基于網(wǎng)絡(luò)藥理學探討毛蘭素抗腫瘤作用機制研究

梁若飛，張亞蘭，向 月，唐曉平

（川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科1，病理科2，四川 南充 637002）

利用現(xiàn)代科技手段從傳統(tǒng)中藥中篩選新的廣譜、高效的抗腫瘤藥物已成為近年來科研工作者的研究熱點。毛蘭素（erianin）是從中藥石斛中分離提取出來的單體，其化學名稱是2-甲氧基-5-[2-(3,4,5-三甲氧基-苯基)-乙基]-苯酚（分子量為318.36）。目前已有研究發(fā)現(xiàn)[1-4]，毛蘭素對包括膀胱癌、鼻咽癌及肺癌等在內(nèi)的多種腫瘤細胞表現(xiàn)出抗腫瘤作用。本研究以毛蘭素為研究對象，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學對其潛在作用靶點進行預測篩選并分析，一方面，希望為毛蘭素的藥理作用機制研究提供新思路，另一方面，為尋找毛蘭素的潛在抗腫瘤機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 毛蘭素作用靶點預測 在Pubchem[5]查詢毛蘭素信息，打開相應的條目，下載毛蘭素2D 結(jié)構(gòu)，保存為“sdf”格式。將毛蘭素2D 結(jié)構(gòu)導入HT Docking 數(shù)據(jù)庫中（https://www.cbligand.org/HTDocking/search_struct.php）進行基于蛋白結(jié)構(gòu)特征的反向分子對接的潛在靶點的預測，選取Docking Score＞7.8 靶點進行后續(xù)分析。

1.2 毛蘭素作用靶點相關(guān)通路富集分析 排除非人靶蛋白后利用Uniprot[6]查詢所獲取的相關(guān)靶蛋白對應的基因名，進行檢索和整理。運用Cytoscape 軟件[7]中ClueGO 分析插件，對上述靶蛋白對應的基因信息進行KEGG 通路富集分析，設(shè)定閾值P＜0.05。

1.3 蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系分析 將毛蘭素治療靶點信息上傳至蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析網(wǎng)站Gene－MANIA[8]，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.4 統(tǒng)計學方法 通過Cytoscape 軟件中ClueGO 分析插件對蛋白對應的基因信息進行KEGG 通路富集分析，統(tǒng)計檢驗采用超幾何富集分析Enrichment（Two-sided Hypergeometric test），校正方法采用多重比較Bonferroni step down，當P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 毛蘭素預測靶點信息分析 根據(jù)篩選條件，將毛蘭素2D 結(jié)構(gòu)導入HT Docking 數(shù)據(jù)庫中，最終得到毛蘭素2D 結(jié)構(gòu)所對應的101 種人源潛在靶蛋白，見表1。

表1 毛蘭素預測靶點信息

表1（續(xù)）

2.2 毛蘭素作用靶點相關(guān)通路富集分析 運用Cytoscape 軟件對將上述靶蛋白對應的基因信息進行KEGG 通路富集分析，結(jié)果顯示毛蘭素直接作用靶點參與13 條腫瘤相關(guān)通路，包括腫瘤通路、膠質(zhì)瘤通路、前列腺癌通路、膀胱癌通路、胃癌通路、結(jié)直腸癌通路、胰腺癌通路、非小細胞肺癌通路、子宮內(nèi)膜癌通路、癌癥蛋白聚糖通路、癌癥中心碳代謝通路、癌癥膽堿代謝通路及急性髓性白血病通路，見表2、圖1。

圖1 毛蘭素作用靶點KEGG 信號通路富集圖

表2 毛蘭素作用靶點KEGG 通路富集的基因情況

2.3 蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系分析 蛋白之間相互作用主要通過基因相關(guān)性、共享蛋白域、物理相關(guān)性、共定位、預測、蛋白共表達及通路表現(xiàn)出來。將毛蘭素作用靶點信息上傳至蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析網(wǎng)站GeneMANIA，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，其中基因相關(guān)性占30.45%、預測占26.99%、共享蛋白域占15.69%、物理相關(guān)性占11.58%、共定位占5.99%、蛋白共表達占5.14%、通路占4.15%，見圖2。

圖2 毛蘭素靶點蛋白交互作用圖

3 討論

中藥單體一直是新藥研發(fā)的重要來源，尤其在腫瘤藥物研發(fā)方面。盡管近年來大量相關(guān)研究證實中藥單體具有廣泛的藥理學和生物學活性，但如何快捷有效地尋找其潛在作用靶點及機制成為廣大研究者們的困擾。中藥往往具備多靶點、多途徑、多環(huán)節(jié)的藥理特性，目前雖然已有基因芯片等技術(shù)應用于中藥靶點的篩選研究，但由于其價格相對較高且周期較長，在一定程度上限制了其在中藥研究中的應用。然而，隨著生物醫(yī)學公共數(shù)據(jù)庫的不斷發(fā)展完善，網(wǎng)絡(luò)藥理學應運而生，其為闡明中藥單體及復方的作用機制開辟了一條新途徑[9-12]。網(wǎng)絡(luò)藥理學作為一門新興學科，其主要是針對生物系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)進行綜合分析，并選取特定的信號節(jié)點，從而進行多靶點藥物分子設(shè)計[13-16]。運用網(wǎng)絡(luò)藥理學進行分析，不僅能夠了解中藥單體在不同疾病中的作用，而且也能了解其在同一種疾病中的多種作用機制，這大大節(jié)省了前期研究成本及時間。

近年來研究表明毛蘭素具有一定的抗腫瘤作用。Zhu Q 等[1]研究發(fā)現(xiàn)，毛蘭素能通過線粒體凋亡途徑和JNK 途徑抑制膀胱癌細胞的生長。Liu YT等[2]研究報道，毛蘭素能通過ERK 途徑誘導鼻咽癌細胞的凋亡。Zhang H 等[3]通過體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)毛蘭素能抑制肺癌細胞的增殖，并將其細胞周期阻滯于G2/M 期。同時，Li M 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，毛蘭素能夠阻止宮頸癌HeLa 細胞的生長，并誘導其發(fā)生凋亡和阻止其細胞周期于G2/M 期。Wang Y 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，毛蘭素能通過HRAS/PI3K/AKT 信號通路抑制胃癌的癌前病變進展。Sun Y 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，毛蘭素可以抑制結(jié)直腸癌細胞的生長并促進巨噬細胞介導的吞噬作用。Zhang X 等[20]通過體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)，毛蘭素具有抗肝癌的作用，其機制主要與毛蘭素對氧化應激介導的線粒體凋亡和免疫反應的調(diào)節(jié)有關(guān)。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學對毛蘭素的潛在靶蛋白進行了虛擬篩選，結(jié)果顯示毛蘭素潛在作用靶蛋白共101 個。同時，進一步探討了其KEGG 通路，其中有13 條通路與腫瘤相關(guān)。蛋白之間相互作用主要通過基因相關(guān)性、共享蛋白域、物理相關(guān)性、共定位、預測、蛋白共表達及通路表現(xiàn)出來。蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析顯示，基因相關(guān)性占30.45%、預測占26.99%、共享蛋白域占15.69%、物理相關(guān)性占11.58%、共定位占5.99%、蛋白共表達占5.14%、通路占4.15%，表明毛蘭素是一個潛在的通過多靶點治療多種腫瘤的新的中藥單體，其中AKT1 作為一種致癌基因，是AKT家族中的重要成員之一，在腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移等生物學過程中起著重要作用。而CDK6 作為一種調(diào)控細胞周期的重要因子，在多種惡性腫瘤中異常表達，與腫瘤的演進過程密切相關(guān)。本研究結(jié)果為后續(xù)毛蘭素抗腫瘤實驗研究提供了理論參考和指導方向。

綜上所述，毛蘭素通過AKT1、CDK6、AR、BRAF、CSF1R、DAPK1 等靶點發(fā)揮抗腫瘤效應，這些靶點參與13 條腫瘤相關(guān)通路，本研究為進一步深入探討毛蘭素抗腫瘤作用機制奠定了理論基礎(chǔ)。