水產(chǎn)常見消毒劑對(duì)魚源柱狀黃桿菌的抑菌和殺菌效果研究

劉麗娟，王亞軍，石存斌，王 慶，張德鋒

(1.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津 300380；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁藥創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省水產(chǎn)動(dòng)物免疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510380)

柱狀黃桿菌(Flavobacterium columnare)廣泛分布于淡水水體、土壤等自然環(huán)境中，而且具有滑動(dòng)能力和團(tuán)聚性等特征，能夠感染多種養(yǎng)殖魚，是一種全球性的重要魚類細(xì)菌性病原。柱狀黃桿菌為條件致病菌，由該菌引起的魚類柱形病在我國廣泛流行，可造成被感染魚出現(xiàn)爛鰓、體表潰瘍等癥狀，體表病灶白色至黃色糜爛，嚴(yán)重時(shí)可引起全身感染。目前，魚類柱形病的防治主要依賴于抗生素和消毒劑等化學(xué)藥物，然而隨著我國加強(qiáng)了對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖用投入品的監(jiān)管以及建立了水產(chǎn)養(yǎng)殖用投入品使用白名單，越來越多的抗生素被限制使用，尚有一些消毒劑可以使用。在實(shí)際水產(chǎn)養(yǎng)殖中，化學(xué)類消毒劑的應(yīng)用可有效抑制或殺滅病原菌，起到防治細(xì)菌性疾病的效果，增加養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益。不同消毒劑的作用機(jī)制存在較大差異，篩選和開發(fā)具有高穩(wěn)定性和抗菌效果優(yōu)良的消毒劑，對(duì)于防控魚類柱形病具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究通過分析常見水產(chǎn)消毒劑對(duì)魚類柱狀黃桿菌的抑菌和殺菌效果，以期為魚類柱形病的科學(xué)防控提供依據(jù)，促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖的健康可持續(xù)發(fā)展。

一、材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)菌株與消毒劑

柱狀黃桿菌Fc001、Fc2020、MR2017、YY2017、Ms1907a、Ms2008、Ci0901、Ci2015、Ci2007a、Ps01、Fla120602、GHS061212、Hn2101和GY2001，共14株，分離自2008-2021年患病魚的鰓部，并進(jìn)行了菌種鑒定和保藏，其中柱狀黃桿菌YY2017、MR2017、Fc2020由天津市水產(chǎn)研究所惠贈(zèng)。

消毒劑：二氧化氯①、二氧化氯②、二氧化氯③、三氯異氰尿酸①、三氯異氰尿酸②、溴氯海因、二溴海因、苯扎溴銨溶液、戊二醛-苯扎溴銨、聚維酮碘、復(fù)合碘、硫醚沙星①、硫醚沙星②、硫醚沙星③、濃戊二醛、濫申停、蛋氨酸碘、過氧化鈣、過硫酸氫鉀購自不同的水產(chǎn)消毒劑生產(chǎn)廠家。

2.實(shí)驗(yàn)方法

(1)消毒劑的制備。將19種消毒劑母液或粉末分別用純水稀釋成8 192毫克/升的工作液，然后通過0.22微米的濾器進(jìn)行過濾除菌。

(2)Shieh液體培養(yǎng)基的制備。稱取蛋白胨5克、酵母提取物0.5克、硫酸鎂0.3克、牛肉膏0.2克、磷酸氫二鉀0.1克、氯化鋇0.01克、醋酸鈉0.01克、碳酸氫鈉0.05克、磷酸二氫鉀0.05克、氯化鈣0.006 7克、硫酸鐵0.001克，加入1 000毫升蒸餾水中，pH調(diào)至7.2，121℃下滅菌25分鐘。

(3)病原菌的培養(yǎng)及菌懸液制備。將14株柱狀黃桿菌接種于Shieh固體培養(yǎng)基進(jìn)行活化，28℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24小時(shí)后，接種于Shieh液體培養(yǎng)基，28℃搖床振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，取1.5毫升新鮮菌液離心獲得菌體，使用無菌PBS重懸，調(diào)整菌液濃度為1×107CFU/毫升。

(4)消毒劑對(duì)柱狀黃桿菌的最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定。首先每孔加50微升的Shieh液體培養(yǎng)基，消毒劑采用二倍稀釋法，在96孔板上進(jìn)行系列梯度稀釋，每列消毒劑的含量依次為2 048、1 024、512、256、128、64、32、16、8、4、2、1毫克/升。然后接種50微升的菌液，使其終濃度為5×106CFU/毫升。陽性對(duì)照組為只加菌液、不加消毒劑，陰性對(duì)照組為只加消毒劑、不加菌液。28℃靜置培養(yǎng)36小時(shí)后觀察結(jié)果，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。因柱狀黃桿菌培養(yǎng)液不易通過肉眼觀察判斷菌液是否明顯變渾濁，因此通過酶標(biāo)儀測(cè)定其OD600是否有顯著變化用于確定每種消毒劑對(duì)柱狀黃桿菌的MIC。當(dāng)陽性對(duì)照為有細(xì)菌生長(培養(yǎng)基變渾濁)、陰性對(duì)照無細(xì)菌生長(培養(yǎng)基清亮)，實(shí)驗(yàn)組中無菌生長的最低消毒劑濃度即為該消毒劑對(duì)柱狀黃桿菌的MIC。

(5)消毒劑對(duì)柱狀黃桿菌的最小殺菌濃度(MBC)測(cè)定。根據(jù)上述MIC實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取MIC之前5個(gè)孔中的培養(yǎng)液各100微升，均勻涂布于Shieh固體純化培養(yǎng)基上，置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)36小時(shí)，觀察是否有菌落出現(xiàn)。在Shieh固體平板上無菌落生長的最低消毒劑濃度即為該消毒劑對(duì)柱狀黃桿菌的MBC。

二、結(jié)果與分析

1.消毒劑對(duì)柱狀黃桿菌的MIC

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，陽性對(duì)照OD600均有明顯變化，表明細(xì)菌生長良好；陰性對(duì)照OD600無明顯變化，表明無菌生長(培養(yǎng)基和操作過程中沒有細(xì)菌污染)。不同消毒劑對(duì)魚源柱狀黃桿菌的MIC(表1)不同。苯扎溴銨對(duì)柱狀黃桿菌的抑菌效果最好，其MIC為2～4毫克/升；其次為戊二醛-苯扎溴銨、濫申停(主要成分為戊二醛-苯扎溴銨)，MIC均為16～32毫克/升；二氧化氯①、二氧化氯②、蛋氨酸碘和過氧化鈣對(duì)柱狀黃桿菌的抑菌效果一般，其MIC分別為64～128毫克/升、64～512毫克/升、64～128毫克/升和128～512毫克/升；二氧化氯③、三氯異氰尿酸①、溴氯海因、硫醚沙星②對(duì)柱狀黃桿菌的抑菌效果不理想，僅對(duì)部分菌株有抑菌效果，對(duì)大部分菌株抑菌濃度在1 024毫克/升以上；三氯異氰尿酸②、二溴海因、聚維酮碘、復(fù)合碘、硫醚沙星①、硫醚沙星③、濃戊二醛、過硫酸氫鈉對(duì)柱狀黃桿菌的抑菌效果較差，其MIC超過2 048毫克/升。

以上19種消毒劑的MIC實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：苯扎溴銨和戊二醛-苯扎溴銨混合制劑在較低濃度下可以有效抑制柱狀黃桿菌生長，抑菌效果顯著。三氯異氰尿酸②、二溴海因、聚維酮碘、復(fù)合碘、硫醚沙星和濃戊二醛對(duì)柱狀黃桿菌的抑菌效果較差。

2.消毒劑對(duì)柱狀黃桿菌的MBC

MBC即為供試藥物殺滅99.9%或以上受試菌所需要的最低濃度。不同消毒劑對(duì)魚源柱狀黃桿菌的MBC(表2)不同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：苯扎溴銨對(duì)柱狀黃桿菌的殺菌效果最好，其MBC為2～4毫克/升；戊二醛-苯扎溴銨、濫申停的殺菌效果次之，MBC均為16～32毫克/升；二氧化氯①、二氧化氯②、蛋氨酸碘和過氧化鈣對(duì)柱狀黃桿菌的抑菌效果一般，其MBC分別為64～256毫克/升、64～512毫克/升、64～256毫克/升和128～512毫克/升；二氧化氯③、三氯異氰尿酸①、溴氯海因、硫醚沙星②、三氯異氰尿酸②、二溴海因、聚維酮碘、復(fù)合碘、硫醚沙星①、硫醚沙星③、濃戊二醛和過硫酸氫鉀對(duì)柱狀黃桿菌的殺菌效果較差，對(duì)絕大部分菌株MBC超過了1 024毫克/升，甚至超過2 048毫克/升。綜上可知，苯扎溴銨對(duì)柱狀黃桿菌的殺菌效果最好。

三、討論

本研究選取當(dāng)前市場(chǎng)上常見的水產(chǎn)消毒劑，通過抑菌和殺菌實(shí)驗(yàn)篩選高效的消毒劑，為有效控制養(yǎng)殖水體中的柱狀黃桿菌，科學(xué)指導(dǎo)用藥，及時(shí)采取有效措施控制病情，減少由柱狀黃桿菌引起的魚類柱形病提供參考依據(jù)，對(duì)實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物健康養(yǎng)殖、保障食品安全具有重要意義。

表1 不同消毒劑對(duì)柱狀黃桿菌的MIC 毫克/升

表2 不同消毒劑對(duì)柱狀黃桿菌的MBC 毫克/升

柱狀黃桿菌分離平板 柱狀黃桿菌純培養(yǎng)菌落形態(tài)

分析19種常用消毒劑對(duì)14株不同魚源柱狀黃桿菌進(jìn)行抑菌、殺菌效果，MIC實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：苯扎溴銨對(duì)柱狀黃桿菌的抑菌效果最好；戊二醛-苯扎溴銨、濫申停效果次之；氯制劑、碘制劑、溴氯海因和硫醚沙星等抑菌效果一般；戊二醛、過硫酸氫鉀等藥物對(duì)柱狀黃桿菌的抑菌效果較差。MBC實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：苯扎溴銨對(duì)柱狀黃桿菌的殺菌效果最好；戊二醛-苯扎溴銨、濫申停(主要成分為戊二醛-苯扎溴銨)效果次之；氯制劑、碘制劑和過氧化鈣的殺菌效果一般；硫醚沙星、戊二醛和過硫酸氫鉀等藥物的殺菌效果較差。

苯扎溴銨、戊二醛-苯扎溴銨和濫申停等消毒劑對(duì)柱狀黃桿菌具有較好的抑菌、殺菌效果，但是濃戊二醛對(duì)柱狀黃桿菌的抑菌效果較差，表明戊二醛-苯扎溴銨和濫申停等消毒劑中主要起抑菌和殺菌作用的是苯扎溴銨。本研究表明苯扎溴銨在較低濃度下可以有效抑制和殺滅柱狀黃桿菌，其效果明顯優(yōu)于其他消毒劑。本研究還進(jìn)行了同種類型消毒劑的橫向比較，結(jié)果表明不同來源的同類消毒劑，其抑菌和殺菌效果有一定的差異，因此，在選用消毒劑時(shí)應(yīng)注意甄別不同產(chǎn)品的優(yōu)劣，應(yīng)選擇具有較好療效的消毒劑產(chǎn)品。本研究表明不同魚源柱狀黃桿菌對(duì)同類消毒劑的藥物敏感性存在一定的差異，這提示養(yǎng)殖業(yè)者應(yīng)加強(qiáng)魚源柱狀黃桿菌的藥物敏感性監(jiān)測(cè)，提高用藥的精準(zhǔn)度。本研究為水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中精準(zhǔn)使用消毒劑用于科學(xué)防控柱形病提供了參考依據(jù)。

本研究在減少水產(chǎn)品藥物的使用量，強(qiáng)化漁藥的合理、規(guī)范使用，以及提升水產(chǎn)品質(zhì)量具有重要意義。然而，在實(shí)際養(yǎng)殖過程中，應(yīng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)魚類病害，確定其主要致病菌，并及時(shí)分析病原菌的藥物敏感性，根據(jù)不同養(yǎng)殖品種、水質(zhì)條件和天氣變化，制定規(guī)范、科學(xué)、合理的用藥技術(shù)方案，實(shí)現(xiàn)魚類柱形病的精準(zhǔn)防控，促進(jìn)水產(chǎn)品質(zhì)量安全。