尺寸均一微球制劑的研究進展

韋祎，馬光輝

（中國科學(xué)院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室，北京 100190）

引 言

微球是20世紀(jì)末發(fā)展起來的新型給藥技術(shù)，一般直徑為1～250μm，其中小于500nm的稱為納米微球[1-2]。利用生物可降解型聚合物制備微球給藥系統(tǒng)，可以解決蛋白多肽類藥物在胃腸道環(huán)境下不穩(wěn)定，難以口服；注射時因其在體內(nèi)循環(huán)時間短需頻繁給藥，患者順應(yīng)性差的難題[3-10]，達(dá)到長效緩釋和減少給藥次數(shù)的目的。另外，難溶化學(xué)藥物往往需要以油作為載體，注射時易造成注射部位的疼痛且難以在體內(nèi)保持穩(wěn)定的血藥濃度。因此，通過用微球包埋這類藥物制備緩釋注射制劑，使藥物在患部緩慢釋放，減輕不良反應(yīng)和減少給藥次數(shù)[11-15]。此外，基于納微球的靶向制劑設(shè)計，為高效低毒的抗腫瘤藥物遞送提供了嶄新的手段[16-22]，有助于克服直接給藥過程中的弊端。納微球還被應(yīng)用于疫苗制劑中，用于增強抗原免疫后的應(yīng)答水平[23-30]。

然而，傳統(tǒng)的微球制備方法包括機械分散法[31]、噴霧法等[32-33]，存在著單位產(chǎn)品的耗熱量大、設(shè)備的熱效率低、微球產(chǎn)品易吸附于干燥器室壁上，造成收率較低等問題。同時，大多微球市售制劑在生產(chǎn)過程中因為粒徑不夠均一，需要進行篩分，造成原料的浪費；上述方法制備的微球即使篩分后，大小仍參差不齊、粒度分布較寬，這不僅導(dǎo)致產(chǎn)品批次間制備重復(fù)性不佳，且粒徑不均一會制約微球構(gòu)效關(guān)系的研究，嚴(yán)重影響應(yīng)用效果，帶來不可預(yù)料的不良反應(yīng)。因此，尺寸均一、可控的微球產(chǎn)品是醫(yī)藥制劑的關(guān)鍵核心。本團隊研制的微孔膜乳化技術(shù)順利解決了高端均一納微球產(chǎn)品的制備技術(shù)瓶頸，技術(shù)和裝備成熟，可以提高原料藥利用率、降低成本浪費、減少有機試劑的使用，更加高效綠色。本文將對本團隊基于微孔膜乳化制備均一載藥微球的相關(guān)研究進行總結(jié)，介紹均一微球的重要性和制備新技術(shù)；系統(tǒng)闡述微球制劑在長效緩釋、疫苗遞送、抗腫瘤藥物遞送中的應(yīng)用研究，以及微球的均一性在應(yīng)用中的重要作用。

1 制備均一載藥物微球的新技術(shù)

本團隊成功發(fā)展了可制備均一生物顆粒的膜乳化過程和裝備，應(yīng)用于醫(yī)藥、生物分離介質(zhì)、細(xì)胞培養(yǎng)微載體等領(lǐng)域[34-44]。制備乳液的膜乳化技術(shù)分為直接膜乳化技術(shù)(direct membrane emulsification)和快速膜乳化技術(shù)(premix membrane emulsification)，下面對這兩種膜乳化技術(shù)原理進行介紹。

1.1 直接膜乳化技術(shù)

直接膜乳化的原理如圖1(a)所示，分散相即內(nèi)水相或者內(nèi)油相在儲存罐中受氣體壓力作用，緩慢通過膜孔，在該過程中，乳滴在膜孔出口處受到連續(xù)相攪拌時的曳力、乳滴浮力、界面張力和膜壓力，在這四種力的作用下，乳液在膜孔口上由小變大，逐漸生長形成均一乳滴。在這個過程中，分散相和連續(xù)相的成分、過膜壓力均可以影響乳液在膜表面的行為，如乳滴生長速度、脫離時間等；而膜孔徑?jīng)Q定了乳滴最終離開膜表面時粒徑的大小[45]。因此可對膜孔徑、過膜壓力以及分散相和連續(xù)相的組成進行適當(dāng)調(diào)控制備出為膜孔徑2～10倍的均一粒徑乳滴[46]。

圖1 直接膜乳化技術(shù)(a)及快速膜乳化技術(shù)(b)示意圖Fig.1 Schematic representation of direct membrane emulsification(a)and premix membrane emulsification(b)

在直接膜乳化過程中，因分散相需要在膜表面有足夠的界面張力，才能在膜孔口上生長出液滴，故分散相不能潤濕膜孔。因此一般O/W型乳液滴的制備采用親水性膜，而W/O型乳液滴制備采用疏水性膜。本團隊分別采用親水性的微孔膜和疏水性的微孔膜，成功地制備了尺寸均一可控的聚乳酸(PLA)微球、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)微球、瓊脂糖微球、葡甘聚糖微球、殼聚糖微球和溫度-pH雙重敏感的殼聚糖季銨鹽微球等[47-51]。直接膜乳化操作方式可以很好地控制乳滴的粒徑，制備過程溫和，但乳液滴形成速率 緩 慢，其 通 量 一 般 在0.01 ～0.1m3/(m2·h)范圍內(nèi)[52]。

1.2 快速膜乳化技術(shù)

快速膜乳化法是首先通過常規(guī)的乳化方式如機械攪拌、均質(zhì)等方法制備所需要的預(yù)乳液，然后將預(yù)乳液通過較高的氮氣壓力迅速壓過膜孔形成最終乳液滴[53]。其原理如圖1(b)所示，與直接膜乳化的原理不同，快速膜乳化是較大的液滴在膜孔口處受到壓力發(fā)生形變，生成小且均一的液滴。所受壓力越大，乳液受到的擠壓越劇烈，形成的乳液滴尺寸越小。因此，選擇合適的壓力可以制備出具有目標(biāo)粒徑、尺寸均一的微球。由于在該技術(shù)中，均一乳滴的形成并非是在膜孔口生長脫落，而是乳液破碎，所以得到的乳液粒徑尺寸比膜孔徑小(為膜孔徑的1/3～1/2)。該方法相比于直接膜乳化技術(shù)，效率明顯提高，乳液過膜的通量一般大于1m3/(m2·h)[54]。本團隊采用快速膜乳化技術(shù)成功地制備了尺寸均一可控的聚乳酸-聚乙二醇共聚物(PELA)微球、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)微球和殼聚糖微球等[12,14,55-60]。

為了盡可能地避免制備過程中人為操作因素造成的誤差以及雜質(zhì)、細(xì)菌的污染，本團隊研發(fā)了自動化膜乳化設(shè)備，已用于企業(yè)的中試和生產(chǎn)。圖2為商品化膜乳化設(shè)備，分別可以單次處理500ml以及15L體系的乳液，可以滿足實驗室規(guī)模、小試規(guī)模及中試生產(chǎn)規(guī)模的需求，設(shè)備上還可配有控溫系統(tǒng)，溫度調(diào)節(jié)0～150℃。

圖2 商品化膜乳化設(shè)備Fig.2 Commercially availabl membrane emulsification equipment

2 均一微球包埋藥物的重要性

2.1 綠色環(huán)保、降低成本

利用膜乳化技術(shù)生產(chǎn)均一粒徑微球可以顯著降低原輔料成本，更符合綠色化工的需求。由于目前商品化微球制劑的制備多為傳統(tǒng)包埋方法，為了獲得穩(wěn)定乳液，需要在外水相中添加大量的乳化劑[61]，尤其是對于機械攪拌法制備微球，需要較高濃度的乳化劑(2%～10%(質(zhì)量))來維持油水界面的穩(wěn)定性[62-64]；而對于膜乳化技術(shù)，因其制備的乳液均一、穩(wěn)定，所需的乳化劑用量較低，外水相中添加1%～1.5%(質(zhì)量)的乳化劑即可較好地穩(wěn)定油水界面[38,55,65]。產(chǎn)品的后清洗次數(shù)隨之減少，在“三廢”的處理上更簡單快捷。

另外，常規(guī)方法制備的微球大小參差不齊、粒度分布較寬，注射給藥時易堵塞針頭。為了解決這個難題，研究者將制備好的載藥微球經(jīng)過一定尺寸的篩網(wǎng)進行篩分，以獲得理想尺寸的載藥微球，導(dǎo)致原料藥和輔料的浪費，成本增加；同時，基于膜乳化技術(shù)制備粒徑均一微球整個過程平緩溫和，產(chǎn)熱量較少，對微球所包埋的活性物質(zhì)損失較少?？傮w而言，可以節(jié)省約40%的原輔料，進一步降低原輔料成本。另外，在工藝成本方面，膜乳化技術(shù)制備的微球粒徑均一，省去了篩分及后續(xù)篩網(wǎng)清潔、再生的處理工藝，簡化了整體流程，顯著降低均一微球生產(chǎn)的工藝成本。

2.2 利于規(guī)模放大、批次間重復(fù)性好

尺寸均一特性是微球放大生產(chǎn)的重要保障，只有保證批次間良好的重復(fù)性，才能保證緩釋制劑的治療效果的重復(fù)性。當(dāng)進行微球制劑放大制備時，傳統(tǒng)攪拌方法面臨的粒徑制備重復(fù)性問題會更加突出，而膜乳化技術(shù)對均一微球的制備具有良好的可控性。本團隊成功發(fā)展了膜乳化技術(shù)大規(guī)模制備醫(yī)用緩釋微球，批次間重復(fù)性好，并將技術(shù)產(chǎn)業(yè)化[49,66]。在GMP實驗室大規(guī)模生產(chǎn)的十余批微球，其批次間的粒徑大小標(biāo)準(zhǔn)偏差在5%以下，進一步證明膜乳化技術(shù)對微球粒徑控制的穩(wěn)定性。目前采用膜乳化技術(shù)已研發(fā)制備出了多種藥物(如醋酸曲普瑞林、艾塞那肽、膜融合抑制劑等多肽類藥物，羅哌卡因、紫杉醇等小分子難溶性藥物)的微球制劑[67-69]。

2.3 利于研究構(gòu)效關(guān)系

利用傳統(tǒng)方法制備的微球大都粒徑分布較寬，微球大小參差不一，會制約對微球構(gòu)效關(guān)系的研究。當(dāng)利用微球進行免疫學(xué)效應(yīng)的研究時，不均一微球會導(dǎo)致抗原在體內(nèi)分布不規(guī)律，實驗結(jié)果的波動性顯著放大[70-72]。同時，也有相關(guān)文獻(xiàn)表明微球作為藥物載體，其粒徑不僅影響其釋放速度，而且會影響其在體內(nèi)分布和吸收，從而影響最終的治療效果[39,73]。例如，Wei等[74]在制備出三種粒徑均一的殼聚糖微球(2.1 ,7.2 ,12.5 μm)的基礎(chǔ)上，進行動物口服給藥研究，研究了粒徑對其在消化道內(nèi)分布的影響。結(jié)果如圖3所示，粒徑對殼聚糖微球在消化道內(nèi)的分布有顯著影響，小粒徑的微球(2.1 μm)在回腸和結(jié)腸分布數(shù)量最多，表明其能較多地通過回腸和結(jié)腸吸收。

圖3 三種粒徑的殼聚糖微球在消化道的分布[74]Fig.3 Distribution of chitosan microspheres with different diameters in gastrointestinal(GI)tract[74]

3 均一載藥微球的應(yīng)用

3.1 緩釋微球制劑

3.1.1 多肽藥物 在制備多肽載藥微球時，由于多肽分子量小，親水性強，在W/O/W型復(fù)乳液制備階段內(nèi)水相藥物極易向外水相逃逸，造成包埋率低。因此研究者們針對多肽藥物的特性進行研究，制備出高包埋率和高藥物活性的載藥微球。Qi等[38,58,75]以艾塞那肽為模型藥物，利用溶劑揮發(fā)結(jié)合快速膜乳化法制備出粒徑均一的艾塞那肽微球。對超聲(UMS)和均質(zhì)(HMS)兩種初乳制備方法進行了比較，并對藥效學(xué)進行了分析。圖4表明，UMS和HMS兩種載藥微球的粒徑均一，均在20μm左右，粒徑分布系數(shù)Span值小于0.7，包埋率分別為98%和91%；UMS內(nèi)部緊密孔小，藥物分布均勻，HMS內(nèi)部疏松孔多，藥物分布零散。動物藥效實驗中艾塞那肽注射液組每日注射2次，連續(xù)注射14d；微球組只第1d注射1次，其藥物劑量與艾塞那肽溶液組的總劑量相當(dāng)。實驗結(jié)果顯示，艾塞那肽溶液組的降血糖率在前14d明顯升高，但當(dāng)?shù)?4d停止給藥以后，血糖恢復(fù)到對照組(生理鹽水組)水平。兩種初乳制備法的艾塞那肽微球在前14d均有明顯的降血糖效果；而HMS組在14d后藥效逐漸減弱，UMS組則在30d內(nèi)始終保持一定的降血糖率水平(圖5)。另外，在微球粒徑相同、尺寸均一的基礎(chǔ)上，Qi等[75]首次研究了陽離子(Ca2+、Mn2+和Zn2+)對艾塞那肽的?；种谱饔?，創(chuàng)新性地采用石英晶體微天平(QCMD)分析酰化抑制的微觀機理，結(jié)果表明Zn2+抑制作用最強，Mn2+作用較弱，Ca2+不起作用。

圖4 UMS微球表面形貌(a)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)(b)的SEM圖(標(biāo)尺:10μm)以及藥物內(nèi)部分布共聚焦圖(c)(標(biāo)尺:50μm)HMS微球表面形貌(d)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)SEM圖(e)(標(biāo)尺:10μm)以及藥物內(nèi)部分布共聚焦圖(f)(標(biāo)尺:50μm)[38]Fig.4 Surface morphology(a)and crossing-section(b)SEM images of UMS(scale bar:10μm),CLSM images for distribution of Super Fluor488SE labeled exenatide within UMS(c)(scale bar:50μm),surface morphology(d)and crossing-section(e)SEM images of HMS(scale bar:10μm),CLSM images for distribution of Super Fluor488SE labeled exenatide within HMS(f)(scale bar:50μm)[38]

圖5 UMS、HMS、艾塞那肽溶液和生理鹽水的降血糖率隨時間變化曲線（插圖表示24h內(nèi)降血糖率隨時間的變化）[38]Fig.5 Reduction in blood glucose vs time profiles of UMS,HMS,exenatide solution and saline(the insert presents the reduction in blood glucose vs time within24h)[38]

楊柳青等[76]以胸腺法新為模型藥物，通過優(yōu)化內(nèi)水相體積、油相乳化劑濃度、PLGA濃度、分子量和外水相pH，利用快速膜乳化結(jié)合溶劑揮發(fā)法制備得到了平均粒徑24μm且粒徑均一(Span值為0.6 )的載胸腺法新微球，包埋率大于80%。在粒徑可控基礎(chǔ)上，考察了PLGA分子量對藥物釋放的影響。結(jié)果顯示，隨著PLGA分子量升高，微球的突釋率降低，整個釋放過程更接近零級釋放。并且由于膜乳化技術(shù)的制備過程簡便溫和，克服了傳統(tǒng)方法對藥物分子結(jié)構(gòu)的影響，顯著提高了藥物的實際使用效率。圖6表明胸腺法新微球能持續(xù)釋放藥物，且在體外釋放過程中藥物能夠保持良好的活性，實現(xiàn)了長效穩(wěn)定釋放。

圖6 不同PLGA分子量所制備的微球的體外釋放曲線(a)和不同釋放時間后藥物的高效液相色譜(b)[76]Fig.6 Cumulative drug release profiles in vitro of microspheres prepared with different molecular weights of PLGA and HPLC(a),chromatograms of drugs in release media of microspheres in different incubation times(b)[76]

Jin等[55]用PLGA包埋人類免疫缺陷病毒(HIV)膜融合抑制劑LP-98，使用快速膜乳化技術(shù)結(jié)合溶劑揮發(fā)法，考察了預(yù)復(fù)乳方式、過膜壓力、外水相穩(wěn)定劑濃度、油相PLGA濃度、內(nèi)水相藥物濃度、初乳制備方式等因素對微球性質(zhì)的影響，最終制備出粒徑為14μm、Span＜0.9、載藥量＞8%、包埋率＞95%的均一膜融合抑制劑緩釋微球(LP-98-PLGA microspheres)[圖7(a)]。體內(nèi)藥代動力學(xué)分析顯示，所制備的微球可在大鼠體內(nèi)持續(xù)釋放24d[圖7(b)]。3.1.2 蛋白藥物緩釋微球 蛋白類藥物分子量高，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，在劇烈的制備條件下易變性失活，穩(wěn)定性差，從而降低藥效甚至對機體產(chǎn)生毒副作用。膜乳化過程溫和，可以解決這個問題。本團隊Zhang等[77]以胰島素為模型藥物，采用快速膜乳化技術(shù)和兩步固化工藝制備出平均粒徑約7.5 μm、粒徑分布窄(Span值為0.731 )、球形度好的口服海藻酸鈣-殼聚糖微球。該方法能夠溫和地制備具有均一尺寸的乳液，從而保留胰島素的免疫活性，使其在胃腸道有效吸收。在糖尿病大鼠實驗中，制備的載胰島素口服微球具有持續(xù)的降血糖效果(圖8)。

圖7 LP-98-PLGA微球的電鏡圖(a)；LP-98和LP-98-PLGA微球影響下的LP-98血清濃度隨時間的變化曲線(b)[55]Fig.7 SEM images of LP-98-PLGA microspheres with narrow size distribution(a),LP-98serum concentration vs time profiles of LP-98and LP-98-PLGA microspheres(b)[55]

圖8 糖尿病大鼠口服不含胰島素和含胰島素(100IU/kg)藻酸鹽-殼聚糖微球后的血糖濃度(與不含胰島素的微球有統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異：*p＜0.05 ；**p＜0.01 )[77]Fig.8 The serum glucose concentration after oral administration of insulin-free and insulin-loaded(100IU/kg)alginate-chitosan microspheres to STZ-induced diabetic rats(statistically significant difference from insulin-free microspheres:*p＜0.05 ;**p＜0.01 )[77]

Wei等[13-14,66,78]以重組人生長激素(rhGH)為模型蛋白類藥物，采用復(fù)乳液法結(jié)合快速膜乳化技術(shù)制備了粒徑分布窄的重組人生長激素聚乳酸-聚乙二醇共聚物(PELA)微球。基于微球尺寸均一可控，設(shè)計了PEG與PLA質(zhì)量比分別為1∶9(PELA-1)、1∶14(PELA-2)和1∶19(PELA-3)的PELA共聚物載rhGH緩釋微球，比較了材料親疏水性對微球體外釋放的影響。從圖9可見，親水性較強的PELA-1微球在66d內(nèi)總共釋放了79.8%的重組人生長激素，而親水性較弱的PELA-2和PELA-3微球在同一時期分別釋放了約76.1%和20.1%，且觀察到PELA-3微球有40d的顯著平臺期[78]。3.1.3 小分子藥物緩釋微球 與蛋白多肽類藥物不同，小分子藥物由于分子量小，在微球制備過程中易快速逃逸，導(dǎo)致包埋率降低。為了解決這個問題，本團隊通過快速膜乳化技術(shù)，得到粒徑均一的乳滴，避免了固化過程中的奧斯瓦爾德熟化，保證了載藥微球的高包埋率。Li等[12,35]以羅哌卡因(RVC)為模型藥物，采用乳化法結(jié)合膜乳化技術(shù)制備出平均粒徑17μm，Span值小于0.6 ，包埋率大于80%的均一載藥微球(圖10,RVC HCl solutim為羅哌卡因鹽酸鹽溶液，Blank-MS代表空白微球)。在粒徑均一可控基礎(chǔ)上考察不同端基(羥基、羧基、酯基)的PLGA對微球載藥的影響。大鼠藥效學(xué)實驗表明，羥基端載羅哌卡因微球表現(xiàn)出最佳的長效鎮(zhèn)痛效果。

圖9 三種PELA微球的體外累積釋放圖[78]Fig.9 Cumulative release profiles of rhGH from three PELA microspheres[78]

圖10 不同PLGA端基制備的羅哌卡因微球掃描電鏡圖和藥效學(xué)評價[35]Fig.10 SEM images of OH(a),COOH(b),COOR-RVC-microspheres(c)and pharmacodynamics study of ropivacaine loaded microspheres prepared by different PLGA terminal group(d)[35]

3.2 均一載藥微球在疫苗制劑中的應(yīng)用

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，成分明確、安全穩(wěn)定的新型亞單位疫苗開始出現(xiàn)，但其免疫原性減弱，必須要添加佐劑(免疫增強劑)或采用抗原遞送系統(tǒng)才能獲得強的免疫應(yīng)答。微球同自然界中的細(xì)菌、病毒等尺寸或維度相近，更容易被機體識別為外源性物質(zhì)，具有增強機體免疫應(yīng)答的效果。本團隊Liu等[79]通過快速膜乳化技術(shù)制備出均一粒徑的水/油(W/O)型疫苗制劑，水相為抗原溶液，油相為油佐劑，研究證實粒徑均一的乳液制劑比粒徑分布寬的制劑具有更強的免疫應(yīng)答。在此工作基礎(chǔ)上，Zhang等[28]以PLGA作為微球骨架材料，采取相同的制備方法，制備了負(fù)載咪喹莫特(imiquimod，IMQ)，粒徑約為1μm的均一微球(IMQ-MPs)作為疫苗佐劑。將空白微球(MPs)和IMQ-MPs與細(xì)胞共同孵育12h，結(jié)果表明IMQ-MPs促進細(xì)胞攝取抗原的能力明顯強于MPs，并且可以更好地增強骨髓樹突狀細(xì)胞(BMDCs)和腹腔巨噬細(xì)胞(pMΦs)分泌炎癥因子的能力，這主要源于IMQ-MPs在被攝取之后，伴隨著微球骨架的降解持續(xù)釋放IMQ，促進細(xì)胞的活化。

Liu等[80]以PLGA為材料，以雞卵清白蛋白(OVA)為模型抗原，采用復(fù)乳-溶劑去除法結(jié)合快速膜乳化技術(shù)，并在內(nèi)水相中添加碳酸氫銨，制備得到粒徑約為900nm、尺寸均一的胞內(nèi)pH敏感型納米微球。研究發(fā)現(xiàn)，在模擬胞質(zhì)環(huán)境(pH7.4)中，抗原釋放量24h內(nèi)不足10%，而在模擬胞內(nèi)內(nèi)涵體、溶酶體的弱酸環(huán)境下(pH5.0 ～6.5 )，24h內(nèi)抗原的釋放量超過85%。這主要是由于納微球在溶酶體的酸性環(huán)境中(NH4)2CO3與H+反應(yīng)釋放出NH3和CO2，氣體沖破顆粒外殼的同時進一步增加溶酶體內(nèi)部氣壓，進而將溶酶體脹破，使抗原從溶酶體逃逸到細(xì)胞質(zhì)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。

3.3 均一載藥微球在惡性腫瘤治療中的應(yīng)用

目前大多數(shù)傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物治療缺乏特異性，在人體內(nèi)生物利用度不高，在給藥時需要大劑量，以增加到達(dá)腫瘤部位的概率?；谀[瘤血管的EPR效應(yīng)(enhanced permeability and retention effect)，可以實現(xiàn)藥物的被動靶向，因此納米微球(NP)制劑被認(rèn)為是最有希望向腫瘤組織有效遞送藥物的方式之一[81]。然而，不均一的粒徑和低載藥率會影響臨床治療效果[82-83]。針對以上問題，馬宇峰等[84]在裝載紫杉醇(PTX)的羧甲基殼聚糖球(CNP)表面上修飾三(2-氨基乙基)胺(TAEA)，TAEA可以使CNPs表面富含氨基，從而帶有充足的正電荷；在此基礎(chǔ)上進一步偶聯(lián)2,3-二甲基馬來酸酐(DMMA)，DMMA可以使CNPs表面富含羧基，納米微球PTX-CNP:TAEA:DMMA表面由正電荷轉(zhuǎn)為負(fù)電荷,并通過快速膜乳化技術(shù)實現(xiàn)納米微球的尺寸均一性(150nm，多分散指數(shù)PDI＜0.1 )。結(jié)果表明該輸送體系的初始負(fù)電荷有助于降低巨噬細(xì)胞對納米微球攝取量，從而避免被內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)識別和吞噬，實現(xiàn)在血液中的長循環(huán)。而達(dá)到腫瘤部位后，在腫瘤組織的微酸性環(huán)境下，連接DMMA的酰胺鍵易被水解，從而使微球帶有的正電荷暴露出來，正電荷促進載藥納米微球被腫瘤細(xì)胞的吞噬，這種腫瘤微酸環(huán)境響應(yīng)的智能正負(fù)電荷翻轉(zhuǎn)體系(PTX-CNP:TAEA:DMM納米微球)，顯著提高了對腫瘤細(xì)胞的殺傷效率，半抑制濃度從11.3 Mg/ml降低至4.09 μg/ml。

另外Lv等[85]還利用油/水/油(O/W/O)復(fù)乳法結(jié)合快速膜乳化技術(shù)制備了粒徑均一的納米微球。并利用納米微球表面的羧基引入具有隱形效果的聚乙二醇(PEG)鏈和靶向腫瘤細(xì)胞的三肽序列(RGD)，制備兼具隱形和靶向能力的紫杉醇納米給藥載體(RGDPEG-CNP:PTX)。實驗結(jié)果顯示，該粒徑均一的納米微球給藥制劑可以提高藥物生物利用度以及抗腫瘤效果，并且具有較低的毒副作用(圖11)。

圖11 羧甲基殼聚糖載紫杉醇納米球的掃描及透射電鏡照片(左：掃描電鏡；右:透射電鏡)(a)；空白納米球和羧甲基殼聚糖載紫杉醇納米球?qū)π∈蠓伟┘?xì)胞LLC的細(xì)胞毒性對比(b)[84];RGD-PEG-CNP:PTX的示意圖(c);不同PTX制劑對LLC的細(xì)胞毒性(d)[85]Fig.11 SEM and TEM of carboxymethyl chitosan-loaded paclitaxel nanospheres(left:SEM;right:TEM)(a)，comparison of cytotoxicity of blank nanospheres and carboxymethyl chitosan-loaded paclitaxel nanospheres against LLC(b)[84]，schematic diagram of RGD-PEG-CNP:PTX(c),cytotoxicity of different PTX formulations against LLC(d)[85]

在此研究基礎(chǔ)上，F(xiàn)u等[83]結(jié)合快速膜乳化技術(shù)制備出粒徑在100nm左右的均一粒徑的殼聚糖納米微球(CNPs)，結(jié)合O/W/O復(fù)乳法和程序升溫固化的方式實現(xiàn)阿霉素(DOX)、PTX與Fe2O3納米晶體的共封裝，制備出CNP:Fe/P/D；將磷脂聚乙二醇馬來酰亞胺(DSPE-PEG-MAL)按1∶5的比例與RGD在PBS緩沖液混溶，25℃下反應(yīng)2h得到DSPE-PEGMAL-RGD；將CNPs:Fe/P/D和紅細(xì)胞膜混合通過聚碳酸酯多孔膜10次實現(xiàn)共融合，并在上述共融合的過程中加入DSPE-PEG-MAL-RGD，嵌插在紅細(xì)胞膜磷脂上，構(gòu)建出仿生程序性靶向納米給藥系統(tǒng)RH-CNP:Fe/P/D(圖12)。均一粒徑的CNPs內(nèi)部同時裝載著疏水性的紫杉醇、阿霉素以及氧化鐵納米晶Fe3O4，在Fe3O4介導(dǎo)的磁靶向作用和RGD介導(dǎo)的主動靶向作用下將抗癌藥物高效遞送到腫瘤組織附近，發(fā)揮殺傷作用。實際結(jié)果顯示，利用RHCNP:Fe/P/D治療的小鼠三周存活率達(dá)到100%，遠(yuǎn)高于其他對照組，顯示出良好的抗腫瘤效果。

4 結(jié) 論

本文對制備均一載藥微球的新技術(shù)進行了介紹，對均一載藥微球包埋藥物的重要性進行了闡述，并對均一微球制劑在長效緩釋、疫苗、惡性腫瘤治療中的應(yīng)用進行了總結(jié)，得出以下結(jié)論。

(1)根據(jù)制備乳液過程的原理，膜乳化技術(shù)可分為直接膜乳化和快速膜乳化。其中，直接膜乳化適合制備粒徑較大的微球，快速膜乳化適合制備粒徑較小的微球。本團隊研制出的創(chuàng)新型膜乳化裝備形成了系列化產(chǎn)品，實現(xiàn)了創(chuàng)新技術(shù)和裝備的商品化和推廣應(yīng)用。

(2)尺寸均一的載藥微球在制備和應(yīng)用上均有重要作用。首先，尺寸均一的微球在制備過程中乳化劑用量較低，更加綠色環(huán)保；且不需要額外的微球篩分步驟，減少了原輔料的浪費。其次，均一的微球批次間重復(fù)性好，易于規(guī)模放大，本團隊最早使用該技術(shù)進行均一微球制劑的規(guī)?；a(chǎn)。另外，微球的均一性是研究其構(gòu)效關(guān)系的重要前提，保證實驗結(jié)果可靠。

(3)均一載藥微球在醫(yī)藥領(lǐng)域有著重要應(yīng)用。緩釋微球在制備過程中，根據(jù)裝載藥物的特性，可采取不同的微球材料和包埋策略。均一微球作為藥物和疫苗載體，不僅保證了實驗結(jié)果的可靠性，也提高了生物利用度和成藥性。另外，均一納微球應(yīng)用到腫瘤藥物的遞送系統(tǒng)中，可提高抗腫瘤藥的靶向性，顯著增強療效，減輕不良反應(yīng)。膜乳化技術(shù)作為制備均一粒徑微球的關(guān)鍵技術(shù)，具有顯著的優(yōu)勢，為了更好地發(fā)展膜乳化技術(shù)，推廣其在大規(guī)模均一微球上的生產(chǎn)應(yīng)用，仍要面臨以下挑戰(zhàn)：①需進一步開發(fā)商品化緩釋材料,美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)用于臨床的生物可降解高分子聚合物材料種類和規(guī)格有限，且大都被國外所壟斷;②需深入研究蛋白質(zhì)和相應(yīng)材料的作用關(guān)系,不同的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出不同的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)以及穩(wěn)定性，深入了解緩釋材料和不同蛋白質(zhì)之間的作用關(guān)系可以顯著提高包埋效率并保護蛋白的生物活性;③需開發(fā)多樣化的緩釋輔料，微球劑型在臨床應(yīng)用中，控制突釋效應(yīng)和藥物的釋放速率也是一大挑戰(zhàn),事實上，本團隊前期已有很多研究工作關(guān)于降低藥物的突釋效應(yīng)，如利用聚乳酸-聚乙二醇共聚物(PLA-PEG)代替PLA或PLGA，但仍需要開發(fā)更多樣化的緩釋輔料，改善微球釋放效果，提高藥物的生物利用度。