貫葉連翹不定根不同溶劑提取物的抗氧化活性研究

劉懿萱， 徐亞男， 孫浩丁， 廉美蘭， 樸炫春

(延邊大學 農學院，吉林 延吉 133002)

貫葉連翹(Hypericumperforatum)，又名小汗淋草、過路黃，西方稱為圣約翰草，是藤黃科金絲桃屬的一種多年生草本植物，多產于我國新疆、山東、江蘇、江西等地，成熟全草可用藥，且具有悠長的藥用歷史[1-3]?，F代醫(yī)學研究表明，貫葉連翹具有很多藥理作用，如抗腫瘤、抗病毒、防衰老、抗抑郁、護肝等作用，已成為全球研究開發(fā)的熱點藥材之一[4-7]。因貫葉連翹的廣泛應用前景，近些年它的需求量急劇增加，導致其野生資源破壞，栽培產量和質量滿足不了市場需求。因此，國內外的研究學者不斷地尋找保護開發(fā)資源的方法，其中,利用植物組織培養(yǎng)方法短期內大量生產植物材料是緩解貫葉連翹資源問題的有效途徑。研究表明，植物不定根培養(yǎng)與植物細胞或其它器官培養(yǎng)相比優(yōu)勢明顯[8-9]，且擁有原始植物根本身所具有的強大生物合成能力，同時可以表現出相對穩(wěn)定的代謝活力[10]。

現代科學研究指出，過量自由基的產生往往與許多的慢性病和衰老緊密相關[11]?？寡趸梢杂行p輕其所帶來的危害程度，所以抗氧化相關產品的開發(fā)已成為醫(yī)療行業(yè)和化妝品企業(yè)主要研發(fā)方向之一[12]。天然植物抗氧化劑具有良好的抗氧化效果，且具有毒副作用小，安全性高，活性成分含量高等優(yōu)點[13-14]。目前，已發(fā)現，植物器官培養(yǎng)物同樣具有很好的抗氧化活性。如，李慧娟等[15]發(fā)現，刺參不定根有明顯高于栽培植株的DPPH自由基清除能力；呂世鑫等[16]發(fā)現，西洋參不定根提取物具有強大的抗氧化活性。另外，研究發(fā)現不同溶劑提取不定根提取物的抗氧化活性有很大差異，如高原等[17]發(fā)現，軟棗獼猴桃不定根乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、乙醇和水提取物中，乙酸乙酯提取物有最好的抗氧化效果；張聲源等[18]發(fā)現，虎舌紅乙酸乙酯提取物的還原能力和清除自由基的能力強于石油醚、正丁醇及水提取物?？寡趸钚缘脑u價方法有多種，如DPPH自由基清除活性測定、ABTS自由基清除活性測定以及鐵離子螯合能力測定，但針對不同評價方法確定抗氧化能力時，需要一種方法對抗氧化綜合能力進行整體評價。層次分析法是美國運籌學家匹茨堡大學教授薩蒂提出的一種層次權重決策分析方法，該方法是將定量分析與定性分析相結合，使不同指標的權重系數確定在一定范圍內，避免了主觀因素對賦予權重系數的影響，利用權數求出各方案的優(yōu)劣次序，具有強大的科學客觀性，可以有效解決難以定量分析的問題。層次分析法通常被廣泛應用于安全科學研究，且近年來，層次分析法也逐步應用于中藥提取工藝的綜合評價[19-20]。但在生物活性評價方面應用很少，因此，該試驗用正丁醇、甲醇、乙醇和水對貫葉連翹不定根進行提取，對4種不同溶劑提取物的DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和鐵離子螯合能力進行測定，進而利用層次分析法對抗氧化能力進行綜合評價，為貫葉連翹不定根提取物作為天然抗氧化劑的深入研究以及相關抗氧化產品的開發(fā)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

貫葉連翹不定根按照于曉坤[21]的方法進行增殖培養(yǎng)。取20 g增殖后生長狀態(tài)良好的貫葉連翹不定根(鮮重)，切碎成1 cm大小后接種到裝有4 L培養(yǎng)液(Murashige and Skoog Medium + 吲哚丁酸1.2 mg/L+蔗糖40 g/L)的5 L生物反應器中培養(yǎng)，調節(jié)pH值至5.8，暗培養(yǎng)，通氣量為0.1 vvm，控制溫度在(25±2) ℃，培養(yǎng)30 d后，取出培養(yǎng)好的貫葉連翹不定根用水沖洗3～4次，瀝干表面水分，放入45 ℃烘干箱中，烘干的植物干品用作試驗材料。

1.2 試劑與儀器設備

Murashige and Skoog Medium(MS，索萊寶公司，中國)，吲哚丁酸(IBA，上海源葉生物科技有限公司，中國)，過硫酸鉀(K2S2O8，科密歐公司，中國)，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，Sigma公司，美國)，抗壞血酸(Vc，索萊寶公司，中國)，2’-聯氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS，索萊寶公司，中國)，氯化亞鐵(FeCl2·2H2O，索萊寶公司，中國)。

YHW1103遠紅外快速干燥箱(長沙聯申恒溫有限公司)；JY2003電子天平(西安研碩儀器設備有限公司)；UV1102紫外可見分光光度計(北京格瑞恩科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 貫葉連翹不定根提取物的制備

取干燥的貫葉連翹不定根2 g，置于150 mL三角燒瓶內，利用正丁醇、甲醇、乙醇和水4種不同溶劑按液料比30∶1在溫度60 ℃和60 kHz為頻率的超聲波中進行提取[17]，經過1 h后過濾，重復上述提取操作4次，合并濾液，將濾液置于旋轉蒸發(fā)儀內真空濃縮，將濃縮后的膏狀物置于烘干箱中45 ℃下干燥至恒重，收集烘干后的不同溶劑提取物，置于-20 ℃冰箱中保存，對待測定提取物中總黃酮含量以及抗氧化活性進行評估。

1.3.2 貫葉連翹不定根不同溶劑提取物中總黃酮含量的測定

采用李偉等[22]方法測定總黃酮含量。準確稱取10 mg蘆丁標準品至燒杯內，用70%的乙醇溶液充分溶解并定容至250 mL，分別吸取蘆丁標準液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中，用70%的乙醇溶液定容至2 mL，以70%乙醇為空白對照，每間隔6 min分別加入0.3 mL的NaNO2(5%)溶液、0.3 mL的Al(NO3)3(10%)溶液和2 mL的NaOH(4%)溶液，搖勻并在510 nm下測量OD值，繪制標準曲線。

分別準確稱取0.1 g不同溶劑提取物于離心管中，加70%的乙醇溶液沒過材料，置于60 ℃水浴鍋加熱3 h后進行過濾，過濾后的溶液用70%乙醇溶液將其定容至25 mL，每個樣品液取0.05 mL于試管中，用70%的乙醇定容至2 mL后，按標準曲線步驟操作，測定吸光值，并計算總黃酮的含量。

總黃酮含量/(mg·g-1)=CVD/W,

式中,C為樣品溶液濃度/(mg·g-1)；V為樣品溶液總體積/mL；D為樣品稀釋倍數；W為樣品的質量/g。

1.3.3 貫葉連翹不定根不同溶劑提取物抗氧化活性的測定

1) DPPH自由基清除活性的測定

參照李釗等[23]的方法進行DPPH自由基清除試驗，并稍作改進。分別精密稱取4種不同溶劑提取物40 mg定容至20 mL，樣品濃度2.0 mg/mL，將上述溶液依次稀釋至濃度為0.0125、0.025、0.05、0.10、0.20、0.40 mg/mL的待測樣品溶液，Vc作為陽性對照。稱取0.003 9 g的DPPH，用甲醇溶液定容至100 mL，即DPPH溶液濃度為0.1 mM。向試管中加入2 mL的待測樣品溶液，再加入2 mL的DPPH溶液，設為待測樣品組?？瞻讓φ战M用2 mL甲醇代替待測樣品。避光靜置30 min，用紫外分光光度計在517 nm下測定吸光值OD，按照下述公示計算出DPPH自由基清除率。

式中，OD樣為待測樣品組吸光值，OD空為空白對照組吸光值。

2) ABTS自由基清除活性的測定

參照吳冕等[24]的方法進行ABTS自由基清除試驗，對4種不同溶劑提取物清除ABTS自由基的能力進行測定。用去離子水配置2.45 mmol/L的過硫酸鉀和7 mmol/L的ABTS混合溶液，并經過一定的配置成儲備液。試驗前需用去離子水將ABTS儲備液的吸光值稀釋至在734 nm下為0.70±0.02。稱量選取50 mg 4種不同溶劑提取物，溶于5 mL的去離子水中，溶液濃度為10 mg/mL。將以上溶液分別稀釋至濃度為0.25、0.5、1.0、2.0和4.0 mg/mL的待測樣品溶液。待測樣品組取待測樣品溶液(0.1 mL)和ABTS溶液(3.9 mL)于試管中。待測樣品對照組取待測樣品溶液(0.1 mL)和去離子水(3.9 mL)于試管中?？瞻讓φ战M向試管中加入甲醇溶液(0.1 mL)和ABTS溶液(3.9 mL)，Vc作為陽性對照。搖勻后靜置6 min，用紫外分光光度計測得吸光值(734 nm)，按照下述公示計算出ABTS自由基清除率。

式中，A樣為待測樣品組吸光值，A對為待測樣品對照組吸光值，A空為空白對照組吸光值。

3) 鐵離子螯合能力的測定

參照Fu等[25]的方法并稍作改進，對4種不同溶劑提取物的鐵離子螯合能力進行測定。稱取4種不同溶劑提取物100 mg溶于5 mL的蒸餾水中，溶液濃度為20 mg/mL。將上述溶液依次稀釋至濃度為0.625、1.25、2.5、5.0、10.0和20.0 mg/mL的待測樣品溶液，檸檬酸作為陽性對照。按照表1準確吸取待測樣品溶液、蒸餾水、FeCl2溶液、菲洛嗪溶液于96孔板中，于室溫中靜置10 min。用酶標儀在562 nm處測吸光值，并計算出鐵離子螯合能力。

表1 反應液的組成

式中，A樣為待測樣品組吸光值，A對為待測樣品對照組吸光值，A空為空白對照組吸光值。

1.3.4 抗氧化能力綜合評價模型構建

根據Jensen[26]方法進行層次分析法。圖1為層次分析法結構模型，由目標層和標準層構成，其中,目標層為抗氧化能力，標準層分別為DPPH自由基清除能力(f1)、ABTS自由基清除能力(f2)和鐵離子螯合能力(f3)。

表2為各指標成分的評分標準[27]，對不同抗氧化能力進行兩兩比較后主觀評價出相對重要性。

表2 各指標評分標注

根據公式(1)建立不同抗氧化能力成對比較的優(yōu)先判斷矩陣(N)并進行一致性檢驗，并利用公式(2)計算出初始權重(Wi'),利用公式(3)計算出歸一化權重(Wi)。

(1)

(2)

(3)

根據公式(4)計算出判斷矩陣的最大特征值(λmax)與，根據公式(5)計算出一致性指數(CI)，利用公式(6)計算出CI的成對矩陣的一致性比率CR，并利用隨機一致性指數RI(表3)評估矩陣合理性。最后利用公式(7)和3種抗氧化評價中的半數有效濃度(EC50)計算出綜合評分S[28]。根據S值綜合評價抗氧化活性。

表3 隨機一致性指數

(4)

(5)

(6)

(7)

1.3.5 數據分析

利用SPSS 22.0(Statistical Product and Service Solutions 22.0)中的方差分析程序分析試驗數據，用鄧肯氏新復極差法作對比，顯著水平為P<0.05，每個處理均進行3次重復試驗。

2 結果與分析

2.1 貫葉連翹不定根不同溶劑提取物中總黃酮含量

貫葉連翹不定根4種不同溶劑提取物中總黃酮含量差異顯著。甲醇提取物中的總黃酮含量最高，達到296.31 mg/g，乙醇和正丁醇提取物中的總黃酮含量無顯著差異，當提取溶劑為水時，貫葉連翹不定根的總黃酮含量僅有45.73 mg/g(圖2)。

2.2 貫葉連翹不定根不同提取溶劑的抗氧化活性

2.2.1 清除DPPH自由基能力

由圖3可知，4種不同溶劑提取物對DPPH自由基都有顯著的清除能力。其中，甲醇提取物表現出最高的清除能力，當濃度為0.40 mg/mL時，清除率最高達到了93.36%。乙醇提取物和正丁醇提取物清除能力較甲醇提取物稍低，在濃度為0.40 mg/mL時，清除率為92.38%和86.77%，而水提物最弱。

2.2.2 清除ABTS自由基能力

由圖4可知，ABTS清除率隨提取物濃度(0～1.0 mg/mL)的增加而上升。乙醇提取物有最強的ABTS自由基清除能力，當濃度為4.0 mg/mL時，清除率達到99.12%，但比陽性對照Vc的清除能力(100%)稍低。甲醇提取物對ABTS自由基清除能力稍弱于乙醇提取物，當濃度為4.0 mg/mL時，清除率為96.52%，水提取物仍為最弱。

2.2.3 不同溶劑提取物的鐵離子螯合能力

由圖5可知，4種不同溶劑提取物均是良好的鐵離子螯合劑。鐵離子螯合能力與提取物濃度呈正相關。其中，正丁醇提取物增強最為顯著，當濃度達到20.0 mg/mL時，鐵離子螯合能力達到73.29%，顯著高于陽性對照檸檬酸(65.85%)，其中甲醇提取物鐵離子螯合能力最弱，在濃度為20.0 mg/mL時，僅有63.43%。

2.2.4 貫葉連翹不定根不同溶劑提取物抗氧化能力比較

由表4的EC50值可以看出，不定根的不同溶劑提取物皆有一定的抗氧化活性，乙醇和甲醇提取物清除DPPH自由基和ABTS自由基均表現出較強的清除能力，而正丁醇提取物則具有較好的鐵離子螯合能力，而水提取物在3組試驗中均表現出較弱的抗氧化能力。

表4 不同溶劑提取物抗氧化能力比較

2.3 抗氧化綜合能力評價

利用層次分析法計算DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和鐵離子螯合能力的成對比較矩陣各指標權重和綜合能力，結果見表5，標準層權重系數為Wi=[0.443 0.387 0.169]，一致性指標CI = 0.009，隨機一致性比率CR=0.016<0.1，表明各因素的權重符合條件，所有矩陣一致性合理。

表5 層次分析結構模型中成對比較矩陣及各抗氧化能力權重

由于貫葉連翹不定根水溶劑提取物的抗氧化能力較低，所以根據表5的權重只計算貫葉連翹不定根的正丁醇提取物、甲醇提取物、乙醇提取物的抗氧化能力綜合評分(最低評分的提取物抗氧化綜合能力最強)(圖6)。正丁醇提取物的抗氧化綜合評分為1.469，甲醇提取物綜合評分為1.360，乙醇提取物綜合評分為0.975，因此，乙醇提取物的抗氧化綜合能力最強。

3 討論與結論

天然綠色抗氧化劑可絡合促氧化的金屬離子，有效抑制自由基的產生，促進抗氧化酶和抗氧化因子的產生，如Gao等[29]研究發(fā)現，綠茶不僅有較強的自由基清除能力，而且也有很好的絡合鐵離子的能力；吳亞楠等[30]發(fā)現，玉米須的DPPH自由基清除能力很強，起到很好的抗氧化作用，可進一步應用在醫(yī)藥及化妝品等行業(yè)中。就貫葉連翹而言，葛莉等[31]研究了不同收獲期貫葉連翹花中抗氧化能力，發(fā)現在處于花蕾期至盛花期時花器官抗氧化能力較強。貫葉連翹不定根培養(yǎng)已有一些研究報道，但對培養(yǎng)的不定根是否具有抗氧化能力至今尚未報道。該研究發(fā)現，生物反應器培養(yǎng)的貫葉連翹不定根4種不同溶劑提取物的抗氧化能力均隨著提取物濃度的升高而增強，最高的DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和鐵離子螯合能力分別出現在甲醇、乙醇和正丁醇提取物中。可見，用不同評價方法測定的最高抗氧化能力會因提取溶劑而不同[32]。面對這種不同抗氧化評價指標所出現的不同結果，如何進行綜合評估就成為提取工藝及進一步的產品生產所面臨的問題。而將層次分析的多指標評價系統(tǒng)應用在不同評價指標或無結構特性的復雜問題中是一種清晰明了的方法，并且在每個層次中的每個因素對結果的影響程度都是量化的，既考慮了研究人員對每項指標的關注程度，又考慮了每項指標本始數據之間的相關性，這使整體評價效果更加正當和科學[33]。該試驗利用層次分析法對貫葉連翹不定根抗氧化綜合能力進行評價，得到正丁醇、甲醇、乙醇提取物的綜合評分，分別為1.469、1.360和0.975，表明乙醇提取物的抗氧化綜合能力最強，因此，貫葉連翹不定根用于抗氧化相關產品生產時，建議以乙醇作為溶劑進行提取。通過該研究可知，層次分析法是可用于對抗氧化能力的多種指標權重進行綜合評價的一種理想途徑，對于促進抗氧化相關產品的研發(fā)與應用發(fā)展具有實質性的重要意義。