黃芩湯對非酒精性脂肪肝大鼠腸道菌群的影響

嚴(yán)寶飛，袁 鵬，劉圣金，劉 嘉，段金廒，毛藝蓓，凌旭恒

黃芩湯對非酒精性脂肪肝大鼠腸道菌群的影響

嚴(yán)寶飛1, 2，袁 鵬2，劉圣金2，劉 嘉1*，段金廒2，毛藝蓓1，凌旭恒1

1. 江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院，江蘇 南京 211800 2. 南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心/中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心/國家中醫(yī)藥管理局中藥資源循環(huán)利用重點(diǎn)研究室，江蘇 南京 210023

研究黃芩湯對非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）大鼠腸道菌群的影響。將大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性藥（多烯磷脂膽堿，8 mg/kg）組及黃芩湯低、高劑量（5、20 g/kg）組，采用高脂飲食飼喂9周造模。ig給藥5周后，采用全自動生化分析儀檢測各組大鼠血脂和肝功能相關(guān)指標(biāo)；采用HE染色法分析各組大鼠肝臟組織病理變化；采用16S rRNA測序技術(shù)分析各組大鼠腸道菌群變化。與模型組比較，黃芩湯低、高劑量組大鼠體質(zhì)量明顯降低（＜0.05、0.01），血脂指標(biāo)總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triacylglycerol，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和轉(zhuǎn)氨酶指標(biāo)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine transaminase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate transaminase，AST）明顯降低（＜0.01），血脂指標(biāo)高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoproteincholesterol，HDL-C）明顯升高（＜0.01），肝細(xì)胞脂肪變性與氣球樣變得到糾正，炎細(xì)胞浸潤減少。16S rRNA測序結(jié)果顯示，模型組大鼠腸道菌群較空白組發(fā)生變化；黃芩湯低、高劑量組大鼠腸道菌群較模型組sobs、heip和Shannon指數(shù)明顯提升（＜0.05、0.01）；在門和屬水平上，黃芩湯高劑量組大鼠腸道菌群較模型組unclassified-f-Lachnospiraceae、布勞特氏菌屬、group和瘤胃球菌屬豐度明顯升高（＜0.05、0.01），放線菌門（Actinobacteria）、乳桿菌屬和雙歧桿菌屬豐度明顯降低（＜0.05、0.01）。黃芩湯高劑量組較模型組明顯上調(diào)京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）和直系同源簇（clusters of orthologous groups，COG）富集的功能水平（＜0.05、0.01）。黃芩湯可能通過改善NAFLD大鼠腸道菌群失調(diào)發(fā)揮對NAFLD的治療作用。

黃芩湯；非酒精性脂肪肝；16S rRNA；腸道菌群；黃芩苷；漢黃芩苷；黃芩素；漢黃芩素；芍藥苷；甘草苷；甘草酸

非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是全球范圍內(nèi)最常見的慢性肝病，其通常被認(rèn)為是代謝綜合征的肝臟表現(xiàn)，與諸多代謝性疾病的危險(xiǎn)因素如肥胖、血脂異常、高血壓和2型糖尿病等密切相關(guān)[1]。隨著各類代謝綜合征的全球化，NAFLD的患病率也隨之升高，已達(dá)25%左右[2]。除可直接進(jìn)展為肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌，NAFLD亦與心血管疾病及慢性腎臟疾病的高發(fā)病率有關(guān)[3-4]。為此，NAFLD已嚴(yán)重威脅人類健康。肝臟和腸道通過膽道、門靜脈和體循環(huán)廣泛聯(lián)系形成“肝-腸軸”，肝臟可以受來自腸道菌群及其代謝產(chǎn)物、環(huán)境毒素和食物抗原等多種信號的調(diào)控[5]。長期研究表明，腸道菌群能夠在調(diào)節(jié)宿主免疫與內(nèi)分泌功能、傳遞神經(jīng)信號及藥物作用和代謝等諸多方面發(fā)揮重要作用。健康的腸道菌群有助于調(diào)節(jié)人類宿主的代謝尤其是肝臟等重要代謝器官的功能[6]。當(dāng)腸道菌群異常時(shí)，則可能導(dǎo)致機(jī)體免疫狀態(tài)改變和促進(jìn)NAFLD等各種肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展[7]。因此，腸道菌群可能成為NAFLD的潛在治療靶點(diǎn)。

黃芩湯為我國療效確切的經(jīng)方之一，最早出自張仲景的《傷寒論》，在中醫(yī)臨床應(yīng)用中已有1800余年，有“萬世治痢之祖劑”“溫病第一湯”之美稱[8]。該方由黃芩、白芍、炙甘草和大棗組成，4藥合用共奏清熱治利、和中止痛之功效，治煩熱下利、腹攣痛而急迫者[9]。黃芩湯及其藥味組成中含有豐富的黃酮類、三萜類及單萜類等藥效物質(zhì)，可通過多種途徑，作用于多種靶點(diǎn)，具有保肝、調(diào)脂、降糖、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等功效[10]。諸多證據(jù)顯示，黃芩湯及其藥味組成對于2型糖尿病等代謝性疾病，肝癌、肝損傷等肝臟疾病和炎性腸道疾病具有良好的治療效果，但目前尚無關(guān)于黃芩湯對NAFLD治療作用的直接報(bào)道[8,11-12]?；诖耍狙芯渴状我訬AFLD大鼠模型為研究對象，研究黃芩湯對NAFLD的治療作用，并基于腸道菌群角度初步探討其治療機(jī)制，以期為黃芩湯治療NAFLD提供有益思路。

1 材料

1.1 動物

33只SPF級SD雄性大鼠由杭州醫(yī)學(xué)院提供，體質(zhì)量（220±20）g，生產(chǎn)許可證號SCXK（浙）2019-0002。本次動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院 [實(shí)驗(yàn)動物使用許可證編號為SYXK（蘇）2020-0001] 實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)編號JHVC-IACUC-2021-B003），符合實(shí)驗(yàn)動物福利與倫理原則。

1.2 藥物及試劑

黃芩（批號20210322）、白芍（批號20210106）、炙甘草（批號20210116）和大棗（批號20210223）飲片均購自江蘇省中醫(yī)院，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)段金廒教授鑒定為正品，符合《中國藥典》2020年版標(biāo)準(zhǔn)，憑證標(biāo)本存放在江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室。多烯磷脂膽堿（批號210315）購自Sanofi（北京）公司；4%多聚甲醛（批號BL539A）購自Biosharp公司；蘇木素-伊紅（HE，批號BP-DL001）購自南京森貝伽生物公司；普通飼料、高脂飼料（88%普通飼料、2%膽固醇、10%豬油），均購自江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物公司；E.Z.N.A.?DNA抽提、AxyPrep DNA凝膠回收、NEXTFLEX?DNA快速測序試劑盒，均由上海美吉生物公司提供。

1.3 儀器與設(shè)備

Multiskan MK3型酶聯(lián)免疫檢測儀，美國Thermo公司；Hitachi7170A型全自動生化分析儀，日本日立公司；BX53型生物顯微鏡，日本Olympus公司；RM2235型病理切片機(jī)，德國Leica公司；DYY-6C型核酸電泳儀、ND2000型光度計(jì)、9700型PCR儀、Quantus?型高靈敏熒光計(jì)、Miseq PE300測序平臺，均由美吉生物公司提供。

2 方法

2.1 黃芩湯制備

黃芩湯由黃芩、白芍、炙甘草和大棗按3∶2∶2∶2配伍組成，稱取藥材后加入10倍體積水浸潤1 h后煎煮，煎煮1 h濾過，隨后濾渣加入8倍體積水繼續(xù)煎煮1 h，合并2次濾液并濃縮[13]，最后得到生藥量為1.0 g/mL黃芩湯藥液，保存于4 ℃環(huán)境中備用。采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（UPLC-TQ-MS）對上述黃芩湯藥液中主要成分進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示其中主要成分黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、芍藥苷、甘草苷、甘草酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5.07%、0.55%、0.77%、0.08%、0.81%、0.04%、0.21%。

2.2 大鼠NAFLD模型的建立及分組

33只SD雄性大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為空白組（6只）和高脂飲食組（27只）?？瞻捉M以普通飼料喂養(yǎng)，高脂飲食組以高脂飼料飼喂9周造模。9周后隨機(jī)處死3只高脂飲食組大鼠取肝臟進(jìn)行病理學(xué)檢查，確認(rèn)NAFLD是否造模成功，將余下24只按每組6只隨機(jī)分為模型組（生理鹽水）、陽性藥組（多烯磷脂膽堿）組、黃芩湯低劑量和高劑量組。每天ig給藥1次，其中空白組和模型組給予等量生理鹽水，陽性藥組給予多烯磷脂膽堿8 mg/kg，黃芩湯低、高劑量組給予黃芩湯藥液5、20 g/kg[14]。給藥5周，每周稱體質(zhì)量1次。

2.3 動物處死與取材

末次給藥后禁食12 h采用二氧化碳吸入法處死，處死方法符合實(shí)驗(yàn)動物福利倫理要求，具體方法：將大鼠至于安樂死箱內(nèi)，充入100%二氧化碳，二氧化碳置換率為每分鐘10%～30%箱內(nèi)體積；隨后抗凝管采集血液，液氮速凍結(jié)腸內(nèi)容物，4%多聚甲醛固定保留肝臟組織。

2.4 肝組織病理學(xué)檢查

取固定后各組大鼠肝臟使用梯度濃度乙醇及二甲苯脫水，石蠟包埋，儲存?zhèn)溆谩⒏谓M織蠟塊切片并脫蠟，根據(jù)說明書進(jìn)行HE染色，隨后置于顯微鏡下觀察并拍照。

2.5 生化指標(biāo)檢測

將各組大鼠抗凝全血分離血漿（3000 r /min），采用全自動生化分析儀檢測肝功能指標(biāo)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine transaminase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate transaminase，AST）和血脂指標(biāo)總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triacylglycerol，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoproteincholesterol，HDL-C）水平。

2.6 結(jié)腸內(nèi)容物DNA抽提和PCR擴(kuò)增

按照DNA抽提試劑盒說明書抽提各組大鼠結(jié)腸內(nèi)容物腸道菌群總DNA并檢測其提取質(zhì)量（凝膠電泳），隨后對DNA進(jìn)行定量（紫外分光光度法）。基于338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）- 806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）對16S rRNA基因V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min，27個(gè)循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），然后72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，最后在4 ℃進(jìn)行保存；反應(yīng)體系：5×TransStart FastPfu緩沖液4 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，上游引物（5 μmol/L）0.8 μL，下游引物（5 μmol/L）0.8 μL，TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，補(bǔ)足至20 μL，每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)[15]。

2.7 結(jié)腸內(nèi)容物Illumina Miseq測序

按照DNA凝膠回收試劑盒說明書純化回收的PCR產(chǎn)物并檢測（凝膠電泳），隨后對回收產(chǎn)物進(jìn)行定量（熒光法）。按照DNA快速測序試劑盒說明書進(jìn)行建庫，基于Illumina Miseq PE300平臺進(jìn)行測序，得到原始測序序列。將上述序列導(dǎo)入Trimmomatic質(zhì)控以及Flash軟件（v1.2.11）拼接，實(shí)現(xiàn)序列優(yōu)化，質(zhì)控及拼接參數(shù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[15]。

2.8 數(shù)據(jù)處理與分析

基于97%相似度，運(yùn)用美吉生物生信云（https:// cloud.majorbio.com/）將處理后的序列歸為多個(gè)無嵌合體操作分類單元（operational taxonomic unit，OUT）；利用美吉生信云Uparse軟件（v7.0.1090）進(jìn)行OUT分析、Pan/Core物種分析、Alpha多樣性分析、稀釋曲線分析和Rank-Abundance曲線分析；利用美吉生信云tax_summary_a文件夾中的數(shù)據(jù)表進(jìn)行群落組成分析；利用美吉生信云Qiime軟件（v1.9.1）和R軟件（v3.3.1）進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）；利用美吉生信云R軟件（v3.3.1）和Python軟件（v3.9）進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)；利用美吉生信云進(jìn)行線性判別分析效應(yīng)大?。╨inear discriminant analysis Effect Size，LEfSe）多級物種差異判別分析；利用美吉生信云R軟件（v3.3.1）進(jìn)行Pearson相關(guān)系數(shù)分析；利用美吉生信云PICRUSt軟件（v1.1.0）進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）和直系同源簇（clusters of orthologous groups，COG）功能富集分析。

（1）固定資產(chǎn)投資。本工程建設(shè)期為1年，正常運(yùn)行期30年，社會折現(xiàn)率8%。其固定資產(chǎn)總投資2504.78萬元。根據(jù)規(guī)定，需對工程投資概算進(jìn)行調(diào)整，主要剔除屬于國民經(jīng)濟(jì)內(nèi)部轉(zhuǎn)移支付的計(jì)劃利潤、三稅稅金和設(shè)備儲備貸款利息等，調(diào)整后的總投資為2253萬元。

3 結(jié)果

3.1 大鼠體質(zhì)量的變化

如圖1所示，給藥前，模型組、陽性藥組、黃芩湯低劑量和高劑量組大鼠體質(zhì)量差異不大，但與空白組有明顯差異（＜0.01）。給藥后，每組大鼠體質(zhì)量均有增長，相較于模型組，陽性藥（多烯磷脂膽堿）組、黃芩湯低劑量和高劑量組大鼠體質(zhì)量增長不明顯（＜0.05、0.01），說明多烯磷脂膽堿和黃芩湯具有控制NAFLD大鼠體質(zhì)量增長的作用。

3.2 大鼠血脂和轉(zhuǎn)氨酶指標(biāo)變化情況

如圖2所示，相較于空白組，模型組大鼠血脂指標(biāo)TC、TG、LDL-C和轉(zhuǎn)氨酶指標(biāo)ALT、AST明顯升高（＜0.01），血脂指標(biāo)HDL-C明顯降低（＜0.01），說明大鼠NAFLD模型建立成功。相較于模型組，陽性藥組、黃芩湯低劑量和高劑量組大鼠血脂指標(biāo)TC、TG、LDL-C和轉(zhuǎn)氨酶指標(biāo)ALT、AST明顯降低（＜0.01），血脂指標(biāo)HDL-C明顯升高（＜0.01），說明多烯磷脂膽堿和黃芩湯對NAFLD大鼠都具有調(diào)脂和保肝作用。

與空白組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與陽性藥組比較：@P＜0.05

3.3 大鼠肝臟組織病理學(xué)分析

如圖3所示，空白組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞形態(tài)正常，大小均一，呈放射狀排列整齊，細(xì)胞核位于胞體中央；模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細(xì)胞出現(xiàn)重度脂肪變性，細(xì)胞腫脹并出現(xiàn)氣球樣變，伴炎細(xì)胞浸潤；陽性藥組、黃芩湯高劑量組大鼠肝細(xì)胞氣球樣變被明顯糾正，炎性浸潤降低，肝小葉結(jié)構(gòu)大致恢復(fù)，肝細(xì)胞排列呈整齊放射狀；黃芩湯低劑量組肝細(xì)胞脂肪變性較模型組略有糾正，病變程度減低，以上說明多烯磷脂膽堿和黃芩湯可改善NAFLD大鼠肝臟組織的脂肪變性、炎細(xì)胞浸潤和氣球樣變性而發(fā)揮治療作用。

3.4 各組大鼠腸道菌群物種注釋與評估

各組大鼠腸道菌群優(yōu)化后序列數(shù)目為2 011 100，堿基數(shù)目為834 790 362，平均長度為415 bp，序列長度分布在400～440 bp內(nèi)，符合16S rRNA（V3～V4）要求，可知后續(xù)分析較為可靠。

如圖4-A所示，Rank-Abundance曲線可解釋物種豐富度和群落均勻度，本研究各組在橫軸上的范圍較大且平緩下降，表明各組大鼠腸道菌群物種豐富度高和物種分布均勻。如圖4-B、C所示，Pan物種分析可解釋樣本包含的物種總和，Core物種分析可解釋所有樣本共享物種數(shù)目，本研究各組總數(shù)目和共享項(xiàng)目增加或減少趨勢均逐步減緩并趨于平坦，表明各組樣本量滿足評估物種豐富度和核心物種數(shù)的要求。如圖4-D所示，Shannon曲線可反映微生物群落多樣性，其值與群落多樣性呈正相關(guān)，本研究各組曲線趨于平坦，表明各組數(shù)據(jù)量滿足測序要求，各組樣本微生物多樣性信息可得到較為全面地反映。

3.5 各組大鼠腸道菌群Alpha多樣性分析

如圖5-A所示，sobs指數(shù)可解釋微生物群落豐富度，相較于空白組，模型組sobs指數(shù)顯著降低（＜0.01），說明NAFLD大鼠腸道菌群豐富度顯著下降；相較于模型組，陽性藥組和黃芩湯低、高劑量組sobs指數(shù)顯著升高（＜0.05、0.01），說明多烯磷脂膽堿和黃芩湯可提升NAFLD大鼠腸道菌群的豐富度。如圖5-B所示，heip指數(shù)可解釋群落均勻度，相較于空白組，模型組heip指數(shù)顯著降低（＜0.01），說明NAFLD大鼠腸道菌群均勻度顯著下降；相較于模型組，陽性藥組和黃芩湯低、高劑量組heip指數(shù)顯著升高（＜0.05、0.01），說明多烯磷脂膽堿和黃芩湯可提升NAFLD大鼠腸道菌群的均勻度。如圖5-C所示，相較于空白組，模型組Shannon指數(shù)顯著降低（＜0.01），說明NAFLD大鼠腸道菌群多樣性顯著下降；相較于模型組，陽性藥組和黃芩湯低、高劑量組Shannon指數(shù)顯著升高（＜0.05、0.01），說明多烯磷脂膽堿和黃芩湯可提升NAFLD大鼠腸道菌群的多樣性。綜上，NAFLD大鼠腸道菌群的豐富度、均勻度和多樣性均明顯下降，黃芩湯具有調(diào)節(jié)NAFLD大鼠腸道菌群豐富度、均勻度和多樣性的作用。

與空白組比較：**P＜0.01；與模型組比較：##P＜0.01；與陽性藥組比較：@P＜0.05 @@P＜0.01

圖3 各組大鼠肝臟組織病理改變(×200)

圖4 各組大鼠腸道菌群物種注釋與評估

3.6 各組大鼠腸道菌群Beta多樣性分析

如圖6所示，PCA分析可通過不同樣本群落組成分反映樣本間的差異和距離，樣本物種組成越相似，則在圖中距離越接近，主成分1（PC1）貢獻(xiàn)度為50.51%，主成分2（PC2）貢獻(xiàn)度為13.32%，二者貢獻(xiàn)度之和大于60%，故二者能較為全面地反映群落組成信息，空白組、模型組、陽性藥組及黃芩湯低、高劑量組所有樣本各自聚集在一起，模型組與空白組距離較遠(yuǎn)，而空白組、陽性藥組及黃芩湯低、高劑量組距離較為接近，說明NAFLD大鼠腸道菌群組成發(fā)生改變，多烯磷脂膽堿和黃芩湯具有調(diào)控NAFLD大鼠腸道菌群組成的作用。

與空白組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與陽性藥組比較：@P＜0.05

圖6 各組大鼠腸道菌群Beta多樣性分析

3.7 各組大鼠腸道菌群物種組成及差異分析

3.7.1 門水平物種組成及差異分析 如圖7-A所示，群落柱形圖可解釋各組樣本的優(yōu)勢物種及其相對豐度，各組大鼠腸道菌群的優(yōu)勢物種主要?dú)w屬為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、Epsilonbacteraeota、軟壁菌門（Tenericutes）和疣微菌門（Verrucomicrobia）。如圖7-B所示，各組大鼠腸道菌群在門水平群落豐度有顯著差異（＜0.01）。如圖7-C所示，相較于空白組，模型組放線菌門群落豐度顯著升高（＜0.01），表明NAFLD大鼠腸道菌群放線菌門群落豐度顯著上升；相較于模型組，陽性藥組和黃芩湯高劑量組放線菌門群落豐度顯著降低（＜0.05、0.01），說明多烯磷脂膽堿和黃芩湯高劑量可降低NAFLD大鼠腸道菌群優(yōu)勢物種放線菌門的群落豐度。

A-各組樣本的優(yōu)勢物種及其相對豐度 B-各組樣本門水平群落豐度差異 C-各組放線菌門群落豐度差異 與空白組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與陽性藥組比較：@@P＜0.01

KB-空白 MX-模型 YXY-陽性藥 DJL-黃芩湯5 g·kg?1 GJL-黃芩湯20 g·kg?1（下同） A-各組樣本的優(yōu)勢物種及其相對豐度 B-各組樣本屬水平群落豐度差異 C～I(xiàn)-各組乳桿菌屬、unclassified-f-Lachnospiraceae、布勞特氏菌屬、Allobaculum、雙歧桿菌屬、Eubacterium coprostanoligenes group和瘤胃球菌屬群落豐度差異 與空白組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與陽性藥組比較：@P＜0.05 @@P＜0.01

3.8 各組大鼠腸道菌群LEfSe多級物種差異判別分析

如圖9所示（LDA閥值：4；多組比較策略：All-against-all；保留門和屬水平差異物種），LEfSe多級物種差異判別分析可找出在門、綱、目、科、屬各個(gè)水平中對樣本劃分產(chǎn)生顯著性差異影響的群落或物種，相較于空白組，模型組unclassified-f-Lachnospiraceae、布勞特氏菌屬、、鏈球菌屬、、螺桿菌屬、group、瘤胃球菌屬豐度顯著下調(diào)，而乳桿菌屬豐度顯著上調(diào)，表明NAFLD大鼠上述腸道菌屬豐度發(fā)生顯著變化；相較于模型組，陽性藥組unclassified-f-Lachnospiraceae、、變形菌門、瘤胃球菌屬豐度顯著上調(diào)，黃芩湯低劑量組、、-6豐度顯著上調(diào)，黃芩湯高劑量組布勞特氏菌屬、unclassified-f-Lachnospiraceae、Ruminococcaceae-UCG-005、GCA-900066225、棒狀桿菌屬豐度顯著上調(diào)，表明多烯磷脂膽堿具有回調(diào)NAFLD大鼠腸道菌群unclassified-f-Lachnospiraceae、、瘤胃球菌屬豐度的作用，黃芩湯高劑量具有回調(diào)NAFLD大鼠腸道菌群布勞特氏菌屬、unclassified-f-Lachnospiraceae豐度的作用，而黃芩湯低劑量回調(diào)作用較弱。

3.9 各組大鼠腸道菌群與血脂、轉(zhuǎn)氨酶指標(biāo)相關(guān)性分析

通過Pearson相關(guān)系數(shù)分析各組大鼠腸道菌群與血脂、轉(zhuǎn)氨酶指標(biāo)相關(guān)性。如圖10所示，在門水平上，厚壁菌門與TC、ALT呈正相關(guān)（＜0.05）；放線菌門、髕骨細(xì)菌門（Patescibacteria）與TG、LDL-C、AST呈正相關(guān)（＜0.05）；擬桿菌門與HDL-C呈正相關(guān)（＜0.05）；變形菌門與HDL-C呈正相關(guān)（＜0.05），與TG、LDL-C、AST、TC、ALT呈負(fù)相關(guān)（＜0.05）；迷蹤菌門（Elusimicrobia）與AST、ALT呈負(fù)相關(guān)（＜0.05）；Epsilonbacteraeota、Kiritimatiellaeota與AST、TC、ALT呈負(fù)相關(guān)（＜0.05、0.01）；在屬水平上（取屬水平豐度前20），乳桿菌屬、雙歧桿菌屬與AST、TG、LDL-C、TC、ALT呈正相關(guān)（＜0.05、0.01），與HDL-C呈負(fù)相關(guān)（＜0.05、0.01）；unclassified-f-Lachnospiraceae、group、瘤胃球菌屬、Ruminococceae- NK4A214-group、norank-f-Desulfovibrionaceae與HDL-C呈正相關(guān)（＜0.05、0.01），與AST、TG、LDL-C、TC、ALT呈負(fù)相關(guān)（＜0.05、0.01）；布勞特氏菌屬與HDL-C呈正相關(guān)（＜0.05），與TG、LDL-C、TC、ALT呈負(fù)相關(guān)（＜0.05、0.01）；Ruminococcaceae-UCG-014與AST、TG呈正相關(guān)（＜0.05）；unclassified-f-Ruminococceaeae與HDL-C呈正相關(guān)（＜0.05），與LDL-C、TC呈負(fù)相關(guān)（＜0.05）；鏈球菌屬與AST、TG、LDL-C、TC、ALT呈負(fù)相關(guān)（＜0.05）；norank-f-Lachnospiraceae與HDL-C呈正相關(guān)（＜0.05）。以上結(jié)果顯示，大鼠腸道菌群變化與NAFLD血脂和肝功能異常存在相關(guān)性。

g-屬水平物種 p-門水平物種

*P＜0.05 **P＜0.01

3.10 各組大鼠腸道菌群功能富集差異分析

3.10.1 KEGG功能富集差異分析 KEGG數(shù)據(jù)庫是系統(tǒng)分析基因功能、聯(lián)系基因組信息和功能信息的大型知識庫。本研究將每個(gè)樣本OTU豐度標(biāo)準(zhǔn)化后獲取對應(yīng)ID，并根據(jù)OTU豐度計(jì)算KEGG功能類別的豐度。如圖11所示，各組大鼠腸道菌群KEGG功能主要富集在氨基酸代謝、碳水化合物代謝、細(xì)胞過程和信號、能量代謝等11個(gè)功能類別；相較于空白組，模型組上述11個(gè)KEGG功能水平均有顯著下調(diào)（＜0.05、0.01），說明NAFLD大鼠腸道菌群在上述11個(gè)KEGG功能上發(fā)生異常；相較于模型組，陽性藥組和黃芩湯高劑量組上述11個(gè)KEGG功能水平均顯著上調(diào)（＜0.05、0.01），表明多烯磷脂膽堿和黃芩湯高劑量具有調(diào)控NAFLD大鼠腸道菌群上述11個(gè)KEGG功能的作用。

3.10.2 COG功能富集差異分析 直系同源蛋白分組比對（evolutionary genealogy of genes: non-supervised orthologous groups，EggNOG）數(shù)據(jù)庫是國際上普遍認(rèn)可的同源聚類基因群的專業(yè)注釋數(shù)據(jù)庫，可基于此數(shù)據(jù)庫進(jìn)行COG的功能分類和功能注釋。本研究將每個(gè)樣本OTU豐度標(biāo)準(zhǔn)化后獲取對應(yīng)ID，并根據(jù)OTU豐度計(jì)算COG功能類別的豐度。如圖12所示，各組大鼠腸道菌群COG功能主要富集在能量生產(chǎn)與轉(zhuǎn)換、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、碳水化合物運(yùn)輸與代謝、輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝等10個(gè)功能類別；相較于空白組，模型組上述10個(gè)COG功能水平均顯著下調(diào)（＜0.05、0.01），表明NAFLD大鼠腸道菌群在上述10個(gè)COG功能上發(fā)生異常；相較于模型組，陽性藥組和黃芩湯高劑量組上述10個(gè)COG功能水平均顯著上調(diào)（＜0.05、0.01），表明多烯磷脂膽堿和黃芩湯高劑量可通過調(diào)控NAFLD大鼠腸道菌群上述10個(gè)COG功能發(fā)揮治療NAFLD的作用。

與空白組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與陽性藥組比較：@P＜0.05 @@P＜0.01，下同

圖12 各組大鼠腸道菌群COG功能富集差異分析()

4 討論

近年來，大量研究揭示了腸道菌群在NAFLD等代謝性疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。肥胖是導(dǎo)致NAFLD等代謝性疾病的重要原因之一，腸道菌群可通過短鏈脂肪酸等代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)宿主能量獲取或調(diào)控宿主能量代謝信號通路，最終在肥胖及肥胖相關(guān)代謝性疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用[16]。腸道菌群中革蘭陰性菌的過度繁殖，會增加肝毒性產(chǎn)物如脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的產(chǎn)生，研究顯示LPS與其靶蛋白結(jié)合，進(jìn)而與單核細(xì)胞分化抗原復(fù)合物結(jié)合，可引發(fā)胰島素抵抗與炎癥反應(yīng)[17]。胰島素抵抗是代謝性疾病的基本病理生理過程，可加速NAFLD患者肝細(xì)胞的脂肪堆積和炎癥，最終使得NAFLD進(jìn)一步惡化[18]。膽堿在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用，可促進(jìn)肝細(xì)胞中的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)并防止脂質(zhì)在肝臟中的異常積累，而膽堿缺乏通常會導(dǎo)致肝臟脂肪變性誘發(fā)NAFLD[19]。腸道菌群也參與膽堿代謝，將其轉(zhuǎn)化為有毒的二甲胺和三甲胺，這些物質(zhì)在肝臟中進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為三甲胺氧化物，導(dǎo)致肝臟炎癥和損傷，加劇NAFLD進(jìn)展[20]。膽汁酸由膽固醇合成，具有廣泛的生理功能，不僅能促進(jìn)脂溶性食物的消化，亦能保護(hù)腸道屏障，防止細(xì)菌的移位[21]。此外，膽汁酸可以作為信號分子，通過激活膽汁酸受體和跨膜G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體5（transmembrane G protein-coupled receptor 5，TGR5）來調(diào)節(jié)膽汁酸代謝的平衡[22]。有證據(jù)顯示，抗生素可通過改變膽汁酸的組成和抑制類法尼醇X受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）來減弱高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD發(fā)展[22]。而腸道菌群則可以通過將初級膽汁酸解偶聯(lián)并代謝為腸道中的次級膽汁酸來影響膽汁酸池的穩(wěn)態(tài)，從而調(diào)節(jié)機(jī)體脂質(zhì)和能量代謝，最終參與NAFLD發(fā)生發(fā)展[23]。綜上，腸道菌群可通過介導(dǎo)胰島素抵抗、炎癥、膽堿和膽汁酸代謝等過程參與NAFLD的發(fā)生發(fā)展，腸道菌群可能成為NAFLD的潛在治療靶點(diǎn)。

黃芩湯由黃芩、白芍、炙甘草和大棗組成，單味藥“個(gè)性之專長”是組方“合群之妙用”的根本，單味藥中復(fù)雜的化學(xué)成分正是其發(fā)揮多種藥理作用和多方面功效的重要基礎(chǔ)[24]。研究顯示，黃芩可通過腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）介導(dǎo)的固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（sterol regulatory element binding protein，SREBP）信號通路調(diào)節(jié)游離脂肪酸代謝從而改善NAFLD[25]；而黃芩中的黃芩素也可通過激活A(yù)MPK和抑制SREBP1減少肝臟脂肪積累，以及影響抗氧化活性等作用改善NAFLD[26]。白芍中的芍藥苷則可通過抑制干預(yù)脂質(zhì)代謝、促進(jìn)脂肪酸氧化、增加膽固醇合成、降低血糖和抑制炎癥反應(yīng)阻止NAFLD疾病發(fā)展并降低發(fā)生動脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)[27]。甘草中甘草酸可通過減少肝臟脂肪生成、增加脂肪酸氧化、促進(jìn)三酰甘油代謝、減少糖異生、增加糖原合成和胰島素敏感性，實(shí)現(xiàn)對NAFLD的保護(hù)作用[28]。綜上可知，黃芩湯可通過多種途徑對NAFLD產(chǎn)生潛在的治療作用。亦有研究顯示，黃芩湯可增加腸道內(nèi)有益菌豐度并降低有害菌豐度，恢復(fù)腸道內(nèi)微生態(tài)而實(shí)現(xiàn)對2型糖尿病、冠心病和潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用[8,29-30]。黃芩湯經(jīng)人腸道菌群作用后的代謝產(chǎn)物能顯著降低-半乳糖胺誘導(dǎo)的肝損傷小鼠的ALT水平，表明黃芩湯腸道菌群代謝產(chǎn)物是其發(fā)揮保肝作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[12]。此外，利用黃芩湯組分中的甘草酸干預(yù)可顯著改變NAFLD小鼠腸道菌群的組成，降低厚壁菌門與擬桿菌門的比率和產(chǎn)生內(nèi)毒素的細(xì)菌的豐度，提高有益菌和產(chǎn)生短鏈脂肪酸細(xì)菌的豐度，并促進(jìn)短鏈脂肪酸的產(chǎn)生，最終改善NAFLD[31]。因此，黃芩湯有望通過改善腸道菌群發(fā)揮對NAFLD的治療作用。

本研究成功建立了NAFLD大鼠模型，并基于16S rRNA技術(shù)評價(jià)黃芩湯對NAFLD大鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，從腸道菌群角度初步探討黃芩湯改善NAFLD的作用機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，相較于正常大鼠，NAFLD大鼠腸道菌群的豐富度、均勻度和多樣性均明顯下降，表明NAFLD疾病進(jìn)展過程會伴隨腸道菌群的失調(diào)。其中，在門水平上，NAFLD大鼠放線菌門群落豐度顯著提高，Epsilonbacteraeota豐度顯著降低；在屬水平上，NAFLD大鼠乳桿菌屬、和雙歧桿菌屬群落豐度顯著升高，unclassified-f-Lachnospiraceae、布勞特氏菌屬、group和瘤胃球菌屬群落豐度顯著降低。放線菌門的次級代謝產(chǎn)物是抗生素的重要來源，放線菌門豐度的提高可增加腸道內(nèi)抗生素的產(chǎn)量，進(jìn)而破壞腸道菌群的穩(wěn)態(tài)，加劇相關(guān)疾病的進(jìn)展[32]。乳桿菌和雙歧桿菌為腸道內(nèi)的有益菌群，但NAFLD大鼠乳桿菌屬和雙歧桿菌屬豐度顯著增加，原因可能為機(jī)體處于代謝異常狀態(tài)下菌群產(chǎn)生了代償作用，自我調(diào)節(jié)并逐步逆轉(zhuǎn)機(jī)體的慢性炎癥狀態(tài)[33]。布勞特氏菌屬是一種具有益生菌特性的厭氧菌，諸多證據(jù)顯示其具有調(diào)節(jié)宿主健康和緩解代謝綜合征的能力[34]。瘤胃球菌屬與谷氨酰胺代謝關(guān)系密切，谷氨酰胺代謝失調(diào)與NAFLD進(jìn)展為非酒精性脂肪肝炎有關(guān)[15,35]。除此之外，大鼠腸道菌群變化與NAFLD血脂和肝功能異常存在相關(guān)性，且NAFLD大鼠腸道菌群富集的代謝相關(guān)功能均有顯著下降。

本研究從大鼠體質(zhì)量、血脂指標(biāo)、肝功能指標(biāo)及肝臟組織病理分析證實(shí)了黃芩湯對NAFLD大鼠具有較好的治療作用。此外，黃芩湯能夠提升NAFLD大鼠腸道菌群的豐富度、均勻度和多樣性，提升Epsilonbacteraeota、unclassified-f-Lachnospiraceae、布勞特氏菌屬、group和瘤胃球菌屬豐度，降低放線菌門、乳桿菌屬和雙歧桿菌屬豐度，促進(jìn)NAFLD大鼠腸道菌群向正常水平恢復(fù)。綜上，黃芩湯對NAFLD的治療作用與其對NAFLD大鼠腸道菌群失調(diào)的改善作用具有相關(guān)性。后期將采用糞菌定植法和無菌大鼠，結(jié)合16S rRNA和宏基因組測序技術(shù)從腸道菌群角度進(jìn)一步驗(yàn)證與研究黃芩湯治療NAFLD的作用機(jī)制。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effects of Huangqin Decoction on gut microbiota in rats with nonalcoholic fatty liver disease

YAN Bao-fei1, 2, YUAN Peng2, LIU Sheng-jin2, LIU Jia1, DUAN Jin-ao2, MAO Yi-bei1, LING Xu-heng1

1. Jiangsu Health Vocational College, Nanjing 211800, China 2. Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, National and Local Collaborative Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and Formulae Innovative Medicine, and Key Laboratory of Chinese Medicinal Resources Recycling Utilization, State Administration of Traditional Chinese Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China

To investigate the effect of Huangqin Decoction (黃芩湯) on gut microbiota in rats with nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD).The rats were randomly divided into blank group, model group, positive drug group (polyene lecithin choline, 8 mg/kg), low-dose (5 g/kg) and high-dose (20 g/kg) Huangqin Decoction group, and the rats were fed with high-fat diet for nine weeks to establish the NAFLD model. After five weeks of oral administration, the plasma lipids and liver function indexes were detected by fully automatic biochemical analyzer, the pathological changes of liver tissues were analyzed by HE staining and the changes of gut microbiota in rats were analyzed by 16S rRNA sequencing.Compared with the model group, the weight of rats of low-dose and high-dose Huangqin Decoction group were significantly lower (< 0.05, 0.01), the level of total cholesterol (TC), triacylglycerol (TG), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C), alanine transaminase (ALT) and aspartate transaminase (AST) were significantly reduced (< 0.01), the level of HDL-C was elevated remarkably (< 0.01), the steatosis and ballooning degeneration of hepatocyte in liver tissues were corrected, and the inflammatory cell infiltration was decreased. 16S rRNA results showed that compared with the blank group, the gut microbiota in model group were changed; compared with the model group, the sobs, heip and Shannonindices of the gut microbiota in rats of low-dose and high-dose Huangqin Decoction group were significantly higher (< 0.05, 0.01), the abundance of unclassified-f-Lachnospiraceae,,group andin rats of high-dose Huangqin Decoction group increased significantly (< 0.05, 0.01), the abundance of Actinobacteria,andin rats of high-dose Huangqin Decoction group decreased significantly (< 0.05, 0.01). The functional level of Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) and clusters of orthologous groups (COG) enrichment related to gut microbiota in rats of high-dose Huangqin Decoction group elevated significantly (< 0.05, 0.01).Huangqin Decoction might play a role in the treatment of NAFLD by regulating gut microbiota of rats with NAFLD.

Huangqin Decoction; nonalcoholic fatty liver disease; 16S rRNA; gut microbiota; baicalin; wogonoside; baicalein; wogonin; paeoniflorin; liquiritin; glycyrrhizic acid

R285

A

0253 - 2670(2022)01 - 0162 - 14

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.01.020

2021-09-18

江蘇省高?！扒嗨{(lán)工程”優(yōu)秀教學(xué)團(tuán)隊(duì)培養(yǎng)對象（蘇教師[2020]42號）；江蘇省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（YB2020100）；江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院校級課題重點(diǎn)項(xiàng)目（JKB202003）

嚴(yán)寶飛，男，江蘇淮安人，碩士，助教，主要從事中藥資源學(xué)研究。Tel: (025)68172750 E-mail: baofeiy@163.com

劉 嘉，男，江蘇南京人，碩士，副教授，主要從事中藥資源學(xué)研究。Tel: (025)68172750 E-mail: liujia402@163.com

[責(zé)任編輯 潘明佳]