苯酚和喹啉降解菌Alcaligenes faecalis的降解特性及固定化應(yīng)用

趙乾程蘇凱文邱子梁王慶宇于彩虹

中國(guó)礦業(yè)大學(xué)(北京)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,北京 100083

苯酚及其衍生物是煤焦化、石油化工、醫(yī)藥、印染、造紙、農(nóng)藥等行業(yè)廢水中常見(jiàn)的污染物;喹啉是一種含氮雜環(huán)化合物,為染料、冶金、油漆、除草劑、制藥和橡膠工業(yè)的重要原料[1]。二者也是焦化廢水組分中比例較高的兩類污染物。針對(duì)二者的單基質(zhì)生物降解研究中已發(fā)現(xiàn)了較多的菌株,如Acinetobactersp.[2]、Candida tropicalis[3]、Rhodococcus[4]、Chlorellasp[5]、Stenotrophomonassp. 和Advenellasp.[6]、Debaryomycessp.[7]等能降解苯酚;Pseudomonas putida[8]、Pseudomonas aeruginosa[9]、Ochrobactrumsp.[10]、Bacillussp.[11]、Burkholderia pickettii[12]等可以降解喹啉。而實(shí)際廢水含有的污染物種類較多,單基質(zhì)污染物降解菌在實(shí)際應(yīng)用中受限。因此,研究雙基質(zhì)條件下,降解菌對(duì)2 種或以上污染物的降解作用更具有現(xiàn)實(shí)意義,但目前以苯酚和喹啉雙基質(zhì)污染物為底物的降解菌篩選和代謝的研究相對(duì)較少。

除了菌株本身特性外,微生物降解有機(jī)物污染物時(shí)的效果會(huì)受到許多因素的影響,如環(huán)境條件(pH、溫度、含氧量)、碳源、氮源和底物濃度等。微生物法處理工業(yè)廢水時(shí),微生物的流失量較大,嚴(yán)重影響了廢水中污染物的降解效果,并且在多批次連續(xù)反應(yīng)后降解能力迅速下降。研究表明,與游離細(xì)胞相比,將降解污染物的微生物固定在不同的載體上可以增大單位體積內(nèi)微生物的濃度,減少微生物的流失量,并且能提高降解效果、增加可持續(xù)性和可重復(fù)使用性[13-14]。本研究從焦化廢水的污泥中分離出1 株能同時(shí)降解苯酚和喹啉的菌株,探討該菌株在不同條件對(duì)苯酚和喹啉的降解的影響和降解過(guò)程的動(dòng)力學(xué)參數(shù),考察了外加碳源和氮源對(duì)共基質(zhì)污染物降解的影響,分析了不同固定化載體尤其是集包埋與吸附為一體的新型固定化載體對(duì)降解的影響。研究結(jié)果能為共基質(zhì)難降解焦化廢水的生物處理提供應(yīng)用參考。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(富集培養(yǎng)基):牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L。

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(馴化培養(yǎng)基):NaCl 1.0 g/L、K2HPO4·3H2O 0.79 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、微量元素1 mL/L。根據(jù)需要添加苯酚和喹啉,于121 ℃高壓滅菌20 min。

唯一碳源培養(yǎng)基:NaCl 1.0 g/L、K2HPO4·3H2O 0.79 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、NH4NO31 g/L、微量元素1 mL/L。根據(jù)需要添加苯酚。

1.2 菌種的富集、馴化和分離

污泥樣品取自某焦化廠二沉池,污泥樣品按照5%的接種量接種于含100 mg/L 苯酚和50 mg/L 喹啉的富集培養(yǎng)基中,置于轉(zhuǎn)速為150 r/min 的振蕩器中30 ℃恒溫培養(yǎng)3 d。培養(yǎng)期間轉(zhuǎn)移至馴化培養(yǎng)基中逐步提高苯酚和喹啉的濃度,至溶液中兩者濃度分別達(dá)到500 mg/L 和250 mg/L,進(jìn)行菌株分離。通過(guò)逐級(jí)稀釋涂布在固體培養(yǎng)基中倒置培養(yǎng),并對(duì)單菌落進(jìn)行劃線,篩選出對(duì)苯酚和喹啉雙基質(zhì)污染物降解能力高的一株單菌并進(jìn)行保存。

1.3 菌株的鑒定

1.3.1 形態(tài)及生理生化鑒定

(1) 待平板上長(zhǎng)出肉眼可分辨的單個(gè)菌斑后挑取單菌落制片,并通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察菌株細(xì)胞的形態(tài)特征。

(2) 按照細(xì)菌常規(guī)生理生化鑒定方法[15],對(duì)純化后的菌株進(jìn)行革蘭氏染色、過(guò)氧化氫酶、糖的利用、淀粉水解和明膠水解鑒定。

1.3.2 16S rDNA 鑒定

使用Solarbio 細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取菌株的基因組DNA,利用16S rDNA 基因通用引物27F(5 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) 和1492R(5-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’ )進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序,測(cè)得的序列通過(guò)Blast 程序與Genbank 中已知菌株的序列進(jìn)行比對(duì)分析,并利用MEGA7.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 培養(yǎng)條件對(duì)喹啉和苯酚雙基質(zhì)降解的影響

將菌株在100 mL 富集培養(yǎng)基中富集24 h,待OD600約為1.2 時(shí)取菌液在10 000 r/min 條件下離心10 min,棄去上清液,用無(wú)菌水洗滌、沉淀菌體,使之重懸后再次離心,重復(fù)操作2 次后按照以下4個(gè)條件進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn),其中上一步得出的最佳條件為下一步使用,并逐步提高喹啉和苯酚的濃度:菌體接種量分別為5% 、8% 、10% 、15% ,接種在含有100 mg/L 苯酚和50 mg/L 喹啉培養(yǎng)基中;接種在初始pH 值分別為6、7、8、9、10 的含有200 mg/L 苯酚和100 mg/L 喹啉培養(yǎng)基中;設(shè)定培養(yǎng)溫度為25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃,接種在含有300 mg/L 苯酚和150 mg/L 喹啉的培養(yǎng)基中;調(diào)節(jié)振蕩器轉(zhuǎn)速為50 r/min、70 r/min、150 r/min、200 r/min,接種在300 mg/L 苯酚和150 mg/L 喹啉的培養(yǎng)基中。每組設(shè)置3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn),24 h 后取樣,分別采用4-氨基安替比林分光光度法[16]和紫外分光光度法[17]測(cè)定苯酚和喹啉的濃度。

1.5 外加碳源和氮源對(duì)菌株降解苯酚和喹啉的影響

用100 mg/L 的葡萄糖和200 mg/L 硝酸銨作為外加碳源和氮源,分別添加到含有500 mg/L 的苯酚單基質(zhì)培養(yǎng)基、400 mg/L 喹啉單基質(zhì)培養(yǎng)基以及含有300 mg/L 苯酚和150 mg/L 喹啉的雙基質(zhì)培養(yǎng)基中,在最佳條件下恒溫振蕩培養(yǎng)60 h,定時(shí)取樣測(cè)定苯酚和喹啉的濃度。

1.6 菌株降解苯酚和喹啉的降解特性

以10%的接種量,接種在不同濃度(100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L、600 mg/L、700 mg/L、800 mg/L、900 mg/L)的苯酚單基質(zhì)和不同濃度(50 mg/L、80 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L)的喹啉單基質(zhì)培養(yǎng)基中,調(diào)節(jié)初始pH 值均為7.0,在35 ℃、150 r/min 轉(zhuǎn)速條件下進(jìn)行振蕩培養(yǎng),每隔一定時(shí)間取樣測(cè)定菌的生長(zhǎng)情況(OD600)以及苯酚和喹啉的濃度。采用Haldane 底物抑制模型[18]對(duì)菌株KD1 在降解苯酚和喹啉時(shí)的比生長(zhǎng)速率進(jìn)行描述,其方程如下:

式中,μ為比生長(zhǎng)速率,h-1;μm為最大比生長(zhǎng)速率,h-1;Cs為初始底物濃度,mg/L;Ks為生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的半飽和系數(shù),mg/L;Ki為生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的抑制系數(shù),mg/L。

1.7 固定化作用下菌株對(duì)苯酚和喹啉的降解

1.7.1 固定化載體的篩選

(1) 凝膠小球的制備。稱取適量的聚乙烯醇和海藻酸鈉,在90 ℃水浴加熱條件下不停攪拌使其完全溶解于100 mL 的蒸餾水中。對(duì)凝膠態(tài)混合液進(jìn)行滅菌,冷卻30 ～40 ℃時(shí)加入10 mL 菌懸液,混合均勻后滴入含有20 g/L 的CaCl2飽和硼酸溶液中,形成體積大小均勻的小球,室溫下交聯(lián)1 h后轉(zhuǎn)移到0.5 mol/L 的Na2SO4溶液中,置于冰箱內(nèi)低溫(4 ℃)繼續(xù)交聯(lián)12 h。室溫下分別用生理鹽水、蒸餾水和磷酸緩沖液(50 mmol/L,pH 值7.0)反復(fù)沖洗后浸泡在磷酸緩沖液中,置于室溫下保存,以備后用。

(2) 凝膠活性炭的制備。在聚乙烯醇和海藻酸鈉溶解后加入1 g 活性炭。其他步驟同凝膠小球。

(3) 用玉米芯、海綿、凝膠小球、凝膠活性炭為載體,以不添加菌液為對(duì)照,將不同載體固定的菌體和游離菌體分別加入到含400 mg/L 的苯酚和250 mg/L 的喹啉無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。每隔12 h 測(cè)定溶液中苯酚和喹啉的濃度,考察游離菌和用不同載體固定后的菌株對(duì)降解苯酚和喹啉雙基質(zhì)的影響。

1.7.2 花生殼活性炭凝膠小球的固定化作用比較

采用微波輻照磷酸活化法[19]制備花生殼活性炭、傳統(tǒng)活性炭,并制作二者的凝膠小球,分別加入到500 mg/L 的苯酚和300 mg/L 的喹啉雙基質(zhì)培養(yǎng)基中,以游離菌為對(duì)照進(jìn)行培養(yǎng),定時(shí)取樣測(cè)定苯酚和喹啉的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的鑒定

將經(jīng)過(guò)逐步提高苯酚和喹啉濃度馴化、分離,篩選出的菌株命名為KD1。菌株KD1 在平板上的菌落顏色呈深黃色,菌體光滑濕潤(rùn),為短桿菌,具有周鞭毛,其生理特征見(jiàn)表1。菌株KD1 為好氧的革蘭氏陰性菌,能利用葡萄糖但不能水解淀粉,生理代謝過(guò)程會(huì)產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶,并且能水解明膠。

表1 KD1 的生理生化特性Tab.1 Physio-biochemical characteristics of KD1

將所得菌株 KD1 ( Genbank 登錄號(hào):MW221361)的16S rDNA 序列結(jié)果通過(guò)在線Blast程序與Genbank 中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì),用軟件MEGA7.0 建立系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。根據(jù)比對(duì)結(jié)果,菌株KD1 與Alcaligenes faecalis(KF641858,糞產(chǎn)堿菌)相似性在99% 以上,表明二者屬于同一菌種。

圖1 菌株KD1 的系統(tǒng)發(fā)育分析樹Fig,1 Phylogenetic tree of strain KD1

2.2 不同條件對(duì)菌株KD1 降解苯酚和喹啉的影響

不同接種量、pH 值、溫度和振蕩器轉(zhuǎn)速條件下菌株對(duì)苯酚和喹啉的降解效果如圖2 所示。除了pH 值外,其他3 個(gè)條件對(duì)菌株KD1 降解苯酚和喹啉的影響基本一致。

由圖2(a)可知,隨著接種量升高,苯酚和喹啉的降解率逐漸提高然后穩(wěn)定,接種量達(dá)到10% ,苯酚降解率達(dá)到100% ,喹啉的降解率達(dá)到80% 左右。這是由于低菌體接種量時(shí)底物濃度相對(duì)較高,菌體生長(zhǎng)受到抑制[20],而增加接種量能提高菌群對(duì)底物毒性的耐受。與低接種量相比,菌體經(jīng)過(guò)相同培養(yǎng)時(shí)間后達(dá)到對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期的細(xì)菌數(shù)量多,能加快對(duì)污染物的降解。

由圖2(b)可知,在較大pH 值范圍(6 ～9)內(nèi)菌株KD1 對(duì)苯酚的降解均保持在90% 以上,說(shuō)明菌株有較大的pH 值適用性,能較好地適應(yīng)酸堿的變化,在實(shí)際廢水處理系統(tǒng)中可以耐受較大的酸堿負(fù)荷沖擊[21],而在低pH 值下喹啉的降解會(huì)受到影響,可能是降解喹啉的過(guò)程中產(chǎn)生了酸性的中間產(chǎn)物[22],產(chǎn)酸過(guò)程會(huì)引起微生物表面電荷分布的變化[23],進(jìn)而影響對(duì)喹啉的吸收和利用。

由圖2(c)可知,菌株KD1 在溫度為30 ～35 ℃時(shí)對(duì)苯酚和喹啉的降解效果較好,這與大多數(shù)降解菌株一致[24-25];當(dāng)溫度超過(guò)40 ℃時(shí),二者的降解率均開始下降,這是由于代謝過(guò)程所需的酶因高溫失活而變性[26]。在工程實(shí)踐中尤其是夏季高溫時(shí),可能會(huì)影響工藝的效果。

圖2 不同條件對(duì)KD1 降解苯酚和喹啉的影響Fig.2 Effects of different factors on degradation of phenol and quinoline by KD1

由圖2(d)可知,菌株KD1 對(duì)苯酚和喹啉的降解率隨著振蕩器轉(zhuǎn)速的提高先逐漸升高而后降低。當(dāng)轉(zhuǎn)速為150 r/min 時(shí),對(duì)苯酚的降解率達(dá)到90% ,并且對(duì)喹啉的降解率達(dá)到了70% ;進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)速后,苯酚和喹啉的降解率沒(méi)有提高反而降低。這是由于KD1 對(duì)苯酚和喹啉的降解屬于好氧反應(yīng),提高振蕩轉(zhuǎn)速能增加培養(yǎng)基中的溶解氧量[27],但過(guò)高的振蕩速度會(huì)產(chǎn)生較大的切向力,不利于菌體的生長(zhǎng)。

2.3 外加碳源和氮源對(duì)降解的影響

2.3.1 對(duì)降解苯酚和喹啉單基質(zhì)的影響

外加碳源和氮源對(duì)菌株KD1 降解苯酚的影響如圖3(a)所示。無(wú)外加氮源時(shí),苯酚降解率幾乎不隨時(shí)間變化,降解率較低;外加氮源時(shí),菌株KD1 對(duì)苯酚的降解率呈線性升高趨勢(shì),表明氮源能制約苯酚降解,這是由于苯酚的分子結(jié)構(gòu)中不含N 原子,不能作為微生物生長(zhǎng)所需的N 源。通常,煤化工廢水中氮含量為200 mg/L,在實(shí)際應(yīng)用中不會(huì)因氮源的缺失而影響苯酚的降解。外加氮源條件下,無(wú)外加碳源時(shí)KD1 對(duì)苯酚的降解率最高,48 h 內(nèi)能將500 mg/L 的苯酚完全降解,說(shuō)明菌株KD1 能以苯酚為碳源進(jìn)行生長(zhǎng);而外加碳源時(shí)能縮短降解過(guò)程的遲緩期,但會(huì)影響苯酚的最終降解率。

外加碳源和氮源對(duì)喹啉降解的影響如圖3(b)所示。無(wú)外加碳源和氮源時(shí),菌株KD1 在60 h 對(duì)400 mg/L 喹啉的降解率達(dá)到91% ,說(shuō)明菌株KD1能以喹啉作為生長(zhǎng)的碳源和氮源;添加碳源和氮源時(shí),喹啉的降解率在各個(gè)時(shí)間均最低,說(shuō)明KD1 菌株會(huì)優(yōu)先利用外加的碳源和氮源作為生長(zhǎng)的能源物質(zhì);無(wú)添加碳源或氮源時(shí),菌株對(duì)喹啉的降解率較高,并且以喹啉為碳源時(shí)喹啉的降解率更高。

圖3 外加碳源氮源對(duì)KD1 降解苯酚和喹啉單基質(zhì)的影響Fig.3 Effect of carbon and nitrogen on degradation of phenol (a)and quinoline (b)by KD1 respectively

2.3.2 降解苯酚和喹啉共基質(zhì)的影響

KD1 在外加碳源、氮源相互作用下對(duì)共基質(zhì)污染物的降解如圖4 所示。無(wú)外加碳源和氮源時(shí),KD1 在48 h 內(nèi)能完全降解300 mg/L 的苯酚,對(duì)150 mg/L 喹啉的降解率達(dá)到90% 。苯酚的降解過(guò)程需要外加氮源,由于喹啉可以作為菌株KD1 生長(zhǎng)所需的氮源從而起到了協(xié)同降解作用。同時(shí)添加碳源和氮源時(shí),能促進(jìn)菌株KD1 對(duì)兩種污染物的降解,極大縮短了降解時(shí)間,24 h 內(nèi)就達(dá)到最大降解率,與不添加碳源和氮源時(shí)相比,降解率提高約10 倍。只添加氮源時(shí),菌株KD1 能夠在36 h 內(nèi)完全降解苯酚,對(duì)喹啉的降解率約為90%;只添加碳源時(shí),苯酚的降解率為50%,喹啉的降解率為40%,這說(shuō)明添加氮源比添加碳源更能促進(jìn)菌株KD1 對(duì)苯酚和喹啉共基質(zhì)污染物的降解。

圖4 外加碳源氮源對(duì)KD1 降解苯酚和喹啉雙基質(zhì)的影響Fig.4 Effect of carbon and nitrogen sources on degradation of phenol and quinoline by KD1

2.4 苯酚和喹啉的降解特性

2.4.1 菌株KD1 對(duì)苯酚的降解特性

菌株KD1 對(duì)不同初始濃度苯酚的降解如圖5(a)所示。菌株能夠?qū)⒊跏紳舛葹?00 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L、600 mg/L 和700 mg/L 的苯酚分別在8 h、16 h、24 h、24 h、32 h、48 h 和56 h 內(nèi)完全降解。菌株KD1 對(duì)苯酚的降解效率,明顯高于降解200 mg/L 苯酚需要96 h 的Pseudoxanthomonassp.[28]和降解600 mg/L 苯酚需要60 h 的Brucellasp.[29],降解效果也明顯好于對(duì)64 mg/L 苯酚降解率為21% 的Ochrobactrumsp.[30]。KD1 對(duì)900 mg/L 苯酚的降解率為71% ,略低于目前發(fā)現(xiàn)的高效單基質(zhì)降解菌Ochrobactrumsp.CH10[23]的92%。這是由于菌株KD1 為針對(duì)多基質(zhì)廢水處理的,因此對(duì)于單一高濃度苯酚的降解并未表現(xiàn)出更好的效果。當(dāng)苯酚濃度達(dá)到800 mg/L時(shí),菌株KD1 對(duì)苯酚的降解出現(xiàn)遲緩,且菌株的生長(zhǎng)也出現(xiàn)了較長(zhǎng)的抑制期。

圖5 菌株KD1 對(duì)苯酚的降解過(guò)程及動(dòng)力學(xué)Fig.5 Degradation process and kinetics of phenol by strain KD1

有機(jī)物的生物降解過(guò)程本質(zhì)上是化學(xué)反應(yīng),通常可以通過(guò)下式表示:

式中,C為基質(zhì)的濃度,mg/L;K為降解速率常數(shù),h;t為反應(yīng)時(shí)間,h;n為反應(yīng)級(jí)數(shù)。

當(dāng)n=0 時(shí),兩邊積分得

反應(yīng)過(guò)程呈零級(jí)反應(yīng)特征;

當(dāng)n=1 時(shí),兩邊積分整理得

降解速率與底物濃度呈線性關(guān)系,反應(yīng)過(guò)程呈一級(jí)反應(yīng)特征。

分別用零級(jí)和一級(jí)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行擬合發(fā)現(xiàn),苯酚濃度小于800 mg/L 時(shí),KD1 對(duì)苯酚的降解過(guò)程較符合零級(jí)反應(yīng)特征,如圖5(b)所示,且反應(yīng)速率隨苯酚濃度的升高逐漸增加;而繼續(xù)提高苯酚濃度時(shí),其降解速率逐漸降低,可能是底物濃度較高會(huì)對(duì)降解菌株產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制作用[31]。

KD1 在不同苯酚濃度下的比生長(zhǎng)速率如圖6所示,其生長(zhǎng)過(guò)程符合Haldane 底物抑制模型:

圖6 KD1 在不同初始濃度苯酚的比生長(zhǎng)速率Fig.6 Specific growth rate of strain KD1 in different concentrations of phenol

其相關(guān)性系數(shù)為0.981,其抑制濃度為293 mg/L,高于惡臭假單胞菌[32]、Candida albicansPDY-07[33]和波茨坦短芽孢桿菌[34]?？梢钥闯?菌株KD1 在一定的苯酚濃度范圍內(nèi)的比生長(zhǎng)速率先增加后減小,當(dāng)苯酚濃度為172 mg/L 時(shí),比生長(zhǎng)速率達(dá)到最大0.270 h-1,高于惡臭假單胞菌[32]的最大比生長(zhǎng)速率0.217 h-1。

2.4.2 KD1 對(duì)喹啉的降解特性

菌株對(duì)不同初始濃度喹啉的降解過(guò)程如圖7(a)所示。菌株能夠?qū)⒊跏紳舛葹?0 mg/L、80 mg/L、200 mg/L、300 mg/L 和400 mg/L 的喹啉分別在12 h、12 h、24 h、36 h 和48 h 內(nèi)完全降解,降解過(guò)程較符合零級(jí)反應(yīng)特征,如圖7(b)所示。這與Bacillussp. H1[35]和Rhodococcussp. QL2[36]對(duì)喹啉的降解過(guò)程相似。當(dāng)喹啉濃度為300 mg/L時(shí),反應(yīng)速率常數(shù)達(dá)到最大,為8.47 mg/ (L·h);之后反應(yīng)速率隨喹啉濃度升高開始有所減小,當(dāng)達(dá)到500 mg/L 時(shí),菌株KD1 對(duì)喹啉的降解出現(xiàn)遲緩,且菌株的生長(zhǎng)也出現(xiàn)了抑制期。

圖7 菌株KD1 對(duì)喹啉的降解過(guò)程及動(dòng)力學(xué)Fig.7 Degradation process and kinetics of quinoline by strain KD1

菌株KD1 在不同濃度喹啉中的比生長(zhǎng)速率如圖8 所示。對(duì)其生長(zhǎng)過(guò)程采用Haldane 模型進(jìn)行擬合,有

圖8 KD1 在不同濃度喹啉的比生長(zhǎng)速率Fig.8 Specific growth rate of KD1 at different concentrations of quinoline

其相關(guān)性系數(shù)為0.94,最大比生長(zhǎng)速率為0.106 h-1,Ki=229 mg/L。

Ki表示菌株生長(zhǎng)過(guò)程受底物抑制作用的大小,Ki的值越大,底物對(duì)菌株的毒害作用越小。菌株KD1 的Ki與單基質(zhì)降解菌Rhodococcussp.[31]相比略小,其抑制濃度Ki=387 mg/L;與Ochrobactrumsp.[10]的Ki=241 mg/L 和Acidovoraxsp.[20]的Ki=253 mg/L 相當(dāng);而高于焦化廢水好氧池喹啉濃度(40 ～100 mg/L)。因此,菌株KD1 有較好的應(yīng)用價(jià)值。

2.5 固定化載體的篩選

本文以玉米芯、凝膠小球、凝膠活性炭小球?yàn)檩d體,以不添加菌液為對(duì)照組,研究不同固定化作用下菌株對(duì)苯酚和喹啉的降解情況。通過(guò)單因素方差分析篩選效果較好的固定化方式,結(jié)果如圖9 所示。

圖9 不同固定化載體對(duì)苯酚和喹啉降解的影響Fig.9 Effect of different immobilized carriers on the degradation of phenol and quinoline

由圖9 可見(jiàn),不同時(shí)間下玉米芯對(duì)喹啉的降解與游離菌相比,均無(wú)顯著性差異(P＞0.05),說(shuō)明簡(jiǎn)單的吸附固定法未能提高菌株KD1 對(duì)苯酚和喹啉的降解效果;與游離菌相比,凝膠小球在36 h 之后對(duì)喹啉的降解有顯著性差異(P＜0.05),說(shuō)明包埋法能提高菌株對(duì)苯酚和喹啉的降解效果;與其他固定化載體相比,凝膠活性炭小球在12 h 后對(duì)喹啉的降解有顯著性差異(P＜0.05),說(shuō)明通過(guò)凝膠和吸附法相結(jié)合的方式能顯著提高菌株對(duì)苯酚和喹啉的降解。該固定方式下,36 h 內(nèi)能完全降解400 mg/L 苯酚,同時(shí)使250 mg/L 喹啉降到50 mg/L 以下。

2.6 花生殼活性炭與傳統(tǒng)活性炭固定化效果比較

花生殼活性炭是以花生殼為原料通過(guò)磷酸活化輻照法制備而成的。向含500 mg/L 苯酚和300 mg/L 喹啉的雙基質(zhì)培養(yǎng)基中加入花生殼活性炭、傳統(tǒng)活性炭及通過(guò)包埋制備的凝膠小球,分析花生殼活性炭的性能及包埋下對(duì)雙基質(zhì)降解的影響,結(jié)果如圖10 所示。

圖10 花生殼活性炭與傳統(tǒng)活性炭的性能比較Fig.10 Performance comparison between peanut shell activated carbon and traditional activated carbon

在培養(yǎng)前期,兩種活性炭與兩種凝膠小球?qū)Ρ椒拥娜コ裏o(wú)顯著性差異(P＞0.05),花生殼活性炭對(duì)苯酚和喹啉的吸附作用稍低于傳統(tǒng)活性炭,但在統(tǒng)計(jì)上二者并無(wú)顯著性差異,說(shuō)明在培養(yǎng)前期凝膠小球以吸附為主,且制備的花生殼活性炭達(dá)到了傳統(tǒng)活性炭的效果。與游離菌相比,兩種活性炭凝膠小球在36 h 對(duì)苯酚和喹啉的去除均有顯著性差異(P＜0.05),36 h 將500 mg/L 苯酚完全去除,對(duì)300 mg/L 喹啉的去除也達(dá)到90% 以上,說(shuō)明包埋作用均顯著提高了菌株對(duì)雙基質(zhì)的降解效率。

3 結(jié) 論

針對(duì)單基質(zhì)污染物降解菌在實(shí)際焦化廢水應(yīng)用的局限性大,本研究篩選出能同時(shí)降解苯酚和喹啉的菌株,考察了該菌株的適用環(huán)境條件,研究了該菌株對(duì)苯酚和喹啉的降解過(guò)程,并進(jìn)一步采用生物活性炭固定化法處理,以提高在實(shí)際工藝對(duì)污染物的去除效果。結(jié)果表明:

(1) 從焦化廢水處理系統(tǒng)二沉池污泥中馴化篩選出一株能同時(shí)耐受500 mg/L 苯酚和250 mg/L 喹啉的菌株KD1,經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes faecalis)。

(2) 降解條件優(yōu)化表明,菌株KD1 有較大范圍的酸堿度適應(yīng)能力,在接菌量10% 、初始pH 值7.0、溫度35 ℃、振蕩器轉(zhuǎn)速150 r/min 時(shí),對(duì)苯酚和喹啉的降解效率最高。

(3) 菌株能以苯酚為唯一碳源生長(zhǎng),以喹啉為唯一碳源和氮源生長(zhǎng)。氮源能影響菌株對(duì)苯酚的降解,而共基質(zhì)下菌株能實(shí)現(xiàn)苯酚和喹啉的協(xié)同降解。

(4) 菌株對(duì)低濃度的苯酚和喹啉的降解過(guò)程呈零級(jí)反應(yīng)特征,其生長(zhǎng)過(guò)程符合Haldane 底物抑制模型,在苯酚和喹啉為基質(zhì)的生長(zhǎng)最大比生長(zhǎng)速率分別為0.270 h-1和0.106 h-1。

(5) 制備的新型固定化載體活性炭凝膠小球能顯著提高菌株對(duì)苯酚和喹啉雙基質(zhì)的降解效果。該方法以廢棄物花生殼為原料、采用磷酸活化輻照法制備活性炭,簡(jiǎn)便易操作,可以大大降低工藝成本,并符合綠色環(huán)保的經(jīng)濟(jì)理念,具有較強(qiáng)的推廣應(yīng)用價(jià)值。