制大腸桿菌(Escherichiacoli)和沙門氏菌(Salmonella)的作用。根據(jù)實(shí)際需求在篩選菌株時(shí)，抑菌性能也是重要的檢測指標(biāo)。結(jié)果表明枯草芽孢桿菌RT-BS07株與上述報(bào)道類似，具有良好抑菌性能，對溫和氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌、魯氏耶爾森氏菌等幾種致病菌具有抑制效果。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為今后水產(chǎn)養(yǎng)殖益生菌的分離篩選提供抑菌性能的理論參考。

根據(jù)產(chǎn)酶性能或抑菌性能篩選獲得候選益生菌，若要其在腸道內(nèi)產(chǎn)生消化酶、發(fā)揮抑菌作用，該菌必須能夠耐受極端條件并黏附定植在腸道內(nèi)部[35-36]。為了達(dá)到補(bǔ)充外源性益生菌、增強(qiáng)虹鱒腸道消化性能、增加益生菌數(shù)量和種類、抑制致病菌增殖、降低侵害程度的目的，投喂益生菌成為常見補(bǔ)給方式[37-38]。但研究報(bào)道顯示益生菌活菌或微生物制劑在到達(dá)腸道內(nèi)部之前已失活或被降解[13]。實(shí)際應(yīng)用中，益生菌發(fā)揮生物學(xué)作用要考慮動物胃腸道的復(fù)雜環(huán)境如胃酸的強(qiáng)降解作用、膽汁酸鹽殺菌性能及菌株在腸道黏附效果差等，此時(shí)篩選耐受性強(qiáng)能夠耐酸堿耐膽鹽、腸道黏附效果好的菌株尤為重要。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)pH為4～8時(shí)，菌株的相對存活率大于60%；pH為2或10時(shí)，相對存活率大于8%。鹽度≤3%時(shí)，菌株相對存活率體大于90%；鹽度為6%～8%時(shí)，相對存活率大于5%。對于冷水性魚類腸道的菌株黏附實(shí)驗(yàn)，國內(nèi)未見詳細(xì)報(bào)道，本次體外黏附實(shí)驗(yàn)表明枯草芽孢桿菌RT-BS07株可黏附在虹鱒的前、中、后腸黏膜且不損傷腸道組織結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明枯草芽孢桿菌RT-BS07株具有耐酸堿、耐高鹽、黏附腸道黏膜的特點(diǎn)，為其順利進(jìn)入并定植在虹鱒腸道中提供了基礎(chǔ)。

益生菌從實(shí)驗(yàn)分離篩選到生產(chǎn)應(yīng)用的關(guān)鍵是安全性，此次人工感染實(shí)驗(yàn)表明RT-BS07株對虹鱒無致病性，安全性良好。此外，益生菌的耐藥性是判定其安全性的重要方面。在養(yǎng)殖過程中，抗生素濫用可導(dǎo)致宿主微生物結(jié)構(gòu)失衡，產(chǎn)生耐藥性菌株，對自然環(huán)境及人類造成潛在的危害。研究報(bào)道稱李旭等[39]從鯽魚腸道中分離獲得枯草芽孢桿菌CB-1株對諾氟沙星、慶大霉素及四環(huán)素表現(xiàn)為敏感，對潔霉素、甲硝唑及新霉素表現(xiàn)為中度敏感，對頭孢克肟、頭孢噻肟表現(xiàn)為耐藥。劉曉燕等[33]分離的枯草芽孢桿菌WH1株對四環(huán)素、慶大霉素及卡那霉素等表現(xiàn)為敏感。賀剛等[40]從草魚(Ctenopharyngodonidella)腸道中獲得枯草芽孢桿菌對諾氟沙星、四環(huán)素及青霉素等表現(xiàn)為敏感，對磺胺二甲嘧啶和土霉素表現(xiàn)為耐藥。本實(shí)驗(yàn)從虹鱒腸道中分離獲得的枯草芽孢桿菌RT-BS07株對諾氟沙星、慶大霉素及頭孢哌酮等大部分藥物敏感，但對恩諾沙星和四環(huán)素表現(xiàn)為中度敏感，對呋喃妥因、呋喃唑酮、青霉素G及利福平藥物表現(xiàn)為耐藥，研究結(jié)果與已有報(bào)道基本一致，可為今后虹鱒養(yǎng)殖過程中藥物的合理使用提供參考。

4 結(jié)語

本研究從健康虹鱒腸道組織獲得1株具有良好產(chǎn)酶性能、耐酸堿性能、培養(yǎng)溫度范圍廣的枯草芽孢桿菌，且該菌株具有良好的生物安全性和腸道黏附性，能顯著促進(jìn)虹鱒幼魚體質(zhì)量增長，該菌株可作為益生菌候選株進(jìn)行深入研究。