南瓜多糖對大腸桿菌感染小鼠腸道損傷的保護作用及其機制研究

陳 茉 白書寧 王 行 呂 浩 董 娜

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030)

腸道是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要器官，與動物機體物質(zhì)代謝和生長發(fā)育密切相關(guān)[1]。大腸桿菌廣泛地分布于自然界內(nèi)，是人和動物腸道中的常居菌，一般情況下不會引起動物疾病，甚至在一定程度上有利于維持動物腸道微生態(tài)的平衡。但在某些情況下，產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(enterotoxigenicEscherichiacoli, ETEC)會表現(xiàn)出致病性，可導(dǎo)致動物機體感染和中毒，引發(fā)各類腸道疾病[2]，ETEC有很多血清型，其中K88是導(dǎo)致畜禽腹瀉的重要病原菌。當(dāng)畜禽感染K88后，病菌會在腸道內(nèi)大量繁殖，引發(fā)動物腹瀉甚至死亡[3-4]，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[5]。

飼糧與動物腸道健康息息相關(guān)，通過開發(fā)功能性飼料添加劑以增強動物抗病抗菌能力，改善動物腸道及機體健康已成為研究熱點[6]。天然植物多糖是一種新型、綠色、高效的飼料添加劑，受到了人們廣泛關(guān)注。其中，南瓜多糖(pumpkin polysaccharide，PP)是一種大量存在于南瓜中的植物多糖[7]，價格相對低廉，且具有抗氧化、提高免疫、降血糖等生物學(xué)功能，對動物腸道菌群具有一定的調(diào)節(jié)作用[8-10]。

本試驗通過灌胃ETEC K88感染小鼠建立腸道炎癥模型，研究PP對小鼠血清生化指標(biāo)、血清及肝臟抗氧化指標(biāo)以及腸道和肝臟炎癥因子表達的影響，探究PP對動物腸道的保護作用及其機制，可以為ETEC感染導(dǎo)致的腸道炎癥提供新的治療思路，并為PP作為飼料添加劑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

PP由陜西某生物有限公司提供(純度為80%)；ETEC來自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所，使用前濃度調(diào)整為5.0×109CFU/mL；血清及肝臟中的總抗氧化能力(T-AOC)和氧化氫酶(CAT)活性采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進行檢測，T-AOC測定試劑盒產(chǎn)品號為A015-1-2，CAT活性測定試劑盒產(chǎn)品號為A007-1-1；白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)的引物由上海生物工程股份有限公司合成；小鼠基礎(chǔ)飼糧購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，其營養(yǎng)水平如表1所示，該飼糧為全價飼糧，由玉米、豆粕、魚粉、面粉、麩皮、碳酸氫鈣、石粉、多種維生素、多種微量元素、多種氨基酸等組成，試驗飼糧為基礎(chǔ)飼糧中添加10 g/kg PP。

表1 基礎(chǔ)飼糧的營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) g/kg

1.2 試驗設(shè)計

將40只健康無特定病原體(SPF級)雄性ICR小鼠(年齡5～6周齡，體重25～27 g)隨機分為4組，每組10只。小鼠圈養(yǎng)在溫度和濕度均可控的環(huán)境中，室溫在(21±2) ℃，相對濕度在40%～60%。小鼠自由采食、飲水1周，使其適應(yīng)環(huán)境，消除應(yīng)激。7 d后進入試驗期，試驗期為21 d。小鼠分組情況如下：1)對照(C)組：試驗期飼喂基礎(chǔ)飼糧，第18～20天14:00每天每只小鼠灌服無菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS)0.2 mL；2)ETEC組：試驗期飼喂基礎(chǔ)飼糧，第18～20天14:00每天每只小鼠灌服ETEC K88(濃度為5.0×109CFU/mL)0.2 mL；3)PP組：試驗期飼喂試驗飼糧，第18～20天14:00每天每只小鼠灌服無菌PBS 0.2 mL；4)ETEC+PP組：試驗期飼喂試驗飼糧，第18～20天14:00每天每只小鼠灌服ETEC K88(濃度為5.0×109CFU/mL)0.2 mL。

試驗于第21天對小鼠進行乙醚麻醉，在處死前對全部小鼠進行眼球摘取采血，靜置30 min后，4 ℃的條件下3 000 r/min離心10 min，用于制備血清；再脫頸處死，取小鼠的肝臟、脾臟，同時取小鼠結(jié)腸組織，用PBS漂洗干凈后，放入液氮中快速封存，再置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 臨床表現(xiàn)觀察及疾病活動指數(shù)評估

灌服菌液后，每天觀察并記錄小鼠活動、精神狀態(tài)、呼吸、毛發(fā)及腹瀉等情況，并于第21天處死，取樣前對小鼠臨床表現(xiàn)進行評分。小鼠ETEC感染后疾病活動指數(shù)評估標(biāo)準(zhǔn)[11]如表2所示。

表2 小鼠ETEC感染后疾病活動指數(shù)評估標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Disease activity indexes of mice infected with ETEC

1.4 臟器指數(shù)測定

在小鼠宰前進行稱重，脫頸處死后，立即取出肝臟和脾臟，用PBS沖洗并用濾紙吸干表面水分后精確稱重、記錄。計算公式如下：

臟器指數(shù)(mg/g)=器官重量(mg)/活體重量(g)。

1.5 血清生化指標(biāo)測定

血清生化指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性由黑龍江省哈爾濱市省醫(yī)院協(xié)同檢測完成，使用Beckman Coulter美國全自動生化分析儀(UnicelDxC800 Synchron Clinical System)分析。

1.6 血清及肝臟抗氧化指標(biāo)測定

血清及肝臟抗氧化指標(biāo)采用南京建成生物工程研究所的抗氧化試劑盒進行檢測，取各組小鼠的血清及肝臟組織，按照試劑盒說明書檢測方法測定樣本T-AOC及CAT活性。

1.7 腸道與肝臟組織炎癥因子表達水平測定

將組織樣品稱取0.1 g左右于研磨管中，加入1 mL Trizol，振蕩溶解。冰上靜置15 min，4 ℃條件離心；加入氯仿后振蕩離心分相，經(jīng)異丙醇及75%無水乙醇沉淀及洗滌，干燥后加入70 μL焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解；以提取的總RNA為模板，將RNA進行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系為10 μL，總RNA為2.5 μL，反轉(zhuǎn)錄條件為37 ℃，15 min及85 ℃ 5 s。RT產(chǎn)物cDNA放于-20 ℃保存。然后進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測炎癥因子IL-6、TNF-α和IL-1βmRNA相對表達水平情況，所用引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表3。qRT-PCR反應(yīng)采用SYBR Green Real-Time PCR進行。反應(yīng)體系為10 μL，配好混合液進行反應(yīng)。以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參，根據(jù)2-ΔΔCt方法計算各目的基因的相對表達量。

表3 實時熒光定量PCR引物序列Table 3 Quantitative real-time PCR primer sequence

1.8 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2016初步處理，SPSS 26.0分析數(shù)據(jù)，用Duncan氏法檢驗進行多組間差異顯著性分析，數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 PP對ETEC感染小鼠疾病活動指數(shù)的影響

如圖1所示，在第1～4天時，C組及PP組無明顯癥狀，疾病活動指數(shù)未見明顯上升；灌服ETEC后，ETEC組小鼠逐漸顯現(xiàn)出精神萎靡、反應(yīng)遲緩、采食量降低以及活動減弱等癥狀，疾病活動指數(shù)迅速升高；而ETEC+PP組疾病活動指數(shù)增長相對緩慢，在第3天時，ETEC+PP組疾病活動指數(shù)顯著低于ETEC組(P<0.05)，在第4天時，無顯著性差異(P>0.05)。這表明采食添加0.1% PP的飼糧一定程度上能緩解灌服ETEC小鼠的應(yīng)激反應(yīng)。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。Different small letters mean significant difference (P<0.05). The same as below.圖1 PP對小鼠感染ETEC后疾病活動指數(shù)的影響Fig.1 Effects of PP on disease activity indexes of mice infected with ETEC

2.2 PP對ETEC感染小鼠臟器指數(shù)的影響

如表4所示，較于C組，ETEC極顯著提高了小鼠的肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)(P<0.01)；ETEC+PP組的小鼠其肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)相比于ETEC組極顯著降低(P<0.01)。這表明PP具有減輕小鼠腸道炎癥代謝器官損傷的作用。

表4 PP對ETEC感染小鼠臟器指數(shù)的影響Table 4 Effects of PP on organ indexes in mice infected with ETEC mg/g

2.3 PP對ETEC感染小鼠血清生化指標(biāo)的影響

如表5所示，與ETEC組相比，ETEC+PP組血清AST及ALT活性略有下降，但無顯著性差異(P>0.05)。與C組相比，ETEC組血清T-AOC及CAT活性極顯著降低(P<0.01)，而ETEC+PP組則極顯著地改善了這種情況(P<0.01)。結(jié)果表明，灌服ETEC后，血清抗氧化平衡遭到破壞，抗氧化能力顯著降低，PP可以增強機體抗氧化能力，恢復(fù)血清抗氧化平衡。

表5 PP對ETEC感染小鼠血清生化指標(biāo)的影響Table 5 Effects of PP on serum biochemical indexes in mice infected with ETEC

2.4 PP對ETEC感染腸道炎癥小鼠肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

如表6所示，與C組相比，ETEC組肝臟中的CAT活性和T-AOC均有降低的趨勢(P>0.05)，而ETEC+PP組的這些指標(biāo)均有升高的趨勢，但無顯著差異(P>0.05)

表6 PP對ETEC感染小鼠肝臟抗氧化指標(biāo)的影響Table 6 Effects of PP on antioxidant indexes in liver of mice infected with ETEC U/mg prot

2.5 PP對ETEC感染小鼠腸道和肝臟炎性細(xì)胞因子表達水平的影響

由圖2可知，ETEC組小鼠腸道中IL-6、TNF-α、IL-1β的mRNA相對表達量均顯著高于C組(P<0.05)，同時，ETEC+PP組的IL-6和IL-1βmRNA相對表達量顯著低于ETEC組(P<0.05)，TNF-αmRNA相對表達量相較于ETEC組無顯著性差異(P>0.05)?？偟膩碚f，PP可以降低ETEC引起的小鼠腸道組織促炎因子的表達增加，減輕腸道炎癥。

圖2 PP對ETEC攻毒小鼠腸道炎性細(xì)胞因子mRNA相對表達量的影響Fig.2 Effects of PP on mRNA relative expression levels of inflammatory cytokines in intestinal tract of mice with ETEC

由圖3可知，ETEC組小鼠肝臟中IL-6、TNF-α及IL-1βmRNA相對表達量均顯著高于C組(P<0.05)，而ETEC+PP組的IL-6、TNF-α及IL-1βmRNA相對表達量顯著低于ETEC組(P<0.05)，這表明PP能有效抑制肝臟炎性細(xì)胞因子釋放，緩解肝臟炎癥。

圖3 PP對ETEC攻毒小鼠肝臟炎性細(xì)胞因子mRNA相對表達量的影響Fig.3 Effects of PP on mRNA relative expression levels of inflammatory cytokines in live of mice with ETEC

3 討 論

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌ETEC是一種重要的人畜共患病原體，通常會感染幼年畜禽，引起敗血癥、腸炎和畜禽死亡等情況，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。以往對于ETEC感染的預(yù)防及治療多依賴于抗生素。然而，由于抗生素濫用造成的耐藥性及殘留等隱患危害著畜禽產(chǎn)品的生物安全，我國已全面禁止飼料中添加抗生素，抗生素替代產(chǎn)品的開發(fā)迫在眉睫。近年來，開發(fā)功能性飼料添加劑從而促進動物生長、預(yù)防病原菌感染以及改善動物腸道健康成為研究熱點。值得關(guān)注的是，來源于天然植物提取物的植物多糖，其作為飼料添加劑不僅可以提供糖類、氨基酸、纖維素、維生素等營養(yǎng)素，還具有抑制細(xì)菌生長、調(diào)節(jié)腸道菌群、增強機體免疫力、抗氧化等作用，有望成為飼料中理想的抗生素替代物。本研究采用灌服大腸桿菌ETEC K88建立腸炎模型[12-13]，以探究PP對小鼠腸道損傷的保護作用及其機制。

ALT和AST是肝臟細(xì)胞內(nèi)重要的氨基轉(zhuǎn)移酶及代謝酶[14]。肝臟受損時，血清中ALT和AST活性會明顯升高[15-16]。因此，血清中ALT和AST活性在一定程度上可以反映肝臟細(xì)胞損傷情況。研究結(jié)果顯示，健康SPF級雄性ICR小鼠灌服產(chǎn)腸毒素大腸桿菌后，雖然肝臟沒有明顯的病理現(xiàn)象，但血清中ALT、AST活性升高，肝臟指數(shù)顯著上升，而飼喂0.1% PP試驗飼糧(ETEC+PP組)的小鼠肝臟指數(shù)及血清中ALT、AST活性相較于ETEC組均顯著下降。李毅騰等[17]研究證實了PP的提取物對于糖尿病大鼠血清AST、ALT活性具有顯著的改善作用。本試驗結(jié)果表明，PP可以通過降低血清關(guān)鍵轉(zhuǎn)氨酶活性來緩解ETEC對肝臟功能的損傷，對動物機體具有一定的保護作用。

CAT活性及T-AOC是評價動物機體抗氧化能力的常用指標(biāo)，當(dāng)機體受到損傷時，血清及組織抗氧化平衡遭到破壞，抗氧化能力降低[18]。感染產(chǎn)腸毒素ETEC K88的小鼠肝臟以及血清中T-AOC及CAT的活性降低，說明其機體抗氧化與氧化系統(tǒng)的平衡被破壞，這可能進一步加劇組織和細(xì)胞的損傷。而ETEC+PP組小鼠血清CAT活性和T-AOC相較于ETEC組顯著升高。宋麗君等[19]研究發(fā)現(xiàn)，PP灌胃小鼠血清CAT活性極顯著增加。以上結(jié)果表明，PP可以通過提高自由基清除系統(tǒng)的活性來平衡機體代謝過程中不斷產(chǎn)生的自由基，使得機體免受ETEC感染引起的抗氧化機能損傷。

小鼠的腸道炎癥反應(yīng)往往伴隨促炎細(xì)胞因子釋放的增加，所以小鼠腸道炎癥的嚴(yán)重程度可通過檢測促炎細(xì)胞因子(包括IL-6、TNF-α和IL-1β)的表達水平來評估。本試驗結(jié)果表明，灌胃ETEC后，ETEC組小鼠肝臟以及腸道IL-6、TNF-α以及IL-1β的mRNA相對表達量顯著增加，ETEC+PP組小鼠炎性細(xì)胞因子mRNA相對表達量較ETEC組顯著下降，表明PP可以有效抑制IL-6、TNF-α以及IL-1βmRNA相對表達量，說明PP具有一定的抗炎作用。

在動物生產(chǎn)中，黃芪多糖、白術(shù)多糖、牛膝多糖等多糖可在一定程度替代抗生素保護腸道免受損傷[20]。值得注意的是，不僅在傳統(tǒng)意義上的藥用植物，在非藥用植物中也有大量多糖在動物生產(chǎn)中應(yīng)用，例如海藻多糖、苜蓿多糖等。但是目前對于PP作為一種新型添加劑應(yīng)用于飼糧卻鮮有報道。PP具有多重生物功能，與硒化枸杞多糖相比，PP具有更明顯的保護肝臟的能力[21]。研究發(fā)現(xiàn)，PP消化率更高，不僅具有抗炎作用，還可以抗腫瘤[22-23]，并且南瓜來源廣泛，價格低廉[24]。因此，相較于其他多糖，PP有更為廣闊的應(yīng)用前景。

4 結(jié) 論

本試驗通過灌胃ETEC K88感染小鼠建立腸道炎癥模型，研究PP對小鼠血清生化指標(biāo)、血清及肝臟抗氧化指標(biāo)以及腸道和肝臟炎癥因子表達的影響，探究PP對動物腸道的保護作用及其機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加PP對ETEC感染小鼠機體損傷有一定的保護作用，并且提高了機體抗氧化能力，使機體免受ETEC感染引起的抗氧化機能損傷，同時，PP可抑制腸道及肝臟炎癥因子的表達，對動物機體炎癥反應(yīng)具有緩解作用。