分子對接、CRISPR/Cas9 技術(shù)篩選并驗證DNA ligase IV 抑制劑

肖紅衛(wèi)

（動物胚胎工程與分子育種湖北重點實驗室/湖北省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，武漢 430064）

分子對接技術(shù)可以有效地分析“蛋白-配體”的互作難題，正成為藥物重新定位的有利工具。而作為新近發(fā)展的基因工程技術(shù)，CRISPR/Cas9 作為功能基因組學方法可以克服藥物開發(fā)的限制。如何聯(lián)合使用這兩個技術(shù)進行藥物篩選還尚未見報道。

基因編輯技術(shù)可以很方便地在DNA 鏈上產(chǎn)生DSB，并利用DNA 修復中的NHEJ 機制，在靶基因座位上產(chǎn)生突變；或者利用DNA 修復中的HDR 機制，把目的基因定點插入靶基因座位。該技術(shù)克服了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的整合隨機、遺傳不穩(wěn)定等缺陷，具有很大的應用前景。尤其是在利用DNA 修復中的HDR 機制把目的基因定點插入靶基因座位的研究上，比如乳腺特異表達基因區(qū)、輸卵管特異表達基因區(qū)或者血液白蛋白基因區(qū)，使畜牧業(yè)產(chǎn)生高附加值的蛋白［1］。由于在DNA 修復中NHEJ 與HDR的競爭，導致HDR 效率比較低，科學家們競相篩選各種小分子化合物以期能夠抑制NHEJ 通路依賴的DNA連接酶IV 活性，從而提高DNA 修復通路中的HDR效率［1］。

本研究通過用MSTN基因T11 位點序列截斷的Firefly Luciferase 熒光素酶報告載體結(jié)合CRISPR/Cas9-gRNA-T11 載體共轉(zhuǎn)細胞，并根據(jù)分子對接的結(jié)果篩選與SCR7 作用類似的小分子化合物，接著檢測各個孔中Firefly Luciferase的量，沒有用小分子化合物處理時，螢火蟲熒光素酶被截斷的位置發(fā)生NHEJ 修復，不能得到大量有活性的螢火蟲熒光素酶；經(jīng)過小分子化合物處理，抑制了細胞內(nèi)的NHEJ，提高了HDR 效率，能得到大量有活性的螢火蟲熒光素酶。以期篩選到DNA ligase IV的抑制劑，為下一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

如圖1 所示，設計3 個試驗。

試驗1：在螢火蟲熒光素酶基因（Firefly Luciferase）中插入終止信號以及克隆自MSTN基因上可以被gRNA 識別的序列（以下命名為T11 位點）以截斷螢火蟲熒光素酶基因。用該載體在細胞上進行轉(zhuǎn)染試驗并對熒光素酶進行檢測，此時，應該檢測不到螢火蟲熒光素酶。

試驗2：把上述構(gòu)建的熒光素酶報告載體與CRISPR/Cas9-T11 gRNA 載體進行混合轉(zhuǎn)染，T11 gRNA 引導Cas9 蛋白切割螢火蟲熒光素酶報告載體中截斷螢火蟲熒光素酶基因的終止信號后的T11 序列以產(chǎn)生DNA 斷裂，并利用細胞自身的DNA ligase IV 對CRISPR/Cas9 引入的DNA 斷裂進行修復。再對熒光素酶進行檢測，此時檢測到的螢火蟲熒光素酶的量與正常狀態(tài)下的DNA 修復關(guān)聯(lián)，反映了單位時間內(nèi)NHEJ依賴的DNA ligase IV的活力。

試驗3：螢火蟲熒光素酶報告載體與CRISPR/Cas9-T11 gRNA 載體進行混合轉(zhuǎn)染后，在細胞培養(yǎng)基中添加篩選出來的小分子化合物，再對熒光素酶進行檢測，此時檢測到的螢火蟲熒光素酶的量與受抑制條件下的DNA 修復關(guān)聯(lián)，反映了單位時間內(nèi)受抑制條件下NHEJ依賴的DNA ligase IV的活力。

通過3 個試驗，驗證所篩選出的小分子對DNA連接酶IV的抑制作用。

1.2 Firefly Luciferase 報告載體的設計

試驗中所用的載體來自Akhtar Ali 博士，得到畢延震的授權(quán)使用。根據(jù)北京唯尚立德生物科技有限公司VK002SSA 活性報道質(zhì)粒構(gòu)建試劑盒說明書，在螢火蟲熒光素酶的中間插入終止序列以及MSTN基因中的能被gRNA（GGCUGUGUAAUGCAUGUA UG）識別的位點序列（GGCTGTGTAATGCATGTATGTGG，本研究團隊內(nèi)部命名為T11 位點）。如圖2所示。

1.3 CRISPR/Cas9 載體設計

pX330-hSpCas9 載體購自Addgene，將圖2 中的MSTN T11 gRNA克隆進pX330-hSpCas9 載 體U6 啟動子后面。

1.4 抑制劑的虛擬篩選

在本研究中，結(jié)合了基于對接的虛擬篩選方法，從前期建立的數(shù)據(jù)庫中篩選DNA ligase IV 小分子抑制劑。已知SCR7 對DNA ligase IV 有抑制作用，因此在本研究中僅需尋找類似SCR7的能夠與DNA ligase IV 結(jié)合的小分子化合物。篩選小分子化合物的策略如圖3 所示。

圖3 基于虛擬篩選策略

采用ACD ChemSketch 軟件建一個小分子化合物庫，用Accelrys Discovery Studio 2.5 軟件進行虛擬篩選各個小分子與DNA ligase IV的互作，并從中找出與SCR7 作用類似的小分子化合物，結(jié)合實驗室保存的各個小分子化合物，優(yōu)選出SCR7、nocodazole、Fisetin 和Methylene blue 4 種小分子化合物進一步試驗驗證。虛擬篩選結(jié)果如圖4 所示。

圖4 抑制劑的虛擬篩選結(jié)果

1.5 細胞培養(yǎng)

HEK-293 細胞接種于96 孔板（2×104個/孔），每孔用DMEM+10% FBS 培養(yǎng)基500 μL，在5% CO2和95%空氣、100%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞培養(yǎng)至70%的匯合度時，用Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑將螢火蟲熒光素酶報告載體質(zhì)粒、CRISPR/Cas9-T11 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入HEK-293 細胞。轉(zhuǎn)染6 h 后再加入小分子化合物（終濃度為10 μmol/L［2］）處理24 h。

1.6 螢火蟲熒光素酶檢測

移去培養(yǎng)基上清，加入1×DPBS 清洗培養(yǎng)細胞，反復洗2 次，去掉清洗液，加入裂解液，將培養(yǎng)板在室溫下輕緩晃動15 min 后把裂解液轉(zhuǎn)移到檢測離心管中。

取各個樣品20 μL 加入到1.5 mL 離心管中，剩余樣品保存到4 ℃?zhèn)溆谩Ｔ跇悠分屑尤?0 μL LARⅡ溶液，在Promega Modulus?單管型多功能檢測儀上檢測Firefly Luciferase。試驗重復3 次。

2 結(jié)果與分析

在本試驗中，參考Li 等［2］所用的SCR7 工作濃度，取試驗濃度的下限值，避免細胞周期的影響。雙熒光素酶檢測結(jié)果如圖5 所示。

圖5 篩選出的小分子化合物驗證結(jié)果

圖5 用SSA-Luc 載體和CRISPR/Cas9 載體混轉(zhuǎn)后，不加SCR7 處理后的檢測結(jié)果是116.7，添加SCR7 處理后的檢測結(jié)果是318。用1562 載體和CRISPR/Cas9 載體混轉(zhuǎn)后，不加SCR7 處理后的檢測結(jié)果是10 120，添加SCR7 處理后的檢測結(jié)果是41 905.3，添加SCR7 后可以提高DNA 修復中的HDR效率3.14 倍。用1562 載體和CRISPR/Cas9 載體混轉(zhuǎn)后，依次使用nocodazol、Methylene blue和Fisetin處理后的檢測結(jié)果分別是65 256.3、53 713和77 058.3。

結(jié)果顯示，添加小分子化合物SCR7、nocodazole、Fisetin 和Methylene blue 處理后，用Promega Modulus?單管型多功能檢測儀分別檢測螢火蟲熒光素酶的量，螢火蟲熒光素酶的表達量均得到了提高，熒光素酶的量直觀地反映了這類小分子化合物對DNA ligase IV的抑制作用，沒有小分子化合物參與的情況下，熒光素酶的量接近于本底，結(jié)果證明經(jīng)過小分子化合物處理后基因編輯的效率提高了，驗證了本試驗設計的的成功。

3 討論

CRISPR/Cas9 產(chǎn)生的DSB 被Ku70/Ku80 異二聚體識別后，該異二聚體結(jié)合在DSB兩側(cè)的DNA 末端，并活化DNA 依賴性蛋白激酶（DNA-PK）的催化亞基。DNA-PKcs 與Ku70 和Ku80 以及DNA 連接酶IV/XRCC4 復合物一起完成對DSB的修復［3，4］。作為NHEJ競爭通路的HDR 在細胞內(nèi)的效率很低（＜5%），大部分DSB 都由NHEJ 修復完成，因此，科學家們大都從DNA ligase IV 著手，從DNA ligase IV 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物著手，利用siRNA 技術(shù)降低DNA ligase IV的表達量；或者從DNA ligase IV 蛋白著手，利用抑制劑或者靶向降解藥物降低DNA ligase IV的活性或者細胞內(nèi)DNA ligase IV的量，以期降低NHEJ 效率的同時提高HDR 效率。

Song 等［5］發(fā)現(xiàn)，NHEJ 抑制劑SCR7 可以提高2.3%的基因編輯效果。Srivastava 等［6］發(fā)現(xiàn)SCR7 可以抑制DSB 在無細胞修復系統(tǒng)中的連接。Maruyama 等［7］研究發(fā)現(xiàn)，SCR7的處理提高了HDR介導的基因組編輯效率，在對多個基因進行檢測時，使用SCR7 處理最高可以提高基因編輯效率達19倍，并發(fā)現(xiàn)SCR7 處理適用于具有足夠保守的NHEJ和HDR 機制的非哺乳動物細胞。Vartak 等［8］也發(fā)現(xiàn)，SCR7 通過抑制NHEJ 顯著提高了精確基因組編輯的效率，并且在體外和體內(nèi)均有利于無錯誤的同源重組途徑。Chu 等［9］使用了抑制劑SCR7 將HDR的效率提高了4～5 倍。Ma 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，與NHEJ途徑相比，CRISPR/Cas9 介導的HDR 指導的精確遺傳修飾效率相對較低，通過添加SCR7 來抑制DNA ligase IV 從而抑制NHEJ，可以增加HDR 介導的精確遺傳修飾效率。Hu 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，在使用ssODNs作為模板時，與沒有SCR7 處理的細胞相比，SCR7 處理使轉(zhuǎn)染細胞中的靶向插入效率提高了3 倍。而Lin 等［12］研究發(fā)現(xiàn)，將抑制劑SCR7 引入CRISPR/Cas9 系統(tǒng)促進了HSV-1 基因組中HDR 介導的基因置 換。Li 等［2］研究發(fā)現(xiàn)，小分子化合物SCR7、L755507 和白藜蘆醇可使豬胎兒成纖維細胞的HDR效率提高2～3 倍。當用同源模板DNA 和CRISPR/Cas9 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染并用小分子處理時，具有大DNA 片段整合的敲入豬胎兒成纖維細胞系的比率可以達到篩選細胞集落的50%以上，而用DMSO 處理的細胞組中敲入率為26.1%。經(jīng)過對接試驗發(fā)現(xiàn)，在DNA ligase IV 上存在可以結(jié)合DNA 以及SCR7 分子的結(jié)構(gòu)域，并推測可以利用該結(jié)構(gòu)域通過虛擬對接技術(shù)來篩選DNA ligase IV的抑制劑，篩選出來的小分子化合物可以用于提高基因編輯效率的試驗驗證。

根據(jù)Li 等［2］所用的小分子化合物與DNA ligase IV 結(jié)合的區(qū)域進行篩選，把虛擬篩選結(jié)果結(jié)合自建小分子化合物庫篩選出來nocodazole、Fisetin、Methylene blue 等3 個SCR7 功能類似物。經(jīng)過驗證，這3個小分子化合物均可以實現(xiàn)抑制DNA ligase IV 活性的功能，為下一步研究奠定基礎(chǔ)。