阿奇霉素顆粒（Ⅱ）微生物限度檢查方法學(xué)驗證

黃霖，王杰，漆鳳梅，劉緒平，霍曉菲

1.景德鎮(zhèn)市市場監(jiān)督管理綜合檢驗檢測中心，江西 景德鎮(zhèn) 333000；2.江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價重點實驗室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029；3.江西中醫(yī)藥大學(xué),江西 南昌 330004

阿奇霉素(Azithaxmaycin)是一種半合成的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,它是作用于細(xì)菌細(xì)胞核糖體50 s 亞單位,阻礙細(xì)菌蛋白質(zhì)合成,起到抑菌作用［1］。對革蘭陽性球菌、陰性球菌、部分革蘭陰性桿菌具有明顯的抗菌效果,適應(yīng)證為中耳炎、鼻竇炎、咽炎、扁桃體炎等上呼吸道感染及支氣管炎、肺炎等下呼吸道感染,皮膚和軟組織感染,沙眼衣原體所致單純性生殖器感染等［2-6］。阿奇霉素具有較強(qiáng)的抗菌活性,薄膜過濾法可有效地除去其抗菌成分［7］。本實驗對通過薄膜過濾法除去阿奇霉素顆粒（Ⅱ）的抗菌活性并進(jìn)行微生物限度檢查法進(jìn)行驗證,確保阿奇霉素顆粒（Ⅱ）微生物限度檢查符合要求［8］,增強(qiáng)制劑用藥安全。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高壓蒸汽滅菌器（型號:YXQ-LS-50S Ⅱ），電子天平（型號：Quintix 6101-1CN），凈化工作臺（型號：SW-CJ-2D），細(xì)菌培養(yǎng)箱（型號：HWS-250），霉菌培養(yǎng)箱美國賽默飛（型號：3758CN），集菌儀（型號:杭州泰林MZ-601）。

1.2 試藥

阿奇霉素顆粒（Ⅱ）（江西億友藥業(yè)有限公司，批號20191101、20191102、20191103，規(guī) 格：1 g∶100 mg），pH 7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號200630-9，江蘇益碼）

1.3 培養(yǎng)基和菌種

見表1，2。

表1 培養(yǎng)基信息

表2 菌種信息

2 方法

2.1 菌液的制備

按照《中國藥典》2015年版四部通則1105 檢查項中的方法,將各試驗菌制成50～100 cfu/mL 的菌懸液。各試驗菌株均為第2 代菌。

2.2 微生物限度檢查方法驗證

2.2.1 供試液制備 取阿奇霉素顆粒（Ⅱ）（批號20191101）10 g，置無菌錐形瓶中，加入pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，振搖溶解，作為1∶10 供試液；取1∶10 供試液10 mL，置無菌錐形瓶中，加入pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，搖勻，作為1∶100 供試液。

2.2.2 預(yù)實驗 參照《中國藥典》2015年版四部通則1105 及阿奇霉素的抗菌特性選取敏感菌金黃色葡萄球菌、白色念珠菌進(jìn)行預(yù)試驗，結(jié)果詳見表3。

表3 預(yù)試驗的結(jié)果

預(yù)實驗結(jié)果表明，阿奇霉素顆粒（Ⅱ）對金黃色葡萄球菌具有一定的抑制作用，而對白色念珠菌沒有明顯的抑制作用，因此采用薄膜過濾法（1∶100的供試液1 mL，沖洗500 mL）進(jìn)行需氧菌總數(shù)計數(shù)，采用平皿法（1∶10 的供試液）進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)。

2.2.3 計數(shù)方法適用性試驗（1）需氧菌總數(shù)計數(shù)法。取上述制備好的1∶100 供試液1 mL 加入到裝有50 mL 的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的薄膜過濾器中，混勻,全量通過濾膜后,再用pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液500 mL 沖洗,沖洗3 次，每次100 mL，在最后一次沖洗液中加入試驗菌（≤100 cfu），濾干，立即貼膜于預(yù)制好的TSA 平板上，置33.0 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h～72 h，逐日觀察結(jié)果。以稀釋液代替菌液，其他操作同上述操作，作為供試品組。以稀釋液替代供試液，其他操作同上述操作，作為供試品菌液組。

試驗組菌回收率=（試驗組菌數(shù)-供試品本底菌數(shù)）/菌液對照組菌數(shù)×100%。根據(jù)回收率公式計算回收率，結(jié)果見表4。如表4 所示，本品采用薄膜過濾法（1∶100 供試液，500 mL/筒）檢查需氧菌總數(shù)，各需氧菌的回收率在0.5～2.0 的范圍內(nèi)均符合藥典規(guī)定。

表4 需氧菌總數(shù)驗證結(jié)果（n=3）

（2）霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)法。取1∶10 的供試液9.9 mL 分別置2 支試管中,每支試管中加入試驗菌液0.1 mL，使供試液中含菌量不大于100 cfu/mL，搖勻。取上述試液注入2 個平皿（1 mL/皿），加入15 mL SDA 至平皿中，置23 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h～120 h，逐日觀察結(jié)果。以稀釋液代替菌液，其他操作同上述操作，作為供試品組。以稀釋液替代供試液,其他操作同上述操作，作為供試品菌液組。

根據(jù)回收率公式計算回收率,結(jié)果見表5。如表5 所示,本品采用常規(guī)法檢查霉菌和酵母菌總數(shù)，白色念珠菌和黑曲霉的回收率在0.5～2.0 的范圍內(nèi)均符合藥典規(guī)定。

表5 霉菌和酵母菌總數(shù)驗證結(jié)果（n=3）

2.2.4 控制菌（大腸埃希菌）檢查 取1∶10 的供試液10 mL，薄膜過濾，用pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液500 mL 沖洗，每次100 mL，在最后一次沖洗液中加入大腸埃希菌試驗菌（≤100 cfu）,取濾膜加入加入TSB 100 mL，然后照《中國藥典》2015年版四部通則1106 控制菌檢查法依法操作。檢查陽性對照組、陰性對照組、供試品對照組、試驗組。結(jié)果見表6，表明阿奇霉素顆粒（Ⅱ）在該條件下，對大腸埃希菌無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計。說明可以采用該法進(jìn)行阿奇霉素顆粒（Ⅱ）的大腸埃希菌檢查。

表6 大腸埃希菌檢查方法驗證結(jié)果

2.3 樣品微生物限度檢查

采用建立的方法對三批阿奇霉素顆粒（Ⅱ）進(jìn)行需氧菌總數(shù)的檢查、霉菌和酵母菌總數(shù)及控制菌的檢查，結(jié)果見表7。結(jié)果表明,建立的檢查方法可用于阿奇霉素顆粒（Ⅱ）微生物限度的檢查。

表7 3 批樣品微生物限度檢查結(jié)果

3 討論

在臨床用藥中由于微生物污染引起的藥源性不良反應(yīng)和疾病時有發(fā)生，主要通過產(chǎn)生有毒的代謝產(chǎn)物和分解藥物的有效成分，從而使藥效降低和影響患者健康，因此藥品的微生物限度檢查在控制藥物質(zhì)量和保證用藥安全中起著至關(guān)重要的作用。

阿奇霉素屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物，通過阻礙細(xì)菌轉(zhuǎn)肽過程抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的形成。體外實驗證明阿奇霉素對臨床上多種常見致病菌有效，主要用于革蘭陽性菌等引起的感染，屬于速效抑菌劑。本實驗通過預(yù)實驗也表明阿奇霉素對細(xì)菌有較強(qiáng)的抑菌性，因此選擇薄膜過濾法進(jìn)行了細(xì)菌限度檢查方法研究［9-10］。阿奇霉素對霉菌和酵母菌沒有抑制作用，霉菌及酵母菌計數(shù)檢查采用平皿法驗證［11］?？刂凭ù竽c埃希菌）在常規(guī)法中，由于阿奇霉素的抑菌性，實驗組未檢出大腸埃希菌，MUG-靛基質(zhì)試驗顯陰性。因此，采用薄膜過濾法，進(jìn)行控制菌檢查。通過本實驗的研究，建立了阿奇霉素顆粒（Ⅱ）微生物限度檢查方法并進(jìn)行驗證，回收率符合藥典規(guī)定，表明建立的方法是可靠的。該方法能進(jìn)一步有效地保證藥品的安全性，并且對建立其他大環(huán)內(nèi)酯類抗生素微生物限度檢查法具有一定的幫助。