排石顆粒高效液相色譜法指紋圖譜研究及薄層色譜鑒別

李柯城，袁銘銘，熊曉麗，周?chē)?guó)平

1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004；2.江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029

排石顆粒由連錢(qián)草、石韋、木通、鹽車(chē)前子、徐長(zhǎng)卿、忍冬藤等十味藥組成。具有排石通淋、清熱的作用，臨床主要作用于腎結(jié)石和尿路結(jié)石，療效良好［1-3］。排石顆粒收載于《中國(guó)藥典》（2020年版一部），但質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)較低，不能全面控制排石顆粒的質(zhì)量。且排石顆粒指紋圖譜相關(guān)的報(bào)道較少，色譜峰指認(rèn)及歸屬不全，鑒別方法單一［4-8］。因此本研究收集了15 個(gè)不同批次的排石顆粒，建立了高效液相色譜法（HPLC）指紋圖譜，確立了25 個(gè)共有峰，指認(rèn)了咖啡酸、綠原酸、4,5-二咖啡酰基奎寧酸酯、1,2-二咖啡酸-環(huán)戊基-3-醇、迷迭香酸5 個(gè)化學(xué)成分，歸屬了12 個(gè)未知峰。同時(shí)建立了排石顆粒中木通成分akemisaponin E、皂苷 PJ1 的薄層色譜（TLC）鑒別［9-10］。為排石顆粒質(zhì)量評(píng)價(jià)方面提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Thermo Scientific Ultimate3000 系列高效液相色譜儀，Chromeleon 7 工作站，DAD 檢測(cè)器；Milli-Q Advantage A10 純水儀；KQ-500DE 超聲儀；MS205DU電子天平（十萬(wàn)分之一）；ME204TE 電子天平（萬(wàn)分之一）；DHG-P076A 干燥箱；HPTLC Silica gel 60 薄層板。

1.2 試藥

對(duì)照品綠原酸（批號(hào)110753-202018），對(duì)照品咖啡酸（批號(hào)110885-201703），對(duì)照品迷迭香酸（批號(hào)111871-201404），購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。對(duì)照品1,2-二咖啡酸-環(huán)戊基-3-醇、4,5-二咖啡?；鼘幩狨ァkemisaponin E、皂苷PJ1 均由本課題組自制，經(jīng)MS、1H-NMR 和13C-NMR 鑒定，HPLC 法檢測(cè)面積歸一化法計(jì)算純度均在98.0%以上。乙腈、甲醇為色譜純（美國(guó)Sigma 公司），水為Milli-Q 超純水，其余試劑為分析純。

15 批排石顆粒均來(lái)自江西南昌濟(jì)生制藥有限責(zé)任公司［S1～S15，批號(hào)200501（無(wú)糖型）、200114-2、191209-3、190705-2、190708-2、190706-2、190706-1、200114-2、191121-2、191111（無(wú)糖型）、210217-1、210202-1、210202-2、200715-2、200604-2］。10 味藥材樣品連錢(qián)草、木通、石韋、滑石、苘麻子、鹽車(chē)錢(qián)子、徐長(zhǎng)卿、忍冬藤、瞿麥、甘草，經(jīng)江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院周?chē)?guó)平主任中藥師鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液

取排石顆粒樣品5 g（無(wú)糖型1 g）精密稱(chēng)定，置100 mL 具塞錐形瓶中，加入50%甲醇50 mL。稱(chēng)定重量，超聲（頻率60 kHz，溫度25 ℃）30 min，取出放冷，50%甲醇補(bǔ)重，搖勻，過(guò)濾，濾液過(guò)0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.2 混合對(duì)照品溶液

稱(chēng)取咖啡酸對(duì)照品，綠原酸對(duì)照品，迷迭香酸對(duì)照品，4,5-二咖啡?；鼘幩狨?，1,2-二咖啡酸-環(huán)戊基-3-醇對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加適量50%甲醇稀釋成濃度分別為0.118、0.131、0.117、0.220、0.124 mg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.3 陰性樣品溶液

按《中國(guó)藥典》（2020年版一部）排石顆粒處方稱(chēng)取藥材，按制法制備10 份空白溶液（分別缺連錢(qián)草、缺木通、缺石韋、缺滑石、缺苘麻子、缺鹽車(chē)錢(qián)子、缺徐長(zhǎng)卿、缺忍冬藤、缺瞿麥、缺甘草），再按“2.1”項(xiàng)下制備陰性樣品溶液。

2.4 色譜條件

Thermo Scientific C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，以甲醇∶乙腈（1∶1，v/v）（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫，見(jiàn)表1。體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)284 nm。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫表

2.5 排石顆粒指紋圖譜方法學(xué)

2.5.1 精密度試驗(yàn) 取排石顆粒樣品（S1）約1 g，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品，按“2.4”項(xiàng)下記錄HPLC 圖譜，連續(xù)6 次測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積的RSD 均小于2%。表明儀器的精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)定排石顆粒樣品（S1）6 份，每份約1 g，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品，按“2.4”項(xiàng)下記錄HPLC 圖譜，測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積的RSD 均小于2%。表明儀器的重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取排石顆粒樣品（S1）約1 g，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品，置室溫下放置0、2、4、8、12、24 h 后按“2.4”項(xiàng)下記錄HPLC 圖譜，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積的RSD 均小于2%，表明排石顆粒供試品在室溫下24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 排石顆粒指紋圖譜的建立

2.6.1 參照峰的選擇 觀察HPLC 圖譜，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于其他色譜法而言，25 號(hào)色譜峰（迷迭香酸）的峰形較好、峰面積較大，且出峰時(shí)間較穩(wěn)定穩(wěn)定，故作為參照峰。2.6.2 對(duì)照指紋圖譜和共有指紋峰的標(biāo)定 取各批次排石顆粒樣品，按“2.1”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件記錄圖譜，將HPLC 圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A 版）進(jìn)行峰匹配，采用多點(diǎn)校正法并生成對(duì)照?qǐng)D譜，共標(biāo)示出25 個(gè)共有峰，建立了15 批排石顆粒的疊加指紋圖譜，見(jiàn)圖1。生成排石顆粒的共有指紋圖譜，見(jiàn)圖2。

圖1 15 批排石顆粒的HPLC指紋圖譜

圖2 排石顆粒HPLC指紋圖譜共有指紋圖譜

2.7 相似度計(jì)算

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004版）軟件計(jì)算指紋圖譜相似度，結(jié)果顯示15 批排石顆粒相似度均大于0.952，見(jiàn)表2。說(shuō)明不同批次間排石顆粒整體類(lèi)似，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。

表2 15 批排石顆粒相似度結(jié)果

2.8 主要色譜峰的指認(rèn)及歸屬

取陰性樣品溶液，按“2.4”色譜條件記錄圖譜，根據(jù)對(duì)照品的保留時(shí)間、DAD 光譜圖，以及混合對(duì)照品溶液、對(duì)照品溶液、供試品溶液、各陰性樣品溶液的HPLC 圖譜進(jìn)行分析比較，指認(rèn)出5 個(gè)主要色譜峰，如圖3所示。對(duì)部分色譜峰進(jìn)行指認(rèn)及歸屬，見(jiàn)表3 所示。

圖3 混合對(duì)照品HPLC色譜圖

表3 色譜峰歸屬結(jié)果

2.9 排石顆粒的TLC 鑒別

2.9.1 供試品的制備 稱(chēng)取排石顆粒樣品20 g（無(wú)糖型5 g）置圓底燒瓶?jī)?nèi)，加水飽和正丁醇200 mL，加熱回流1 h，室溫下放冷，濾過(guò)，濾液加氨試液洗滌3 次（每次100 mL），棄去氨試液層，加正丁醇飽和的水液洗滌2 次（每次20 mL），棄去水層，正丁醇層蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 溶解，得供試品溶液。

2.9.2 對(duì)照品的制備 稱(chēng)取對(duì)照品Akemisaponin E、皂苷PJ1 適量，加甲醇制成濃度分別為2 mg/mL，1 mg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.9.3 陰性對(duì)照的制備 照《中國(guó)藥典》（2020年版一部）排石顆粒制法制備陰性對(duì)照（缺木通），稱(chēng)取5 g 陰性對(duì)照干品置圓底燒瓶?jī)?nèi)，與供試品溶液同法操作，得陰性對(duì)照溶液。

2.9.4 TLC 測(cè)定方法 照《中國(guó)藥典》（2020年版四部附錄）薄層色譜法［11］試驗(yàn)，吸取供試品溶液、陰性對(duì)照溶液以及混合對(duì)照品溶液各10 μL，點(diǎn)于同一塊HPTLC Silica gel 60薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（15∶9∶1）為展開(kāi)系統(tǒng)，展開(kāi)，取出，晾干，立即噴以10%硫酸乙醇顯色劑，置105 ℃加熱至斑點(diǎn)清晰，日光檢視。結(jié)果顯示供試品與混合對(duì)照品在相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，而陰性樣品無(wú)干擾，結(jié)果如圖4 所示。

圖4 排石顆粒木通陰性薄層色譜圖

2.10 TLC 耐用性考察

薄層板的比較：考察了德國(guó)制HPTLC Silica gel 60硅膠G 板與青島海洋化工制硅膠G 板的分離效果，結(jié)果表明兩種不同品牌的薄層板對(duì)斑點(diǎn)的分離效果無(wú)明顯差異。濕度的比較：控制溫度為26 ℃，考察低濕（RH=20%）、常濕（RH=55%）、高濕（RH=75%）下的分離情況。結(jié)果表明，三種濕度條件下斑點(diǎn)的分離效果無(wú)明顯差異。溫度的比較：控制濕度為RH=55%，考察常溫（T=26 ℃）和低溫（T=8 ℃）下的分離情況。結(jié)果表明，常溫和低溫條件下分離效果無(wú)明顯差異。

3 討論

3.1 指紋圖譜提取方式的考察

本實(shí)驗(yàn)考察了超聲提?。l率60 kHz，溫度25 ℃）和回流提取兩種方式，結(jié)果顯示超聲提取更完全；同時(shí)考察了無(wú)水乙醇、30%乙醇、50%乙醇，70%乙醇、甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇提取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用50%甲醇提取時(shí)，色譜峰較高，峰數(shù)量較多；提取時(shí)間考察了15 min，30 min和45 min，結(jié)果表明30 min 和45 min 提取效果接近，所以最終選擇超聲提取30 min。

3.2 HPLC 色譜條件的考察

本實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相組成考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇∶乙腈（1∶1）-0.1%磷酸水，結(jié)果顯示以甲醇∶乙腈（1∶1）-0.1%磷酸水為流動(dòng)相時(shí)基線平穩(wěn)，峰型較好；柱溫考察了20 ℃、30 ℃和40 ℃，結(jié)果表明在30 ℃時(shí)，排石顆粒供試品色譜圖各峰分離效果最佳；色譜柱考察 了SHIMADZU C18、OSAKA SODA C18 和Thermo Scientific C18 三個(gè)不同品牌的色譜柱進(jìn)行分析。結(jié)果表明Thermo Scientific 色譜柱的分離效果較好。

3.3 TLC 條件考察

展開(kāi)劑考察了三氯甲烷-甲醇-甲酸（15∶10∶1）、三氯甲烷-甲醇-甲酸（12∶9∶1）、三氯甲烷-甲醇-甲 酸（15∶9∶1）、正 丁 醇-甲 醇-甲 酸（20∶10∶1）、正丁醇-甲醇-水（15∶9∶1）系統(tǒng)，結(jié)果顯示以三氯甲烷-甲醇-甲酸（15∶9∶1）為展開(kāi)劑效果最佳，展開(kāi)時(shí)間短，分離效果好；顯色劑考察了10%硫酸乙醇試液、5%硫酸香草醛試液，結(jié)果顯示10%硫酸乙醇試液顯色效果較好。

4 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)建立了排石顆粒HPLC 指紋圖譜，并對(duì)江西南昌濟(jì)生制藥有限公司的15 批排石顆粒進(jìn)行定性分析，結(jié)果表明15 批排石顆粒未見(jiàn)明顯差異。建立了排石顆粒中akemisaponin E、皂苷PJ1的TLC 鑒別，結(jié)果表明斑點(diǎn)清晰。本方法可用于定性評(píng)價(jià)排石顆粒的質(zhì)量，對(duì)進(jìn)一步完善排石顆粒質(zhì)量評(píng)價(jià)方法提供參考依據(jù)。