UPLC-MS/MS 法測定龍膽瀉肝片中澤瀉的含量

唐濟舟，黃炳泉，周云峰，鄧杰華

1.贛州市食品藥品檢驗檢測中心，江西 贛州 341000；2.宜春市食品藥品檢驗所，江西 宜春 336000

龍膽瀉肝片是由龍膽、黃芩、木通、當(dāng)歸（酒炒）、柴胡、車前子（鹽炒）、梔子（炒）、澤瀉、甘草（蜜炙）和地黃10 種藥味組成的復(fù)方制劑，收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》第十二冊，具有清肝膽、利濕熱等功效［1］。龍膽瀉肝片的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含有性狀、鑒別和檢查項，而無含量測定項，這可能不利于藥品整體質(zhì)量的控制，有必要探索補充含量測定方法。目前，科研工作者主要對龍膽瀉肝片中龍膽、黃芩、木通、地黃和梔子的含量進行了研究［2-4］，而對澤瀉的定量控制幾無報道。方中澤瀉為佐藥，具利小便、清濕熱之能［5］，也有利膽保肝之效［6-7］。澤瀉醇類是澤瀉的主要有效成分，以23-乙酰澤瀉醇B 最具代表性［8］。澤瀉的野生資源日益枯竭，市場上流通的澤瀉主要為人工栽培品，但由于種植地不一，地域和氣候有差異，加之有較為廉價的窄葉澤瀉摻偽混淆，導(dǎo)致澤瀉質(zhì)量參差不齊［9］。澤瀉作為龍膽瀉肝片的原料藥之一，其定量指標(biāo)的缺失，可能無法保證制劑的質(zhì)量。因此，本研究以23-乙酰澤瀉醇B 為定量成分，采用UPLC-MS/MS 法進行測定，以制定龍膽瀉肝片中澤瀉含量測定的方法。

1 儀器與試劑

超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPLC-MS/MS，型號：H-class/xevo TQD，美國Waters 公司）；超聲波清洗儀（型號：KH-250DB，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

23-乙酰澤瀉醇B 對照品（批號：111846-201705，純度：99.7%，中國食品藥品檢定研究院）；龍膽瀉肝片（市售8 批，來源于7 個廠家，信息見表1）；乙腈（質(zhì)譜級，德國默克股份兩合公司）；甲酸（質(zhì)譜級，美國賽默飛世爾科技有限公司）；甲醇（色譜純，德國西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司）；水為屈臣氏蒸餾水。

表1 8 批樣品信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 儀器測定條件

液相流動相：A-乙腈，B-0.1%甲酸溶液，流速：0.3 mL/min。梯度洗脫程序：0 min～1 min，70%B～70%B；1 min～3 min，70%B～20%B；3 min～7.5 min，20%B；7.5 min～8 min，20%B～70%B。色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；柱 溫：30 ℃；進樣量：5 μL。質(zhì)譜參數(shù)：脫溶劑氣流量1 000 L/h，錐孔氣流量50 L/h，脫溶劑氣溫度600 ℃，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式，正離子掃描模式，檢測離子對m/z 497 →437（定量）和m/z 497 →419。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取23-乙酰澤瀉醇B 對照品10.65 mg，加甲醇制成含每1 mL 含23-乙酰澤瀉醇B 1 061.805 ng 的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 樣品經(jīng)混勻（批號：19120005），取適量，研細，取2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 取不含澤瀉的龍膽瀉肝片，混勻，取適量，研細，取2 g，按“2.2.2”項下供試品溶液的處理方法制備陰性樣品溶液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取對照品溶液適量，加甲醇制成含23-乙酰澤瀉醇B 2.132 6 ng/mL、5.309 0 ng/mL、10.618 0 ng/mL、21.632 1 ng/mL、53.090 2 ng/mL、106.180 5 ng/mL 和212.361 0 ng/mL 一系列濃度的對照品溶液，吸取上述對照品溶液各5 μL 依次測定，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對照品濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程為Y=48.608X-62.821，r=0.997 7，濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4 專屬性

分別吸取陰性樣品溶液、供試品溶液（批號：19120005）和對照品溶液各5 μL，依次注入儀器測定，采集MRM 圖（圖1）。結(jié)果顯示，供試品色譜圖中出現(xiàn)與對照品色譜峰保留時間相對應(yīng)的色譜峰，而陰性樣品色譜圖中未出現(xiàn)與對照品色譜峰保留時間相對應(yīng)的色譜峰，陰性樣品對測定無干擾，專屬性良好。

圖1 多反應(yīng)監(jiān)測圖：A.陰性樣品；B.樣品；C.23-乙酰澤瀉醇B

2.5 精密度

精密吸取對照品溶液，重復(fù)進樣6 次，記錄峰面積，23-乙酰澤瀉醇B 峰面積的RSD 為1.87%，儀器精密性良好。

2.6 穩(wěn)定性

取同一樣品溶液（批號：19120005），在放置0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、24 h 后，依次測定峰面積。測得含量的RSD 為2.68%，供試品溶液在24 h 內(nèi)較穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性

取6 份樣品（批號：19120005），每份約2 g，按“2.2.2”項下方法平行制備供試品溶液，依法測定。含量的RSD 為2.9%，符合重復(fù)性要求。

2.8 加樣回收率

樣品（批號：19120005，含量為2.189 2 μg/g）經(jīng)混勻，取適量，研細，平行稱取6 份，每份1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，再精密加入23-乙酰澤瀉醇B 對照品溶液（424.722 ng/mL）5 mL，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，依次測定。回收率結(jié)果見表2，回收率符合分析方法驗證指導(dǎo)原則［10］要求，該方法回收率良好。

表2 加標(biāo)回收率

2.9 樣品結(jié)果

取8 批供試品溶液，按“2.1”項下條件測定，計算含量，結(jié)果見表3，8 批供試品23-乙酰澤瀉醇B 含量范圍為0.105 3 μg/g～2.189 2 μg/g。

表3 樣品含量結(jié)果（n=2）

3 討論

查閱文獻，有科研工作者已采用高效液相色譜法測定了龍膽瀉肝丸中23-乙酰澤瀉醇B 的含量［11-12］，為此，本研究前期采用HPLC 法測定龍膽瀉肝片中澤瀉的含量，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)樣品中未檢測到與23-乙酰澤瀉醇B 對照品色譜峰保留時間相對應(yīng)的色譜峰，含量有可能為零。為驗證結(jié)果的準(zhǔn)確性，改用了靈敏度更高、分析速度更快的UPLC-MS/MS法進行分析，結(jié)果表明樣品均含有23-乙酰澤瀉醇B 成分。結(jié)果的差異性是因為龍膽瀉肝丸中原料均以原粉入藥，有效成分損失較少，轉(zhuǎn)移率較高，而龍膽瀉肝片中澤瀉需要經(jīng)過水提和再醇沉過程，且23-乙酰澤瀉醇B 屬于萜類成分，水溶性差。有文獻報道［13］澤瀉制成湯劑后23-乙酰澤瀉醇B 的最低轉(zhuǎn)移率只有2.4%，導(dǎo)致龍膽瀉肝片中23-乙酰澤瀉醇B 的含量偏低。

在質(zhì)譜條件考察方面，采用較為穩(wěn)定的MRM模式，同時比較了正離子模式和負離子模式下的響應(yīng)情況，發(fā)現(xiàn)正離子模式響應(yīng)較高。隨后，對檢測離子對進行優(yōu)化，初步采用母離子為m/z 515［M+H］+、子 離 子 為m/z 497［M+H-H2O］+和 子 離 子m/z 437［M+H-H2O-CH3COOH］+的 離子對進行檢測，發(fā)現(xiàn)檢測響應(yīng)并不理想，而改用m/z 497［M+H-H2O］+為母離子，m/z 437［M+HH2O-CH3COOH］+和m/z419［M+H-H2O-CH3COOHH2O］+為子離子進行分析時，其檢測響應(yīng)大了一個數(shù)量級，同時考慮到邰艷妮等［14］測定澤瀉藥材中23-乙酰澤瀉醇B 的含量采用的最佳靈敏度母離子為m/z 497［M+H-H2O］+，最終選擇m/z 497 →437（定量）和m/z 497 →419 作為測定離子對。

23-乙酰澤瀉醇B 可溶于甲醇，在樣品處理方法考察時，采用甲醇作為提取溶劑，同時研究超聲10 min、30 min、40 min 和加熱回流0.5 h、1 h、2 h 兩種提取方式對23-乙酰澤瀉醇B 含量測定的影響，發(fā)現(xiàn)在超聲30 min 或加熱回流1 h 后，樣品中23-乙酰澤瀉醇B 已提取完全，考慮方法的便捷性，采用甲醇超聲30 min 作為樣品處理方法。

從含量結(jié)果可以看出，不同廠家的龍膽瀉肝片中23-乙酰澤瀉醇B 的含量具有一定差異性，最高相差十幾倍，質(zhì)量參差不齊。目前龍膽瀉肝片所執(zhí)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)沒有對澤瀉的質(zhì)量進行控制，無定性定量指標(biāo)，可能會存在少投料、摻偽品或提取后藥渣繼續(xù)使用的風(fēng)險，有必要規(guī)范澤瀉的來源性并對處方中澤瀉的23-乙酰澤瀉醇B 含量設(shè)定下限值，此項工作有待進一步研究。

綜上所述，本研究所建立的UPLC-MS/MS 法能有效測定處方中23-乙酰澤瀉醇B 的含量，可用于澤瀉定量指標(biāo)的考察，對于提升澤瀉質(zhì)量和保證藥品有效性具有積極意義。